基于454FLX高通量技术的厚朴叶绿体全基因组测序及应用研究

 叶绿体基因组序列在中药DNA条形码鉴定及基因工程生物制药方面具有广泛的应用前景。本文应用454高通量测序技术对厚朴进行了叶绿体全基因组测序, 建立了标准测序流程。生物信息学分析共获得有效序列重叠群 (contig) 14个, 测序覆盖度达到99.99%。厚朴叶绿体基因组大小为160 183 bp, 大 (LSC)、小 (SSC) 单拷贝区大小分别为88 210 bp和18 843 bp, 反向互补重复区 (IR) 大小为26 565 bp, 共注释叶绿体基因126个, 其中每个IR区17个。厚朴与木兰亚纲其他物种的叶绿体编码基因在种类、排列顺序及结构大小上基本一致。采用叶绿体81个蛋白编码基因对厚朴及同属5个种9个样本进行了分子鉴定, 鉴定效率100%, 并且可以成功区分不同产地的凹叶厚朴。以上结果表明, 本研究建立的标准测序流程适用于叶绿体基因组测序, 叶绿体基因组序列可有效区分厚朴及近缘物种。     

基于高通量测序454 GS FLX的丹参转录组学研究

本研究应用新一代高通量测序技术454 GS FLX Titanium对2年生丹参根的转录组进行测序, 研究其基因表达谱, 挖掘其功能基因。获得46 722表达序列标签 (express sequence tags, EST), 序列平均长度414 bp, 与Sanger测序的长度相当。所得序列与GenBank丹参EST合并拼接, 获得18 235条unigene, 其中, 454高通量测序发现了13 980条新的unigene。数据库中的序列同源性比较表明, 其中73.0% (13 308条) 与其他生物的已知基因具有不同程度的同源性。通过BLAST与Gene Ontology分析获得了可能参与丹参酮合成的序列27条 (编码15个关键酶), 参与丹酚酸合成的序列29条 (编码11个关键酶), 细胞色素P450序列70条, 转录因子序列577条。454高通量测序技术作为药用植物功能基因组研究的重要手段可在丹参功能基因的发现中发挥重要作用, 这些基因的发现为丹参酮和丹酚酸类化合物生物合成研究奠定了基础, 同时也为丹参的转录组研究提供了基础数据。     

新一代测序技术进展及其在药品质量控制中应用和发展趋势

基因测序技术的发明和广泛应用促进了医学和生命科学的革命性发展。自以Sanger测序法和化学降解法为代表的第1代测序技术发明以来,基因测序技术已发展至第4代。第1代测序平台主要为Sanger测序法和化学降解法,测序长度长,准确性高,但成本高,通量低和耗时长;第2代测序平台主要有454/GS-FLX测序平台、SOLID测序平台、Solexa测序平台和HiSeq/MiSeq测序平台及HeliScope测序平台;以单分子测序技术为基础的第3代测序平台基于单分子水平的边合成、边测序而无需PCR扩增,主要包括HeliScope测序平台和SMRT测序平台;ONT纳米孔单分子测序技术是基于电信号而非光信号的测序技术,具有高通量、低成本、耗时短和数据分析相对简单的优点,通常归为第4代测序平台。测序技术在药品洁净环境控制和中药质量分析方面有着越来越广泛的应用。随着测序技术的进步和生物信息学的发展,测序技术在医学和生命科学中的应用将发挥更大的作用。     

基因测序技术在中药质量研究中的应用（Ⅰ）——山东郓城猴头半夏基原的DNA测序鉴别

目的：分析半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit.及其伪品虎常南星Pinellia pedatisecta Schott的核基因组序列,为半夏正品基原鉴别提供分子依据。方法：采用PCR直接测序技术测定半夏及其伪品的18S rRNA基因核苷酸序列并作序列变异和选择性内切酶谱（PCR－SR）分析。结果：半夏和伪品的18S rRNA序列长度均为1805bp,根据排序比较,半夏原植物与商品药材间的序列完全相同,虎掌南星亦如此。而半夏与其伪品虎掌南星间则存在序列差异（有4个变异位点）。在半夏18S rRNA序列中有一个限制性内切酶Ase Ⅰ识别位点,通过PCR－SR图谱显示800bp和900bp2个酶切片断,而虎掌南星则无此位点,PCR－SR图谱显示1个未消化的1800bp片断。结论：通过核基因组序列和PCR－SR图谱差异DNA测序技术可成为半夏正品基原鉴别准确而有效的分子方法。     

