成年大鼠心肌细胞高效激光共聚焦显微镜钙成像方法

目的建立高效易行的测定心肌细胞钙成像方法。方法Langendorff灌流获取成年大鼠心室肌细胞。大鼠心肌细胞经Fluo-4染色后分别加入玻璃底的6孔培养板中,连接Ion C-Pace EP刺激器,于激光共聚焦显微镜下测定胞内钙离子浓度的动态变化。结果约80％的细胞跟随所设频率规律的收缩。激光共聚焦显微镜记录到与刺激器频率相同的有规则的细胞钙瞬变。加入咖啡因后钙释放增加,提示此为钙库的钙释放。结论利用新型的刺激装置,结合激光共聚焦显微技术,我们成功地获得了高效易行的成年大鼠心肌细胞Ca^＋成像方法。此法也可用于其他实验动物心肌细胞,易于记录细胞内钙离子浓度的动态变化。     

激光共聚焦扫描显微镜技术在大鼠皮层神经元细胞内钙离子浓度动态测定中的应用

目的探讨激光共聚焦扫描显微镜(LCSM)技术在动态测定神经元细胞内钙离子浓度中的应用。方法采用原代培养大鼠皮层神经元,用LCSM测定给KCl前后细胞内钙离子浓度的动态变化。结果培养神经元状态良好,用LCSM准确、稳定、可靠地测出细胞内钙离子浓度的动态变化。结论LCSM在动态测定神经元细胞内钙离子浓度中具有明显优势。     

浅谈激光扫描共聚焦显微镜的使用维护及保养

阐述激光扫描共聚焦显微镜的组成及工作原理,并根据使用共聚焦显微镜所积累的经验,提出激光扫描共聚焦显微镜的日常使用所遇见的问题,以及共聚焦显微镜主要部件的维护与保养方法.     

激光共焦显微镜观察真菌性角膜炎治疗效果的研究

目的 研究激光共焦显微镜对观察真菌性角膜炎治疗过程中病情转归的意义.方法 对42例(42眼)经门诊诊断为真菌性角膜炎的患眼,临床使用那他霉素眼用混悬液抗真菌治疗,治疗前及治疗后l周、1月分别行患眼的激光共焦显微镜检查,观察真菌菌丝生长情况.并根据临床反应判断治疗结果.结果 治疗后病灶处菌丝密度明显减少,甚至消失,周边炎性细胞浸润减少,基质透亮度增加,胶原纤维增生,组织呈瘢痕化增生.治疗前,激光共焦显微镜下42例中37例见菌丝分布(88.1％),抗真菌治疗l周后42例菌丝阳性为26例(61.9％),1月后患眼菌丝阳性为9例(21.4％),结果差异具有统计学意义(P＜0.05).最终治愈28例(66.7％),好转9例(21.4％),无效5例(11.9％).最终有效率达88.1％.其中无效5例中均为菌丝阳性,好转中菌丝阳性为4例,但密度较治疗前明显减少.结论 激光共焦显微镜对观察真菌性角膜炎病情的转归具有临床意义.     

激光共聚焦显微镜观察铜绿假单胞菌生物膜的形成

目的采用激光共聚焦显微镜技术观察铜绿假单胞菌形成生物膜,进一步揭示了铜绿假单胞菌生物膜形成过程。方法使用盖玻片生物膜培养法,培养铜绿假单胞菌的生物膜,在培养2、4、8、12、16、24、48和72h后取出盖玻片,用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的刀豆蛋白A(FITC-ConA)和碘化吡啶(PI)双重免疫荧光技术染色,用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察铜绿假单胞菌生物膜形成过程与特点。结果获得生物膜形成过程不同时间点的CLSM图像,观察到铜绿假单胞菌一般在24h后开始逐渐形成生物膜,在72h形成稳定的生物膜。结论双重免疫荧光染色技术和CLSM是观察细菌生物膜形成过程的有效手段。     

