表达HPV-16 E6基因siRNA真核载体的构建及体外转染效率鉴定

目的：采用RNA干扰技术选择性的沉默宫颈癌CaSki细胞株中HPV-16E6基因的表达。为观察HPV-16E6基因的小干扰片段能否在CaSki细胞特异性的抑制E6基因的表达,构建能在哺乳动物细胞中表达E6小干扰RNA的真核表达质粒,并观察其转染效率。方法：根据HPV-16E6基因序列,设计特异性的小干扰片段,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1上,将其转染至CaSki细胞中,观察荧光表达,鉴定其转染效率：结果：通过酶切鉴定和序列测定,成功的构建二条表达小干扰RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功的转染到CaSki细胞株中,转染效率达到50％以上：结论：siRNA真核表达载体的构建及体外转染的成功为下一步研究奠定了良好的基础：     

RNA干扰技术抑制HPV16 E6基因表达对宫颈癌细胞株CaSki增殖的影响

目的观察HPV16 E6小干扰RNA(siRNA)能否抑制宫颈癌细胞生长,并探讨其作用机理。方法化学合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,应用细胞计数的方法测定细胞生长曲线、活细胞率及细胞生长抑制率。运用实时荧光定量RT-PCR、流式细胞术检测转染后不同时间点细胞周期、HPV16 E6、p53、p21 mRNA及蛋白表达的变化。结果转染HPV16 E6 siRNA后,细胞生长明显受到抑制。流式细胞术结果显示并未将细胞阻滞在G1期。实时荧光定量RT-PCR显示,转染24h,E6 mRNA的表达比空白组降低了20.11倍(P<0.05),而p53、p21 mRNA的表达无明显变化。转染48h,E6蛋白表达明显下调,Pp53、P21蛋白表达相应地升高。结论HPV16 E6 siRNA可通过特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复P53蛋白的功能活性而发挥抑制宫颈癌细胞生长的作用。     

载体介导的RNAi技术抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达

目的 探讨HPV16E7特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体对宫颈癌CaSki细胞E7基因的抑制作用.方法 构建HPV16 E7特异性siRNA表达载体,利用脂质体转染CaSki细胞,以荧光定量RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白表达的影响.结果 3种表达载体P1、P2、P3均能抑制CaSki细胞E7基因mRNA和蛋白的表达,其中载体P1抑制作用最强,在转染后3周,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分别为92.86%和81.0%.结论 HPV16E7 siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达.     

人白介素24基因诱导人宫颈癌Ca Ski细胞凋亡的实验研究

目的:研究人白介素24(hIL-24)在体外诱导宫颈癌Ca Ski细胞凋亡及其作用机制.方法:①以脂质体包裹重组真核表达质粒pcDNA3.1( )-hIL-24转染Ca Ski细胞; ②利用RT-PCR技术检测处理后Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平变化; ③ Western Blot分析处理后Ca Ski细胞中抑癌蛋白P53水平的变化; ④流式细胞仪分析处理后的Ca Ski细胞凋亡情况.结果:处理后Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平下降,抑癌蛋白P53水平增加,细胞凋亡率升高.结论:真核表达载体介导的hIL-24基因体外转染宫颈癌Ca Ski细胞后,能抑制Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的表达,使抑癌蛋白P53恢复活性,促使宫颈癌Ca Ski细胞凋亡.     

HPV16E6对不同p53基因型宫颈癌细胞 凋亡及化疗敏感性的影响

目的：探讨HPV16E6对不同p53基因型的宫颈癌细胞化疗药物敏感性的影响。方法：应用AO/EB染色结合荧光显微镜技术及Annexine V-FITC/PI双标法流式细胞仪检测不同浓度DDP干预前后宫颈癌细胞凋亡情况;Western印迹检测DDP干预后对HPV16E6和p53mt蛋白表达的影响;通过差异RT-PCR检测不同浓度DDP干预C33A,C33A-E6,C33A-P和CaSki 4组细胞24和48 h后HPV16E6基因mRNA表达的变化。结果：AO/EB染色和流式细胞术检测的C33A,C33A-E6,C33A-P,CaSki细胞随着DDP干预剂量的增大,凋亡率亦明显增加(P＜0.05)。Western印迹结果示C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6蛋白的表达随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长而逐渐降低甚至难以检测到表达(P＜0.01),而未干预的对照组C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6的表达量稍有增加。C33A-E6,C33A和C33A-P 3组细胞中均检测到p53mt的表达,但随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长,3组细胞总蛋白中p53mt的表达量均无明显改变(P＞0.05)。差异RT-PCR结果表明,在未予DDP干预的情况下,C33A-E6与CaSki细胞在24 h时HPV16E6 mRNA的表达量无差异,而在48 h时则C33A-E6细胞的HPV16E6 mRNA表达量显著高于CaSki细胞(P＜0.05),且两组细胞48 h的HPV16E6 mRNA表达均较24 h显著增高(P＜0.05);在24和48 h两时间段内,随着DDP干预浓度的增加,两组细胞的HPV16E6 mRNA表达量均逐渐减少(P＜0.01);但在同样浓度的DDP干预时,C33A-E6与CaSki的HPV16E6 mRNA表达量无统计学差异(P＞0.05)。结论：HPV16E6基因对宫颈癌细胞株化疗敏感性的影响与p53的基因型(p53mt/p53wt )无明显关系,其可能通过其他作用机制对C33A细胞的凋亡和化疗敏感性产生作用。     