冬虫夏草菌(Ophiocordyceps sinensis)基因组测序及高含量重复序列功能探讨

目的 本研究旨在获取高质量的冬虫夏草菌基因组,为研究冬虫夏草菌生物学及与宿主互作等提供重要支撑。方法 利用PacBio SequelⅡ平台的HiFi测序技术对冬虫夏草菌基因组进行测序,完成组装及注释。结果 本研究获得的冬虫夏草菌基因组质量目前处于最优水平,基因组完整度为97.7%、准确度高于99.9%,基因组大小为111.24 Mb,重复序列含量达到了81.3%,其中长末端重复序列反转录转座子占基因组总长度的62.2%,同时,根据其他生物中的研究对冬虫夏草菌反转录转座子长末端重复序列的潜在功能进行了讨论。结论 本研究获得了高质量的冬虫夏草菌基因组,为研究冬虫夏草菌生物学及与宿主互作奠定了基础。     

测序技术质的飞跃——速度提高100倍

2005年，测序技术又有了一个快速的飞跃，454生命科学公司在测序过程中采用了纳米材料，使测序速度提高了100倍。454生命科学公司也因为这项技术获得华尔街杂志第二届全球创新技术奖的金奖和医药生物技术类别的奖项。该公司目前已经和世界知名的罗氏宣布商业上的合作，2005年11月罗氏正式开始对中国地区提供基因组测序20系统。     

不同时期分离的鼠伤寒沙门氏菌全基因组学分析研究

目的：了解不同时期分离鼠伤寒沙门氏菌的基因组多态性。方法：采用solexa高通量测序技术对 12株分离于1954-1980年与2018-2020年的鼠伤寒沙门氏菌标准菌株进行全基因组测序,以此进行菌株的多位点序列分型(MLST)分析;应用生物信息分析软件对测序菌株基因组的基因功能注释,并对预测的毒力基因、耐药基因、插入元件(IS)、前噬菌体和CRISPR序列进行比较分析。通过比较基因学分析拟合泛基因组和核心基因组积累曲线,与来源于其他国家已发表的代表性菌株构建系统发育分子进化树。结果：不同时期分离的12株鼠伤寒沙门氏菌的染色体全基因组序列大小无明显差异,约为4.8 Mbp。 共发现5种不同MLST型别,以ST19为主(66.6%)。注释结果显示每株鼠伤寒沙门氏菌基因组含有大量 (＞20个)耐药基因;同时也发现不同菌株基因组之间毒力基因、IS、前噬菌体和CRISPR序列数量不尽相同;比较基因学分析证实鼠伤寒沙门氏菌核心基因组相对稳定,而泛基因组所含基因持续增加、高度可变。系统发育进化树显示,来源不同时期和国家的15株分离菌株形成3个不同进化分支,分子进化聚类与菌株的分离年代和地域无明显相关性。结论：解析了12株不同时期分离的鼠伤寒沙门氏菌标准菌株的全基因组序列,发现不同时期分离的菌株基因组数据和分子进化无明显相关性,这些结果不仅为后续探究鼠伤寒沙门氏菌耐药机制与遗传进化规律等研究奠定基础,同时也对标准菌株监管提供科学数据支持。     