人胚胎神经干细胞体外培养及其增殖与分化的研究

目的 建立神经干细胞分离、培养及分化的鉴定技术，观察神经干细胞增殖、分化的特点。方法 从人胚胎海马区分离神经干细胞，采用无血清培养基，进行体外扩增培养、传代。采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和分化的神经细胞；利用流式细胞仪和细胞生长曲线检测神经干细胞的增殖能力。结果 从人胚胎脑海马区分离的细胞具有增殖和多向分化潜能，可进行传代培养，获得的细胞团中大部分为nestin表达阳性细胞。贴壁分化后可以出现NSE、GFAP表达阳性的细胞。结论 用上述方法分离培养的细胞能表达nestin蛋白，具有自我更新和增殖能力，并具有向神经元、星形胶质细胞分化的潜能，具备神经干细胞的特征，可用于细胞移植等相关研究。     

体外诱导人胚胎干细胞向神经细胞分化的研究进展

研究表明胚胎干细胞（embryonic stemcells,ES细胞）在体外可以发育分化出神经组织细胞,这对于了解神经发育的机制和研究神经组织退化性或脑组织损伤性疾病的治疗具有重要的意义。本文就胚胎干细胞分化为神经组织细胞的常用方法和机制做一综述。     

利用共焦激光角膜显微镜诊断真菌性角膜炎

<正>共焦激光角膜显微镜是一种新型、无创伤性的角膜影像学检查仪器,我院在国内率先引进了德国海德堡公司研制的HRT-Ⅱ共焦激光角膜显微镜,并对真菌性角膜炎的早期诊断作了探索,现报告如下。     

大鼠胚胎神经干细胞异体移植对脊髓损伤的修复

目的 观察胚胎神经干细胞(neural stem cells,NSCs)对成年大鼠脊髓损伤(spianl cord injury,SCI)的修复及对轴突再生的作用.方法 制作20只大鼠SCI(T7)模型,随机分为实验组和对照组.伤后2 d实验组移植经全离培养的Wistar大鼠NSCs;对照组只注入DMEM培养液.移植后第1、2、4、6周经电镜及免疫组化观察移植对脊髓轴突再生的影响.结果 实验组NSCs与宿主融合较好,损伤区可见幼稚的呈束状排列的再生轴突;对照组轴突变性未见再生轴突.结论 NSCs植入异体大鼠打击伤后的脊髓可存活,并产生髓鞘样物质促进宿主脊髓轴突再生.     

角膜共焦显微镜在真菌性角膜炎诊疗中的应用价值探讨

目的 探讨角膜共焦显微镜检查在真菌性角膜炎患者诊疗中的价值。方法 选取2016年1月至2017年1月在安徽省第二人民医院诊治的真菌性角膜炎患者21例（21只眼）,分别行角膜刮片实验室镜检和共焦显微镜检查,对比2种检查方法的检出阳性率。结果 21例（21只眼）患者中,实验室检查与共焦显微镜检查双阳性患者11例（52.38%）,单共焦显微镜阳性患者7例（33.33%）,单实验室检查阳性患者1例（4.76%）。共焦显微镜检出率为85.71%,实验室检出率为57.14%,差异有统计学意义（P=0.043）。8例（38.10%）患者药物治疗效果不佳,治疗好转13例（61.90%）。4例（19.05%）患者在症状体征阴性时,角膜共焦显微镜检查仍可见基质层菌丝残留。结论 共焦显微镜检查可提高真菌性角膜炎的诊断率,并可根据共焦显微镜实时检查结果指导用药。     

