供转导PDGF-A基因的高滴度逆转录病毒的制备

目的制备高滴度供转导血小板衍生生长因子Ａ链（ＰＤＧＦ－Ａ）基因的重组逆转录病毒,为体内、外深入研究该基因表达产物自分泌和旁分泌的生物学功能奠定基础。方法将人ＰＤＧＦ－ＡｃＤＮＡ片段插入含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子序列的逆转录病毒ＧＩＮａ载体的多克隆位点中,将构建的重组质粒导入病毒包装细胞ＰＡ３１７中,经Ｇ４１８筛选并扩增,以病毒液感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,测病毒滴度,选择出抗性克隆,进行免疫组织化学检测,表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析和３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测生物学活性。结果病毒滴度最高为１．４×１０５ＣＦＵ／ｍｌ;免疫荧光染色法和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实ＰＤＧＦ－ＡＡ的表达;抗性细胞条件培养基的细胞活性高达５１．２Ｕ／（１０６·ｄ）。结论供转导ＰＤＧＦ－Ａ基因的高滴度逆转录病毒得以制备,该基因获得有效表达,表达产物具有明显的致丝裂活性。     

含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的假型逆转录病毒的构建及包装

研究将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因应用于基因治疗。构建，包装含ＣＤ基因的假型逆转录病毒。构建含ＣＤ基因的逆转录病毒重组表达载体ＰＬＣＤＳＮ基础上，以重组表达载体ＰＬＣＤＳＮ转染包装细胞ＰＡ３１７，ＰＬＣＤＳＮ整合人ＰＡ３１７染色 。结果：ＣＤ基因获得表达且包装出具有感染能力的假型逆转录病毒。以该假型逆转录病毒染ＮＩＨ／３Ｔ３细胞，逆转录病毒重组表达载体ＰＬＣＤＳＮ整合入ＮＩＨ／３Ｔ３细胞染色体     

反义N-ras-1基因对成纤维细胞生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的应用反义Ｎ－ｒａｓ１基因阻断成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）的促增殖作用，为防治以血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖为主要特征的血管损伤后再狭窄等心血管疾病提供进一步探索的途径。方法利用构建的含反义Ｎ－ｒａｓ１基因的逆转录病毒质粒（ｆｐＧｖ１－ＭＴ－ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＮ－ｒａｓ１）转染于培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ），ｆｐＧｖ１－ＭＴ逆转录病毒空载质粒及未转染质粒的细胞为对照，观察其对ｂＦＧＦ诱导的ＶＳＭＣ的影响。结果反义Ｎ－ｒａｓ１细胞数为（１６．８±１．３）×１０４（细胞／ｍｌ），空载质粒对照细胞为（３０．１±１．２）×１０４，两者差异有显著意义（Ｐ＜０．００１）；反义Ｎ－ｒａｓ１细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入率为７６４３±６７２（ｃｐｍ），空载质粒对照细胞为１５１３１±１３８（ｃｐｍ），两者差异有非常显著意义（Ｐ＜０．００１），同时应用反义Ｎ－ｒａｓ１基因的细胞ＲａｓｍＲＮＡ表达水平明显降低，其表达蛋白ｐ２１也明显降低。结论反义Ｎ－ｒａｓ１基因对ＶＳＭＣ及ｂＦＧＦ诱导ＶＳＭＣ增殖有抑制作用。     

H—2K^b cDNA的克隆及其在多种真核细胞中的表达

目的 克隆Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ及研究其在多种真核细胞中的表达。 方法 ＲＴ－ＰＣＲ法扩增Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ,克隆入双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ,ＰＡ３１７包装出重组病毒后,分别感染ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ７及ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ分析目的基因表达,ＦＡＣＳ分析Ｈ－２Ｋ＾ｂ在细胞膜上的表达。结果 以双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ介导,分别建立了Ｈ－２Ｋ＾ｂ基因转导细胞：ＮＩＨ３Ｔ     

反义基因转移表达及抗乙型肝炎病毒的作用

目的观察重组逆转录病毒载体－包装细胞系统介导反义基因转移表达和抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用。方法将ＨＢＶａｙｗ１４０２－２９０６片段和２８３９－１９８６片段反向插入重组逆转录病毒载体质粒，分别转染ＰＡ３１７包装细胞，分别感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞和２．２．１５细胞。结果转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。ＨＢＶ反义基因重组逆转录病毒感染２．２．１５细胞后第３天，表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）表达量减少，感染后第５天，ＨＢＶ抗原表达抑制率达高峰。ｐｒｅＳ／Ｓ片段反义基因转移后，ＨＢｓＡｇ表达抑制率为７１％，ＨＢｅＡｇ抑制率为２３％；ｐｒｅＣ／Ｃ片段反义基因转移后，ＨＢ－ｓＡｇ表达抑制率为２３％，ＨＢｅＡｇ抑制率为５９％。结论逆转录病毒载体－包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞内转移和表达，并对ＨＢＶ复制和表达均有抑制作用。     