利普斯他汀高产菌株毒三素链霉菌AP617-N12CA的全基因组测序与分析

摘要：目的 解析利普斯他汀(lipstatin)高产菌株毒三素链霉菌AP617-N12CA (S. toxytricini AP617-N12CA)的基因组序列信息,为深入研究该菌株高产lipstatin的分子机理与调控机制奠定基础。方法 联合应用三代单分子测序技术和二代高通量测序技术对AP617-N12CA菌株进行全基因组测序,使用相关软件对测序数据进行进基因组组装、基因预测和功能注释,并对lipstatin及其他次级代谢产物生物合成基因簇进行分析预测。结果 AP617-N12CA菌株整个基因组大约6.99Mb,GC含量73.76%,含有6134个编码序列;基因组由一条长约6.38Mb的线型染色体和一个长约0.61Mb的线型质粒组成;同时预测得到22个次级代谢产物合成基因簇,其中lipstatin基因簇定位在线型质粒右臂区域而非在染色体上。结论 首次完成了AP617-N12CA菌株全基因组完成图绘制,在S. toxytricini菌中首次发现和描述了线型质粒,在线型质粒上定位并鉴定分析了lipstatin基因簇。为S. toxytricini的功能基因组学研究和lipstatin高产机理解析提供了基础数据,对后续相关研究具有重要意义。     

高通量DNA测序技术在抗体新药研发中的应用

自2005年首次报道了一种基于微乳液PCR技术的高通量DNA测序技术 (high-throughput DNA sequencing technology) 以来, 高通量DNA测序平台已经发展为基因组和各种基因文库序列检测的强大工具。大容量的抗体基因库是目前获得抗体新药的基础, 高通量DNA测序技术为从海量的抗体基因库中快速发现功能抗体分子提供了可能。本文就近几年高通量DNA测序技术在抗体基因库的多样性分析, 抗体CDR3区的高通量测序、频率分析、功能基因发现及各种展示技术与高通量DNA测序技术的对接应用等方面进行了综述, 以期为抗体新药的研发提供一条新的技术路线。     

美丽芍药叶绿体全基因组解析及系统发育分析

本研究利用Illumina HiSeq X Ten测序平台对芍药属药用植物美丽芍药进行了叶绿体全基因组测序,通过生物信息学分析方法进行序列组装、注释和特征解析,并将其与芍药属其他11种植物的叶绿体全基因组进行了比较基因组学和系统发育分析。结果显示,美丽芍药叶绿体基因组全长152 731 bp, GC含量为38.4%,具有被子植物叶绿体基因组典型的四分体结构,包括一个大单拷贝区(large single copy, LSC)、一个小单拷贝区(small single copy, SSC)和一对反向重复区(inverted repeat sequence, IRa/IRb),长度分别为84 402、16 969和25 680 bp;共注释得到136个基因,包括90个蛋白编码基因, 38个tRNA基因和8个rRNA基因,其中7个蛋白编码基因、7个tRNA基因和4个rRNA基因分别在反向重复区发生了一次重复;此外,在美丽芍药叶绿体基因组中共检测出28个散在重复序列(dispersed repeats)、10个串联重复序列(tandem repeats)和64个简单重复序列(simple sequence repeats, SSRs)。芍药属12个物种的叶绿体基因组在大小、基因组成和排列顺序、GC含量等方面高度保守;同时,非编码区(包括基因间区和内含子)序列的种间变异高于蛋白编码基因序列, LSC区和SSC区序列变异高于IR区。系统发育分析结果以100%的支持率支持美丽芍药与芍药、草芍药和川赤芍共同构成一个单系分支,并与芍药亲缘关系最近。本研究首次报道了美丽芍药叶绿体全基因组,对其序列变异及结构特征进行了解析,并基于叶绿体全基因组序列构建系统发育树,明确了美丽芍药在芍药属内的系统发育位置,研究结果将为美丽芍药的保护遗传学和资源开发利用等研究提供理论基础。     

Integrated bacterial genomics for the discovery of novel antimicrobials

Sequencing of bacterial genomes has been progressing with breathtaking speed. Currently, the genomes of 23 bacterial species are sequenced, with approximately 40 more sequencing projects in progress. Industrial research is now facing the challenge of translating this information efficiently into drug discovery. This review will summarize the impact of bacterial genomics, bioinformatics and second-generation genomic technologies on target identification, assay development, lead optimization and compound characterization.     