丁苯酞对神经干细胞向神经细胞分化的促进作用

目的 研究丁苯酞通过PI3K-AKT信号通路促进神经干细胞向神经细胞分化的作用。方法 分离培养SD大鼠胚胎脑皮质层的神经干细胞,采用分化专用完全培养基培养后,通过光镜下观察和Nestin蛋白免疫荧光法进行鉴定。设置对照组和实验组,其中实验组添加丁苯酞辅助分化,分为丁苯酞低剂量组（1 μmol·L^-1）、中剂量组（5 μmol·L^-1）和高剂量组（10 μmol·L^-1）,作用24 h后,CCK-8法检测神经干细胞的细胞活力,碱性磷酸酶染色法检测神经干细胞的分化能力,免疫荧光法检测神经细胞分化程度,RT-qPCR法检测转录因子SOX2、PAX6和NeuN的mRNA表达水平,Western-blot及RT-qPCR检测PI3K-AKT信号通路的表达。结果 丁苯酞干预后神经干细胞活力提高,分化能力提高,碱性磷酸酶试验呈强阳性,转录因子SOX2、PAX6和NeuN的mRNA表达水平增高,PI3K-AKT信号通路蛋白和mRNA表达水平均增高,且呈现剂量依赖性。结论 丁苯酞可以促进神经干细胞向神经细胞分化,其作用机制可能与PI3K-AKT的激活有关。     

PLGA与明胶膜支架材料对神经干细胞生长、分化影响的体外研究

目的：探讨PLGA作为中枢神经组织工程支架材料的可行性。方法：从胎龄14～16d的Wistar大鼠分离培养获得神经干细胞，以10^8/L密度种植于PLGA膜、明胶膜和PLGA／明胶膜表面，置37℃、5％CO2培养箱中共培养，观察神经干细胞在PLGA膜、明胶膜和PLGA／明胶膜表面的生长、分化和PLGA的降解情况。结果：培养获得的神经干细胞表现具有自我更新和多相分化能力，能分化为神经元和胶质细胞。在观察期内PLGA膜无降解，神经干细胞在PLGA膜表面无贴附，但可在PLGA／明胶膜和明胶膜表面贴附、生长和分化。结论：PLGA可作为中枢神经组织工程支架材料。     

Intracellular Processing of Poly(Ethylene Imine)/Ribozyme Complexes Can Be Observed in Living Cells by Using Confocal Laser Scanning Microscopy and Inhibitor Experiments

Purpose. Critical steps in the subcellular processing of poly(ethylene imine)/nucleic acid complexes, especially endosomal/lysosomal escape, were visualized by using living cell confocal laser scanning microscopy (CSLM) to obtain an insight into their mechanism. Methods. Living cell confocal microscopy was used to examine the intracellular fate of poly(ethylene imine)/ribozyme and poly(L-lysine)/ribozyme complexes over time, in the presence of and without bafilomycin A1, a selective inhibitor of endosomal/lysosomal acidification. The compartment of complex accumulation was identified by confocal microscopy with a fluorescent acidotropic dye. To confirm microscopic data, luciferase reporter gene expression was determined under similar experimental conditions. Results. Poly(ethylene imine)/ribozyme complexes accumulate in acidic vesicles, most probably lysosomes. Release of complexes occurs in a sudden event, very likely due to bursting of these organelles. After release, poly(ethylene imine) and ribozyme spread throughout the cell, during which slight differences in distribution between cytosol and nucleus are visible. No lysosomal escape was observed with poly(L-lysine)/ribozyme complexes or when poly(ethylene imine)/ribozyme complexes were applied together with bafilomycin A1. Poly(ethylene imine)/plasmid complexes exhibited a high luciferase expression, which was reduced approximately 200-fold when lysosomal acidification was suppressed with bafilomycin A1. Conclusions. Our data provide, for the first time, direct experimental evidence for the escape of poly(ethylene imine)/nucleic acid complexes from the endosomal/lysosomal compartment. CLSM, in conjunction with living cell microscopy, is a promising tool for studying the subcellular fate of polyplexes in nucleic acid/gene delivery.     

