辛伐他汀对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子表达影响的初步研究

目的:观察辛伐他汀对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体表达的影响.方法:将人脐静脉内皮细胞分为辛伐他汀组、TNF-α组、辛伐他汀+TNF-α组、IL-1β组、辛伐他汀+IL-1β组和空白对照组.采用免疫细胞化学方法,观察TNF-α和IL-1β对细胞中VEGF及其受体表达的影响,并观察辛伐他汀的干预作用.结果:TNF-α组和IL-1β组的VEGF及其受体表达明显高于空白对照组(P＜0.05),辛伐他汀十TNF-α组和辛伐他汀+IL-1β组表达分别明显低于TNF-α组和IL-1β组(P＜0.05).结论:辛伐他汀可以抑制炎性刺激导致的人脐静脉内皮细胞VEGF及其受体的表达.     

RI基因真核表达载体的构建及其对人脐静脉内皮细胞的影响

目的构建融合表达载体pcDNA3.1-RI,并检测核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因与血管生成素(angiogenin,ANG)的关系及对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖及迁移能力的影响。方法用RT-PCR方法扩增RI基因,酶切后将其插入pcDNA3.1,构建融合表达载体pcDNA3.1-RI,在脂质体介导下转染HUVECs,RT-PCR检测RI、ANG基因的mRNA表达水平;Western blot检测RI、ANG、MMP-2、MMP-9的表达水平;CO-IP法检测ANG和RI的相互作用,MTT法检测细胞的增殖活力,流式细胞仪检测细胞周期分布。结果真核表达质粒构建成功;转染pcDNA3.1-RI组细胞RI基因的mRNA及蛋白的表达较2个对照组(转染pcDNA3.1空载体组和未转染质粒组)均呈显著性增加(P<0.05),而ANG基因的mRNA及蛋白的表达均降低(P<0.05),MMP-2、MMP-9蛋白表达水平亦降低(P<0.05);CO-IP法检测到ANG和RI在细胞内能结合;转染pcDNA3.1-RI质粒到HUVECs细胞后细胞的增殖活力明显降低(P<0.05),G0～G1期比例明显增加,S期减少。结论成功构建的真核表达质粒能显著增加RI基因及其蛋白水平的表达,RI可以直接在转录水平上降低ANG的表达,在细胞内与ANG结合,从而影响内皮细胞的增殖、迁移能力。     

人CD40分子基因转染人脐静脉内皮细胞ECV-304

目的 构建人CD40的真核表达载体，建立持续、稳定高表达CD40的人脐静脉内皮细胞ECV-304。方法 将含有CD40的克隆载体pUCD40酶切后，再克隆到真核表达载体pCDNA3．1中，构建重组质粒pCDNA3．1（＋）／CD40，并对重组质粒进行酶切鉴定。然后用脂质体法将重组质粒转染ECV-304，G418筛选转染的细胞。RT-PCR、Western-blotting和流式细胞仪定性定量检测转染后的ECV-304的CD40的表达情况。结果 经酶切鉴定，重组体中已插入目的基因片段CD40。RT-PCR和Western-blotting证实，重组质粒转染的ECV-304中有CD40基因的表达，流式细胞仪检测转染后的ECV-304的CD40的表达率为95％。结论 成功构建了真核表达载体pCDNA3．1（＋）／CD40．并建立了高表达CD40的ECV-304，为筛选抗动脉粥样硬化药物奠定了基础.     

人CD40分子基因转染人脐静脉内皮细胞ECV-304

目的构建人CD40的真核表达载体,建立持续﹑稳定高表达CD40的人脐静脉内皮细胞ECV-304。方法将含有CD40的克隆载体pUCD40酶切后,再克隆到真核表达载体pCDNA3.1中,构建重组质粒pCDNA3.1( )/CD40,并对重组质粒进行酶切鉴定。然后用脂质体法将重组质粒转染ECV-304,G418筛选转染的细胞。RT-PCR﹑Western-blotting和流式细胞仪定性定量检测转染后的ECV-304的CD40的表达情况。结果经酶切鉴定,重组体中已插入目的基因片段CD40。RT-PCR和Western-blotting证实,重组质粒转染的ECV-304中有CD40基因的表达,流式细胞仪检测转染后的ECV-304的CD40的表达率为95%。结论成功构建了真核表达载体pCDNA3.1( )/CD40,并建立了高表达CD40的ECV-304,为筛选抗动脉粥样硬化药物奠定了基础。     