HPV16E6对不同p53基因型宫颈癌细胞凋亡及化疗敏感性的影响

目的：探讨HPV16E6对不同p53基因型的宫颈癌细胞化疗药物敏感性的影响。方法：应用AO/EB染色结合荧光显微镜技术及Annexine V-FITC/PI双标法流式细胞仪检测不同浓度DDP干预前后宫颈癌细胞凋亡情况;Western印迹检测DDP干预后对HPV16E6和p53mt蛋白表达的影响;通过差异RT-PCR检测不同浓度DDP干预C33A,C33A-E6,C33A-P和CaSki4组细胞24和48h后HPV16E6基因mRNA表达的变化。结果：AO/EB染色和流式细胞术检测的C33A,C33A-E6,C33A-P,CaSki细胞随着DDP干预剂量的增大,凋亡率亦明显增加（P〈0.05）。Western印迹结果示C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6蛋白的表达随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长而逐渐降低甚至难以检测到表达（P〈0.01）,而未干预的对照组C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6的表达量稍有增加。C33A-E6,C33A和C33A-P3组细胞中均检测到p53mt的表达,但随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长,3组细胞总蛋白中p53mt的表达量均无明显改变（P〉0.05）。差异RT-PCR结果表明,在未予DDP干预的情况下,C33A-E6与CaSki细胞在24h时HPV16E6 mRNA的表达量无差异,而在48h时则C33A-E6细胞的HPV16E6 mRNA表达量显著高于CaSki细胞（P〈0.05）,且两组细胞48h的HPV16E6 mRNA表达均较24h显著增高（P〈0.05）;在24和48h两时间段内,随着DDP干预浓度的增加,两组细胞的HPV16E6 mRNA表达量均逐渐减少（P〈0.01）;但在同样浓度的DDP干预时,C33A-E6与CaSki的HPV16E6mRNA表达量无统计学差异（P〉0.05）。结论：HPV16E6基因对宫颈癌细胞株化疗敏感性的影响与p53的基因型（p53mt/p53wt）无明显关系,其可能通过其他作用机制对C33A细胞的凋亡和化疗敏感性产生作用。     

特异性核酶对宫颈癌细胞系CaSki增殖与凋亡的影响

目的：研究特异性抗HPV 16E6核酶对宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响。方法：设计特异性切割HPV 16E6基因的核酶，构建抗HPV16E6核酶的真核表达质粒。以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSki细胞，命名为CaSki－R、CaSki－P细胞。点杂交检测核酶在细胞中的表达，Northern blotting检测CaSki、CaSki－R、CaSki－P3种细胞中E6基因的表达。测定3种细胞的生长曲线和软琼脂克隆形成率，并以皮下接种率法检测细胞在裸鼠体内的成瘤能力。流式细胞仪检测3种细胞的凋亡率，并测定c-myc、bcl-2、p53、fas、PCNA、C－erbB-2等基因的表达。结果：点杂交证实该核酶能在CaSki－R细胞中稳定表达，Northern blotting证实CaSki－R中表达E6较CaSki－P、CaSki明显降低，出现凋亡峰，S期、GWMS期细百分率下降；而CaSki－P细胞无此改变。CaSki－R细胞表达HPV16E6、C－myc、Bcl-2、PCNA、C－erbB-2蛋白明显减少，而p53表达明显增高；CaSki和CaSki－R细胞中Fas蛋白的表达相近。CaSki－P细胞中各基因的表达与CaSki细胞无显著差异。结论：抗HPV16E6核酶的导入能阻碍宫颈癌细胞增殖，诱导其凋亡，其原因可能在于病毒癌基因E6表达的降低，以及由此而引起的细胞内一系列基因表达的改变。     