Acidic Microclimate pH Distribution in PLGA Microspheres Monitored by Confocal Laser Scanning Microscopy

PURPOSE: The acidic microclimate pH (micropH) distribution inside poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres was monitored quantitatively as a function of several formulation variables. METHODS: A ratiometric method by confocal laser scanning microscopy with Lysosensor yellow/blue dextran was adapted from those previously reported, and micropH distribution kinetics inside microspheres was examined during incubation under physiologic conditions for 4 weeks. Effects of PLGA molecular weight (MW) and lactic/glycolic acid ratio, microspheres size and preparation method, and polymer blending with poly(ethylene glycol) (PEG) were evaluated. RESULTS: micropH kinetics was accurately sensed over a broadly acidic range (2.8 < micropH < 5.8) and was more acidic and variable inside PLGA with lower MW and lactic/glycolic acid ratio. Lower micropH was found in larger microspheres of lower MW polymers, but size effects for lactic-rich polymers were insignificant during 4 weeks. Microspheres prepared by the oil-in-oil emulsion method were less acidic than those prepared by double emulsion, and blending PLGA 50/50 with 20% PEG increased micropH significantly (micropH > 5 throughout incubation). CONCLUSIONS: Coupling this method with that previously developed (SNARF-1 dextran for micropH 5.8-8.0) should provide microclimate pH mapping over the entire useful pH range (2.8-8.0) for optimization of PLGA delivery of pH-sensitive bioactive substances.     

磁标记神经干细胞移植治疗脑梗死大鼠MRI示踪及形态学研究

目的:利用磁共振成像(MRI)技术追踪移植的超顺磁性氧化铁标记神经干细胞(NSCs),无创、动态地监测NSCs在活体脑内的存活和迁移。方法:大鼠32只制备右侧大脑中动脉瘤局灶脑缺血/再灌注(MCAO)模型,BrdU标记NSCs,立体定向磁标记NSCs脑内移植,MRI下活体动态追踪脑内移植的磁标记NSCs,实验动物于磁标记NSCs脑内移植第1、5和14天达到观察时相点后,取脑组织做石蜡切片及HE染色。结果:24只大鼠出现明显的神经功能缺失症状。MRI追踪示:磁标记NSCs脑内移植1d后,针道和侧脑室部位有低信号物质存在;磁标记NSCs脑内移植5d后,低信号物质沿胼胝体腹侧迁移;磁标记NSCs脑内移植2周,右侧(病灶侧)侧脑室部位低信号物质向缺血区迁移,其前端已达到缺血区的边缘。脑组织病理学检测:BrdU阳性磁标记NSCs沿胼胝体腹侧向缺血/再灌注区迁移。随着脑内磁标记移植时间的推移,侧脑室区的NSCs向缺血/再灌注区迁移数量逐渐增加。结论:超顺磁性氧化铁颗粒和BrdU双标记的神经干细胞移植至脑梗死大鼠脑内后可迁移到病灶区;MRI成像能够在活体内连续示踪观察神经干细胞的迁移及分布情况。     

SRC-1基因在小鼠神经干细胞分化过程中的变化

目的观察类固醇受体辅助活化因子-1(SRC-1)基因在小鼠神经干细胞(NSCs)体外培养分化过程中表达的变化。方法用机械分离和酶消化法从1~3 d小鼠大脑皮质获取NSCs原代细胞,体外培养获神经球,传代并消化,经血清诱导神经球细胞分化。形态学、细胞免疫荧光实验观察神经球形态、Nestin表达鉴定NSCs;抗体分别标记神经元、星形胶质细胞,检测细胞分化d 3、9的细胞类型。RT-qPCR和免疫印迹法检测细胞分化d 0、3、9 SRC-1基因mRNA和蛋白的表达。结果新生小鼠大脑皮质获取的细胞,体外培养能扩增形成神经球,Nestin阳性表达。NSCs分化d 3主要为神经元,d 9主要为星形胶质细胞。与NSCs分化d 0相比,SRC-1表达在分化d 3明显升高,在分化d 9明显降低。 结论 成功分离并获取新生小鼠皮质NSCs。在NSCs分化中,SRC-1表达量有明显变化,分布依次为神经元>NSCs>星形胶质细胞。     