HSV-TK基因逆转录病毒重组体的构建和鉴定

利用逆转录病毒载体ｐＬＮＳＸ构建了带ＨＳＶＴＫ基因的逆转录病毒重组体ｐＬＮＳＴＫ，用磷酸钙沉淀法转染ＰＡ３１７包装细胞，经Ｇ４１８筛选抗性克隆，建立了产生重组病毒的载体产生细胞系ＰＡ３１７／ＴＫ，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒（ＣＦＵ）滴度为３×１０８Ｌ－１。提取ＰＡ３１７／ＴＫ细胞的ＤＮＡ和细胞上清液的ＲＮＡ，在特异性引物引导下，分别用ＰＣＲ和ＲＴＰＣＲ检测证实ＰＡ３１７／ＴＫ细胞整合了ＨＳＶＴＫ基因并产生重组病毒，为ＨＳＶＴＫ基因治疗恶性肿瘤的实验研究打下了基础。     

丙肝病毒非结构蛋白基因3的克隆及其体外诱导表达

目的：研究丙型病毒非结构蛋白基因３（ｎｓ３基因）在体外真核细胞中的诱导表达。方法：以ＰＣＲ方法从含ＨＣＶｎｓ３基因的重组载体ｐＢｎｓ３中扩增出ｎｓ３基因，并将其插入到克隆载体ｐＧＥＭ－Ｔ中，再与表达载体ｐＭＳＧ重组，以利到重组表达载体ｐＭＳＧ－ｎｓ３。然后采用磷酸钙沉淀法将其转染哺乳动物ＣＨＯ细胞，经地塞米松（ＤＭ）诱导，采用ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ技术检测ＮＳ３蛋白的表达水平。结果：     

小鼠GM—CSF cDNA重组逆转录病毒的构建及在成纤维细胞中的表达

为探索粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因治疗的可能性，将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组于缺陷型逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，重组质粒转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，经Ｇ４１８筛选，用其抗性克隆培养上清液感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３筛选出抗Ｇ４１８的转化细胞克隆，用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明转化细胞的基因中整合有ＮｅｏＲ基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因，原位杂交显示转化细胞有较强的ＧＭ－ＣＳＦｍ     

移植沉默ＴＳＧ－６基因的骨髓间充质干细胞对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响

摘要：【目的】在大鼠肝脏缺血再灌注模型中,观察移植沉默ＴＳＧ－６基因的骨髓间充质干细胞（ＢＭＳＣ）对大鼠肝脏缺血再灌注损伤（ＨＩＲＩ）的影响。【方法】全骨髓培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞学鉴定,慢病毒载体（ＬＶ３－ｓｈＴＳＧ－６）感染下调ＴＳＧ－６基因的表达;６０只ＳＤ雌性大鼠７０％肝脏缺血再灌注损伤模型的建立,随机分４组,ＰＢＳ组、ＢＭＳＣ组,ｓｈＲＮＡ－ＮＣ－ＢＭＳＣ组、ＴＳＧ－６－ｓｈＲＮＡ－ＢＭＳＣ组;各组大鼠分别于恢复灌注后３、６、２４ｈ取血检测血清中ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６含量,恢复灌注后６ｈ取中叶肝脏组织,ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测ＴＳＧ－６蛋白表达,切片ＨＥ染色后光镜观察肝组织显微结构。【结果】体外分离培养的ＢＭＳＣ状态稳定,增殖能力强,表达ＣＤ２９及ＣＤ４４,不表达ＣＤ３４及ＣＤ４５,慢病毒感染下调ＢＭＳＣ的ＴＳＧ－６基因表达效率达７３．９９％;大鼠肝脏７０％缺血再灌注损伤模型稳定,各时间点ＴＳＧ－６－ｓｈＲＮＡ－ＢＭＳＣ组的ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６含量均高于ＢＭＳＣ组和ｓｈＲＮＡ－ＮＣ－ＢＭＳＣ组（Ｐ＜０．０５）;ＢＭＳＣ组和ｓｈＲＮＡ－ＮＣ－ＢＭＳＣ组的ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６含量均低于ＰＢＳ组（Ｐ＜０．０５）;ＴＳＧ－６－ｓｈＲＮＡ－ＢＭＳＣ组的肝脏ＴＳＧ－６蛋白表达低于ＢＭＳＣ组和ｓｈＲＮＡ－ＮＣ－ＢＭＳＣ组（Ｐ＜０．０５）,ＰＢＳ组未见ＴＳＧ－６蛋白表达;ＴＳＧ－６－ｓｈＲＮＡ－ＢＭＳＣ组的肝组织损伤较ＢＭＳＣ组和ｓｈＲＮＡ－ＮＣ－ＢＭＳＣ组重,与ＰＢＳ组无明显区别,ＢＭＳＣ组和ｓｈＲＮＡ－ＮＣ－ＢＭＳＣ组的肝组织损伤较ＰＢＳ组明显减轻。【结论】移植ＢＭＳＣ能改善肝缺血再灌注损伤,移植沉默ＴＳＧ－６基因的骨髓间充质干细胞削弱了其对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。     