沉默HPV16 E6基因对人宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的 采用RNA干扰抑制人宫颈癌CaSki细胞裸鼠移植瘤中人乳头瘤病毒(human papillomavirus-16,HPV16)E6基因的表达,观察对裸鼠移植瘤的抑制作用.方法 将HPV16 E6特异性的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)真核表达载体转染到人宫颈癌细胞株CaSki细胞中,经G418筛选,RT-PCR检测E6基因的表达;将细胞接种到BALB/c裸鼠背部皮下,同时将该质粒注射到人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的裸鼠中,观察肿瘤出现时间及体积变化;观察肿瘤组织的病理改变.结果 成功筛选到持续表达E6 siRNA的CaSki细胞,经RT-PCR检测该细胞中HPV16 E6基因表达降低;裸鼠成瘤实验结果显示,处理后的CaSki细胞成瘤能力明显降低,抑瘤率为71.4%;注射质粒进行基因治疗后,裸鼠肿瘤生长受到抑制,肿瘤的体积与质量明显低于CaSki细胞组,差异具有显著性(P＜0.05).病理检查结果显示,经pGensil-CH2处理的肿瘤生长不佳,细胞分裂像少见,组织内有较多坏死区域.结论 沉默CaSki细胞中HPV16 E6基因的表达能明显降低宫癌细胞的成瘤作用.     

化学合成siRNA沉默宫颈癌SiHa细胞E6基因表达的进一步研究

目的 探讨靶向HPV16 E6基因特异性siRNA对SiHa细胞E6和E7基因表达的沉默效果,以及沉默作用对pRb、P53、Survivin和VEGF-C蛋白表达的影响.方法 化学合成靶向HPV16 E6基因的siRNA,脂质体法转染SiHa细胞.半定量RT-PCR检测siRNA对SiHa细胞E6和E7基因转录表达的影响;Western Blotting法检测pRb、P53、Survivin和VEGF-C蛋白的表达.结果 RT-PCR检测结果显示,转染siRNA后24、48和72 h组SiHa细胞E6和E7 mRNA表达水平均明显低于对照组(F=80.71、182.18,P<0.05).Western Blotting结果显示,与对照组相比,转染组pRb和P53蛋白表达明显升高(F=59.78、29.00,P<0.05),VEGF-C蛋白表达明显降低(F=7.58,P<0.05),Survivin蛋白的表达则没有发生明显变化(F=2.28,P>0.05).结论 HPV16 E6特异性siRNA能同时抑制SiHa细胞内E6和E7基因的表达,进而引起P53、pRb以及VEGF-C蛋白表达水平的改变.     

RNAi表达载体对宫颈癌HPV16 E6基因表达的抑制作用

目的研究RNA干扰(RNA interference，RNAi)表达载体对宫颈癌HPV16E6基因的抑制作用。方法构建针对HPV16E6基因的RNAi质粒表达载体，脂质体法转染宫颈癌caski细胞株，应用荧光定量PCR及流式细胞术检测其对HPV16E6mRNA及蛋白表达的影响。结果构建的三种表达载体均抑制了HPV16E6的mRNA及蛋白的表达，其中转染B号载体的caskiB细胞HPV16E6mRNA表达仅相当于空白组的21．7％，蛋白抑制率达98．1％。结论RNAi表达载体可以有效的抑制HPV16E6基因的表达。     

保妇康栓对人乳头状瘤病毒抑制作用的实验研究

目的:探讨中药制剂保妇康栓对人乳头状瘤病毒(HPV)16亚型的抑制作用。方法:以不同浓度的含保妇康栓培养基体外培养宫颈癌细胞系CaSki和宫颈永生化细胞H8,相差显微镜下观察活细胞形态学变化;采用四甲基偶氮唑蓝比色法以及流式细胞术技术检测不同浓度保妇康栓对细胞增殖的影响;应用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测人乳头状瘤病毒HPV16亚型E6E7的表达。结果:不同浓度的保妇康栓可以抑制细胞的增殖;在药物作用下,CaSki细胞G1期细胞增加(P<0.05),G2、S期细胞减少(P<0.05),CaSki细胞凋亡率高于对照组(P<0.05),而对H8细胞周期和凋亡率影响不明显;两种细胞HPV16E6E7基因片段mRNA表达均明显低于对照组(P<0.01)。结论:保妇康栓在体外抑制宫颈癌细胞系CaSki和宫颈永生化细胞H8增殖,其机制可能是通过抑制HPV16E6E7表达而抑制肿瘤细胞生长。     