片剂薄膜包衣过程激光共聚焦成像及近红外光谱建模分析

目的 研究薄膜包衣的微观成膜过程,实现对包衣质量无损检测模型的构建。方法 采用聚乙烯吡咯烷酮为包衣材料对微晶纤维素片进行包衣,在包衣材料中加入罗丹明为示踪剂。测定包衣过程不同时间包衣增重和衣膜厚度,并通过激光共聚焦显微镜成像系统和近红外光谱技术分别测定包衣片衣膜的微观结构和宏观图谱,最后采用化学计量学的方法关联近红外图谱与衣膜质量,构建包衣过程的控制模型。结果 衣膜在片芯表面呈现非均匀分布,先分布于片芯两侧表面,后分布于片芯曲面,这种差异随包衣的进行逐渐降低,且在衣膜表面存有微小的孔隙结构。多元散色矫正预处理后的近红外光谱图形能够构建包衣质量的精确控制和预测模型。结论 激光共聚焦成像及近红外光谱技术能够分别从微观和宏观角度增进对薄膜包衣过程的理解和控制,有助于促进薄膜包衣技术的进一步开发利用。     

Formation of Multilayers in the Caco-2 Cell Culture Model: A Confocal Laser Scanning Microscopy Study

Purpose. To introduce confocal laser scanning microscopy (CLSM)combined with digital image restoration to characterise Caco-2 cellsunder different culture conditions, and thus to define additional validcriteria for the optimisation of culture models. Methods. Growth curves were established and transepithelial electricalresistance (TEER) measured for cells grown in EMEM or DMEMmedium on Cyclopore membranes. Cytoskeleton, cell nuclei and tightjunctions (TJ) were investigated by CLSM. Results. Cultures reached a plateau of 4.5 × 10⁵ cells/cm² after 10 days. At the same time TEER reached 750 cm². An irregular,fairly complete network of TJ was present at confluence (2 d).Between 15 and 30 days a regular TJ network was established. Cellsformed mixed mono- and multilayers under most conditions with twoexceptions: flat monolayers were observed on polycarbonate filterswith EMEM and with the Biocoat intestinal epithelium differentiationenvironment system. In multilayers TJ were found in the upper aswell as in the lower cell layers although the regular vertical polaritywas disturbed. Conclusions. CLSM represents an important tool to investigate thecytoarchitecture of Caco-2 cells. 3D-analysis of confocal data givesimportant clues on the characteristics of cell layers and thus helps tovalidate optimisation strategies.     

大鼠神经干细胞和雪旺细胞体外共培养生长特性

目的：探讨雪旺细胞（SC）对神经干细胞（NSC）的生物作用，为临床移植神经细胞提供依据和方法。方法：将神经干细胞分别在有雪旺细胞骨架、分泌物及活雪旺细胞饲养层的不同环境中培养，同时设立各自对照组，观察神经干细胞迁徙、贴壁能力、分化、细胞代谢、轴突生长、免疫组化神经丝染色情况。结果：与雪旺细胞有关的实验组神经干细胞大量分化为具有细长突起的细胞，神经丝（NF）标记阳性细胞多，突起长（特别是经胎牛血清培养过的雪旺细胞实验组），细胞贴壁力强，细胞生长代谢旺盛，突起粗壮并且生长速度快。结论：雪旺细胞能促进神经干细胞分化，并促进其生长。     

双向电泳分析叶酸对神经干细胞蛋白表达的影响

目的:探讨叶酸缺乏对胚胎大鼠神经干细胞(NSCs)蛋白质表达的影响。方法:采用无血清体外细胞培养方法,培养胚胎大鼠NSCs并进行鉴定,采用叶酸缺乏培养基培养NSCs,根据叶酸添加终浓度将细胞分为对照(Con?trol)组、叶酸缺乏(Folate-D)组、叶酸补充(Folate-L)组,各组叶酸终浓度分别为4、0.6、8mg/L。应用双向电泳(2-DE)技术分析各组蛋白质表达的差异。结果:建立了稳定可重复的NSCs2-DE图谱,与Control组相比,Folate-D组2个蛋白点表达量降低,4个蛋白点表达量升高;Folate-L组2个蛋白点表达量降低,1个蛋白点表达量升高。结论:叶酸缺乏或补充叶酸影响NSCs蛋白表达,差异蛋白分离为进一步研究叶酸对NSCs增殖分化调控机制奠定了基础。