小鼠GM─CSFcDNA重组逆转录病毒的构建及在成纤维细胞中的表达

为探索粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因治疗的可能性，将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组于缺陷型逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，重组质粒转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，经Ｇ４１８筛选，用其抗性克隆培养上清液感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３，筛选出抗Ｇ４１８的转化细胞克隆，用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明转化细胞的基因组中整合有ＮｅｏＲ基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因，原位杂交显示转化细胞有较强的ＧＭ－ＣＳＦｍＲＮＡ表达，用骨髓细胞增殖法和ＣＦＵ－ＧＭ检测也表明转化细胞分泌有较多的ＧＭ－ＣＳＦ，该研究为下一步在动物体内进行ＧＭ－ＣＳＦ基因治疗的研究奠定基础     

重组人白介素10对离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 观察重组人白介素１０（ｒｈＩＬ－１０）对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖的影响。方法 离体培养大鼠胸主动脉 ＶＳＭＣ并分别接受不同浓度ｒｈＩＬ－１０、肿瘤坏死因子（ＴＮＦ－α）、血小板源性生长因子（ＰＤＧＦ－ＢＢ）的刺激,采用ＭＴＳ／ＰＥＳ 法确定ＶＳＭＣ的增殖状态并与对照组比较。结果　与对照组相比,ＴＮＦ－α和ＰＤＧＦ－ＢＢ均对ＶＳＭＣ增殖具有明显的刺 激作用（Ｐ＜０．０５）。单独应用ｒｈＩＬ－１０对血管平滑肌细胞生长没有影响。在ＴＮＦ－α和ＰＤＧＦ－ＢＢ分别刺激下,ｒｈＩＬ－１０均可 抑制ＶＳＭＣ的生长（Ｐ<０．０５）。结论　ｒｈＩＬ－１０可抑制细胞因子和生长因子诱导的ＶＳＭＣ增殖。     

大鼠肝氨甲酰磷酸合成酶I基因在非肝细胞中的表达

氨甲酰磷酸合成酶Ｉ（ＣＰＳＩ）ｃＤＮＡ全序列基因片段与ｐＳＶ２载体的重组及重组质粒ｐＳＶ２－ＣＰＳｃｆ在７４０２人肝癌细胞、ＣＨＯ细胞和ＮＩＨ／３Ｔ３细胞中的表达结果表明，ｐＳＶ２－ＣＰＳｃｆ转染的以上３株细胞均可稳定、高效地表达ＣＰＳＩ。通过核Ｒｕｎ－ｏｆｆ转录活性的检测和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证实，表达的ＣＰＳＩ转录产物结构完整。提示ＣＰＳＩ肝组织特异表达主要与转录改变有关。     

人白细胞介素2,β干扰素基因逆转录病毒载体的构建和在人…

从ｐｃＤ－５．１质粒和ｐＳＰＧＮＨＩＦＮＢ１０质粒分别切下人白细胞介素２（ＨｕＩＬ－２）ｃＤＮＡ和人β干扰素（ＨｕＩＦＮ－β）ｃＤＮＡ，分别克隆到ｐＮＭＳＭ逆转录病毒载体多克隆位点，经酶切鉴定确定正确插入方向。经ＰＡ３１７包装细胞包装成重组病毒，测转染效率。用ＮＩＨ／３Ｔ３细胞测重组病毒感染效率。在８μｇ／ｍｌ鱼精蛋白存在的条件下分别感染人新鲜肾透明细胞癌体外建株细胞以及人肾细胞癌肿瘤浸润性淋巴细     