益心定悸方含药血清对人脐静脉内皮细胞VEGF表达影响的研究

[目的] 通过观察益心定悸方对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响探讨其治疗冠心病快速心律失常的作用机制, 同时为临床应用提供客观依据。[方法] 用20只雄性Wistar大鼠制备含药血清, 将内皮细胞接种在两种血清培养基上, 采用免疫组化方法测定VEGF的表达。[结果] 含药血清组细胞边界和核结构清晰细胞核颜色深染, 正常血清组VEGF仅有微弱表达。[结论] 益心定悸方能够明显促进VEGF表达, 这可能是本方治疗冠心病快速心律失常的作用机制之一。     

血管内皮生长因子基因体外转染人脐静脉内皮细胞的实验研究

观察血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF)基因转染对人脐静脉内皮细胞的生物学作用,探讨其在人工血管抗血栓形成中应用的可行性。将真核表达质粒pCD－hVEGF165体外转染人脐静脉内皮细胞。原位杂交、免疫组化及ELISA法检测VEGF基因的表达并描绘内皮细胞生长曲线。结果发现：VEGF基因转染能明显促进内皮细胞的分裂增殖。提示VEGF基因有可能作为增强人工血管抗血栓能力的有效候选基因。     

TDL复合物提高人脐静脉内皮细胞基因转染效率的体外实验

目的 研究HIV-1 Tat蛋白转导域/质粒DNA/Liposome(TDL)复合物介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, pEGFP)在体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)的转染效率.方法 将质粒DNA与Tat肽以不同的电荷比混匀,再加入2 μl Lipofectamine 2000制成TDL复合物.琼脂糖凝胶电泳分析质粒DNA与Tat肽的结合力;荧光显微镜和流式细胞仪观察TDL复合物与lipofectamine 2000介导基因在体外培养人脐静脉内皮细胞中的转染效果;MTT法检测TDL复合物对人脐静脉内皮细胞生长活性的影响.结果 TDL复合物组琼脂糖凝胶电泳未发现明显DNA条带.TDL复合物的转染率优于单用Lipofectamine 2000(P《0.05). Tat/DNA电荷比为8∶1时,TDL复合物的转染效率最高.TDL复合物组对细胞活性均无明显影响.结论 TDL复合物可明显提高基因在体外培养人脐静脉内皮细胞的转染效率,该方法可作为提高基因转染效率的有效手段之一.     

Gravin参与血管内皮生长因子诱导的人脐静脉内皮细胞体外血管形成

目的研究Gravin在血管内皮生长因子（VEGF）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）迁移和体外“小管样结构”（TLS）形成中的作用。方法用VEGF诱导HUVEC,通过Western blot和细胞免疫荧光分析Gravin在细胞内分布的变化;用Gǒ6983【蛋白激酶C（PKC）抑制剂】和VEGF共处理内皮细胞,观察对Gravin分布的影响,观察其对VEGF诱导HUVECs迁移和TLS形成的影响。结果VEGF呈时间和剂量依赖性诱导Gravin磷酸化,并向核周和细胞边缘重分布;以上效应能被0.5μmol/LGǒ6983抑制;Gǒ6983同时抑制VEGF诱导HUVEC迁移和TLS形成。结论PKC-Gravin信号通路参与VEGF诱导的内皮细胞迁移和血管形成。     

人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定

目的研究人脐静脉内皮细胞的体外培养方法,并进行细胞鉴定。方法胰蛋白酶灌流消化法收集人脐静脉内皮细胞,加入DMEM/F12混合培养基,37℃5%CO2培养箱中培养,观察细胞形态及生长状况,近融合时消化传代培养。采用形态学观察和CD34免疫组化法进行细胞鉴定。结果原代培养的人脐静脉内皮细胞约于24h完全贴壁,4~5d后融合成单层铺路石样结构。CD34染色证实培养的细胞是人脐静脉内皮细胞。结论胰蛋白酶灌流消化法可获得大量连续传代扩增的人脐静脉内皮细胞。     

PEDF对人脐静脉内皮细胞和肺癌SK-MES-1细胞增殖的影响及作用机制

目的 探讨色素上皮衍生因子(PEDF)对SK-MES-1细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖的影响及可能的机制.方法 CCK-8法检测不同浓度PEDF在不同作用时间条件下对HUVECs和SK-MES-1细胞增殖的影响;流式细胞仪检测不同浓度PEDF对此两种细胞凋亡的影响;qRT-PCR检测PEDF对此两种细胞中血管内皮生长因子(VEGF)基因表达水平的影响.结果 CCK-8结果显示,PEDF对HUVECs和SK-MES-1细胞具有增殖抑制作用,呈一定浓度和时间依赖性(P<0.05);流式细胞术结果表明,实验组细胞的凋亡率高于对照组(P<0.05),高浓度用药组凋亡率高于低浓度用药组(P<0.05);qRT-PCR结果表明,与对照组相比,PEDF能抑制HUVECs和SK-MES-1细胞中VEGF mRNA水平的表达(P<0.05).结论 PEDF的抗肿瘤作用主要包括抑制肿瘤血管生成和直接作用于肿瘤细胞两方面,PEDF对HUVECs和SK-MES-1细胞增殖的影响可能与降低VEGF表达水平有关.     