海洋青铜小单孢菌FIM 02-523全基因组测序及分析

青铜小单孢菌(Micromonospora chalcea, M. chalcea)FIM 02-523能够合成对乏氧肿瘤细胞、艰难梭菌等具有活性的环脂肽类化合物rakicidins。利用Illumina HiSeq高通量测序平台,本研究首次对M. chalcea FIM 02-523进行全基因组测序,得到总长约6.74Mb的序列信息。分析表明基因组GC含量为72.89%,包含了6167个蛋白编码序列。利用AntiSMASH预测基因组中存在19个生物合成基因簇。结合PKS/NRPS生物合成特征和rakicidins化学结构特点,定位到了rakicidins的生物合成基因簇,并初步推测其生物合成途径。研究为M. chalcea FIM 02-523的功能基因组学研究和代谢调控提供了理论基础。     

天津地区4株金黄色葡萄球菌多位点测序分型

目的：应用分子进化学方法和信息学分析，研究4株金黄色葡萄球菌(SA)临床株的来源和遗传背景。方法：微量肉汤稀释法测定MIC、PCR扩增mecA基因，PBP2a平板乳胶凝集法识别MRSA、MSSA；应用多位点测序分型(Multilocus Sequencing Typing，MLST)进行ST分型比较。结果：2株MRSA，SA76和SA137，mecA基因的PCR扩增阳性，PBP2a平板乳胶凝集法阳性。另2株MSSA，SA11和SA155，mecA基因的PCR扩增、PBP2a平板乳胶凝集法阴性。MLST分型显示SA76和SA137的等位基因谱为2-3-1-1-4-4-3，归属ST9型，SA11为1-1-1-1-1-1-1，属ST1型，SA155为5-4-1-4-4-6-3，属ST7型。结论：MLST作为SA分型方法，分辨率高，结果准确，易于标准化。通过信息学分析，可以将MRSA克隆株、MLST分型、遗传背景和SCCmec联系起来．适于进行分子进化学研究。     

海鞘来源放线菌Streptomyces pratensis SCSIO LCY05中skyllamycins的发现及其生物合成分析

目的 挖掘海鞘来源放线菌 Streptomyces pratensis SCSIO LCY05生产含肉桂酰独特结构单元的skyllamycins类环肽的潜能,并深入分析skyllamycins生物合成基因簇的新特征.方法 利用Illumina Hiseq和Pacbio SMRT测序平台对S.pratensis SCSI...     

Bacterial DNA in the diagnosis of spontaneous bacterial peritonitis

Aliment Pharmacol Ther 2011; 33: 275–284

Summary

Background Despite inoculation into blood culture bottles, ascitic fluid culture is negative in 50% of cases of spontaneous bacterial peritonitis (SBP). Aim To determine whether 16S rDNA gene detection by real‐time polymerase chain reaction (PCR) and sequencing increases the efficacy of culture in microbiological diagnosis of spontaneous bacterial peritonitis. Methods We prospectively included 55 consecutive spontaneous bacterial peritonitis episodes in cirrhotic patients, 20 cirrhotic patients with sterile ascites and 27 patients with neoplasic ascites. Ascitic fluid was inoculated into blood culture bottles at the bedside and tested for bacterial DNA by real‐time PCR and sequencing of 16S rDNA gene. Results Bacterial DNA was detected in 23/25 (92%) culture‐positive SBP, 16/30 (53%) culture‐negative SBP (P = 0.002 with respect to culture‐positive SBP), 12/20 (60%) sterile ascites (P = 0.01 with respect to culture‐positive SBP) and 0/27 neoplasic ascites (P < 0.001 with respect to other groups). Sequencing identified to genus or species level 12 culture‐positive SBP, six culture‐negative SBP and six sterile ascites. In the remaining cases with positive PCR, sequencing did not yield a definitive bacterial identification. Conclusions Bacterial DNA was not detected in almost half the culture‐negative spontaneous bacterial peritonitis episodes. Methodology used in the present study did not always allow identification of amplified bacterial DNA.