人乳头瘤病毒早期癌蛋白E6/E7稳定表达细胞系的构建及其对Rab12表达的影响

目的 探究人乳头瘤病毒(HPV)编码的早期癌蛋白E6/E7对小GTP酶蛋白Rab12表达的影响。 方法 利用逆转录病毒包装系统获得含pBabe-Vector质粒和pBabe-16E7质粒的高滴度病毒颗粒,感染细胞,并用嘌呤霉素筛选获得稳定表达HPV16E7的UMSCC 10A-16E7细胞系,Western blotting检测E7相关蛋白p53和E2F1的表达变化,比较UMSCC 10A-Vector细胞系和UMSCC 10A-16E7细胞系的Rab12蛋白表达水平。用同样方法在HaCaT、RPE1细胞系中进一步验证。用siRNA干扰SiHa、Caski细胞(HPV-16阳性的宫颈癌细胞)中16E6/E7及HeLa细胞(HPV-18阳性的宫颈癌细胞)中18E6/E7的表达,通过Western blotting比较siRNA干扰前后E6和E7相关蛋白(E2F1、p53和Rab12)的表达差异。 结果 利用逆转录病毒包装系统成功构建稳定表达的细胞系,过表达E6/E7的细胞系中Rab12表达升高,干扰E6/E7的细胞系中Rab12的表达降低。 结论 HPV编码的早期癌蛋白E6/E7可调控Rab12的表达。     

实时荧光定量PCR和RT-PCR检测宫颈癌细胞株HPV-16 E6和E7基因的实验研究

目的 探讨实时荧光定量PCR和RT-PCR检测HPV-16 E6和E7基因的实验方法.方法 将制备的含HPV-16 E6和E7基因的质粒作为标准品,建立实时荧光定量PCR和RT-PCR方法,分别对3种宫颈癌细胞株进行HPV-16 E6和E7基因的DNA和RNA拷贝数的定量检测.结果 建立的实时荧光定量PCR标准曲线相关系数大于0.99,PCR效率在90%以上.HPV-16 E6和E7基因的DNA和RNA拷贝数在宫颈癌细胞株 CaSki、SiHa和HeLa中从高到低依次是CaSki＞SiHa＞HeLa.结论 用实时荧光定量PCR和RT-PCR方法研究HPV-16 E6和E7基因的DNA和RNA含量结果可靠,为进一步研究两个基因与宫颈病变的关系奠定了基础.     

不可逆性电穿孔介导HPV16 E6 shRNA干扰质粒对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响

目的:探讨利用治疗剂量脉冲电场产生不可逆电穿孔(IRE)介导HPV16 E6 shRNA干扰质粒进入细胞的可行性,阐明二者共同作用对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响及其作用机制。方法:将HPV16 E6基因特异性干扰序列插入pGenesil-1质粒,构建HPV16 E6 shRNA真核表达载体,将10个电压为800 V、脉宽100 μs、频率1 Hz的IRE作用于SiHa细胞与HPV 16 E6 shRNA干扰质粒的混悬液,根据处理因素组合,分为空白对照组、IRE处理组、pGenesil-N组、pGenesil-N+IRE组、pGenesil-E6组和pGenesil-E6+IRE组。在荧光显微镜下观察SiHa细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达,计算GFP表达效率;RT-PCR法检测HPV 16 E6 mRNA表达水平,Western blotting法检测HPV16 E6蛋白、P53及PCNA蛋白表达水平,CCK-8法检测各组SiHa细胞增殖能力的变化。结果:成功构建HPV16 E6 shRNA真核表达载体,IRE处理后24 h细胞即可见到绿色荧光;与IRE组比较,pGenesil-E6+IRE组E6 mRNA表达水平下降(P<0.05),E6蛋白表达水平降低(P<0.05),P53蛋白表达水平增高(P<0.05),PCNA表达水平下降(P<0.05);CCK-8法检测,与pGenesil-E6组比较,pGenesil-E6+IRE组细胞增殖活性下降更明显(P<0.05)。结论:治疗剂量的IRE可介导外源基因进入细胞,二者联合作用能明显抑制宫颈癌SiHa细胞增殖。