用双拷贝逆转录病毒载体转导入G—CSFcDNA的实验研究

为克服逆转录病毒中内部启动子对插入外源基因表达的干扰，将人Ｇ－ＣＳＦ（粒细胞集落刺激因子）ｃＤＮＡ插入双拷贝载体Ｎ２Ａ的３＇ＬＴＲＵ３区上的多克隆立点，酶切鉴定后将重组质粒用电击转导法转入Ｐｓｉ－２嗜单性包装细胞系，经Ｇ－４１８选择压力，两周后挑出阳性克隆，测定感染滴度后转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，选择挑出抗性克隆，测定Ｇ－ＣＳＦ表达量，最高达５３．３Ｕ／１０＾６细胞。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅ     

HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达

通过ＤＮＡ重组技术,将ＨＳＶ１ ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ,以磷酸钙法转染ψ２,ＰＡ３１７包装细胞后,经Ｇ４１８筛选,抗性克隆细胞上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３,细胞系测定平均滴度为６．２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ,最高可达１．５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。     

血小板生长因子对肌醇磷酸代谢的影响

血小板生长因子（ＰＤＧＦ）能明显地影响细胞肌醇磷酸代谢，在亲代ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞（简称ＮＩＨ３Ｔ３细胞）和多瘤病毒ｍｉｄｄｌｅＴ抗原转化的ＮＩＨ３Ｔ３成纤维（简称ＭＴ３细胞）中，表现出不同的应答。在ＮＩＨ３Ｔ３细胞中，ＰＤＧＦ刺激１ｍｉｎ时，表现为肌醇－１、４、５－三磷酸［Ｉｎｏｓｉｔｏｌ１，４，５－Ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３］明显地增加并达到峰值，持续时间的３￣４ｍ     

人白细胞介素2、β干扰素基因逆转录病毒载体的构建和在人肾细胞癌及其TIL中的表达

从ｐｃＤ－５．１质粒和ｐＳＰＧＮＨＩＦＮＢ１０质粒分别切下人白细胞介素２（ＨｕＩＬ－２）ｃＤＮＡ和人β干扰素（ＨｕＩＦＮ－β）ｃＤＮＡ，分别克隆到ｐＮＭＳＭ逆转录病毒载体多克隆位点，经酶切鉴定确定正确插入方向。经ＰＡ３１７包装细胞包装成重组病毒，测转染效率。用ＮＩＨ／３Ｔ３细胞测重组病毒感染效率。在８μｇ／ｍｌ鱼精蛋白存在的条件下分别感染人新鲜肾透明细胞癌体外建株细胞以及人肾细胞癌肿瘤浸润性淋巴细胞（ＴＩＬ）。经Ｇ４１８选择阳性克隆后测上清表达ＨｕＩＬ－２及ＨｕＩＦＮ－β活性。结果ＨｕＩＬ－２和ＨｕＩＦＮ分别在转ＨｕＩＬ－２基因和ＨｕＩＦＮ－β基因肾细胞癌细胞的表达量达２５０Ｕ／１０６细胞·ｄ－１和６４００Ｕ／１０６细胞·ｄ－１，在经目的基因转染ＴＩＬ细胞中的表达量分别比未经目的基因转染的ＴＩＬ高２～３倍和４～８倍。ＴＩＬ生长状况未有明显改变，抗肿瘤活性未见明显增强。     

在大肠杆菌中融合高效表达人MCP—1

目的：利用含强启动子的融合表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ对编码人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的基因进行高效表达。方法：基因重组技术及蛋白纯化技术。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示表达产物占菌体蛋白的５０％。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ检测表明,表达产物可与抗ＭＣＰ－１抗体特异反应。     

抗P^185McAb的制备,鉴定及其在免疫组化检测的应用

本文以ＨＥＲ－２／ｎｅｕ癌基因表达产物为抗原免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，采用常规淋巴细胞杂交瘤技术立一株稳定分泌抗Ｐ＾１８５ＭｃＡｂ的杂交瘤株５Ｅ１２，ＭｃＡｂ５Ｅ１２属ＩｇＧ亚类，与ＳＫＢＲ－３，Ｔ４７Ｄ乳癌细胞系呈阳性反应，与ＨＴ２９，ＥＣ１０９，ＤＡＣ－１，ＳＰ２／０，成纤维细胞及小鼠ＮＩＨ３Ｔ３等细胞系列呈阴性反应，３０例乳癌组织石蜡切片同时以自制抗Ｐ＾１８５ＭｃＡｂ５Ｅ１２及进口ＭｃＡｂＣ－ｅ     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