人脐静脉内皮细胞的原代培养

目的建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)且操作方便的体外培养方法。方法采用不同浓度的Ⅱ型胶原酶(0.05%,0.1%和0.2%)对HUVEC进行灌注,并分别孵育不同的时间(10min,13min,15min和18min)进行消化,观察细胞的形态、数量以及生长融合情况。结果采用0.1%的胶原酶消化10-13min为最佳条件,经光学显微镜观察培养的细胞数量较多,生长、繁殖状态良好,培养3d左右细胞可达到融合状态。结论本实验建立的胶原酶法消化HUVEC培养方法简便,细胞获得量较多且生长状态良好。     

尼古丁对人脐静脉内皮细胞凋亡及坏死的影响

目的不同浓度尼古丁对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡及坏死的影响。方法用CD34以免疫组织化学法鉴定HUVECs。通过3种不同浓度的尼古丁(3、30、300 ng/ml)刺激HUVECs 24 h后,用流式细胞仪检测其凋亡及坏死率。结果低浓度尼古丁促进细胞凋亡最强,而随着尼古丁浓度的增加,细胞凋亡率反而逐渐降低,各组差异具有统计学意义(P<0.05);此外,随着尼古丁浓度增加,细胞坏死率也日益增多,各组差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞坏死率与尼古丁浓度呈正相关(r=0.675)。结论尼古丁对HUVECs凋亡的影响具有浓度依赖性,细胞坏死率与尼古丁浓度呈正相关。     

他汀类药物对培养的血管内皮细胞VEGF和bFGF等因子表达的影响

目的观察Pitavastatin对血管内皮细胞VEGF、bFGF等因子表达的影响,探讨他汀类药物可能具有的独立于血脂调节作用以外的促血管新生作用.方法体外培养HUVEC,加入不同浓度的Pitavastatin后用蛋白印迹杂交法检测VEGF,bFGF,p-Akt及p-eNOS蛋白表达水平;镉还原Griess测定培养基中NO含量.结果在培养的HUVEC中加入Pitavastatin后,VEGF,bFGF,p-Akt及p-eNOS蛋白呈现高表达,培养基中NO含量明显增高.结论 Pitavastatin能诱导内皮细胞VEGF,bFGF,p-Akt及p-eNOS蛋白的表达及增加NO含量,推测其可能通过VEGF-p-Akt-eNOS(NO)径路而发挥非调脂的作用.     

人脐静脉内皮细胞体外培养方法的改进

目的 建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(HUVECS)的体外培养方法,为血管内皮细胞的大规模体外实验研究奠定基础.方法 比较0.25%胰酶、0.1%Ⅰ型胶原酶、0.25%胰酶与0.1%Ⅰ型胶原酶(1∶1)3种消化方法分离HUVECs的细胞数量和活细胞率的差异.观察血管内皮细胞生长因子(VEGF)对细胞生长的影响.细胞鉴定采用形态学观察和免疫荧光法检测.结果 0.1%Ⅰ型胶原酶单独或混合0.25%胰酶消化分离细胞数量较多、活细胞率较高(P＜0.05).VEGF能明显促进细胞增殖能力,延长细胞自然生长时间.细胞呈单层"铺路石"样排列,免疫荧光细胞化学法染色,激光买聚焦检测可见胞质中绿色荧光颗粒.结论 Ⅰ型胶原酶与胰酶混合消化HUVECs是获取血管内皮细胞的一种经济且效果较好的方法,添加VEGF能明显促进细胞增殖,可用于构建体外研究血管内皮细胞的模型.     

血清饥饿对原代人脐静脉内皮细胞周期同步化的影响

目的探讨人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）的最佳饥饿条件,以建立高效稳定的 HUVECs体外分离提取方法,并为HUVECs相关实验提供研究基础。方法用0.1%Ⅱ型胶原酶灌注脐静脉腔消化15 min,收集 细胞并用内皮细胞专用培养基（含5%内皮细胞基础培养基、1%内皮细胞生长因子、1%青链霉素）,置37 ℃,5% CO2培养箱培 养。在倒置显微镜下观察细胞形态特点,并用细胞免疫荧光方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术检测所得HUVECs的纯 度,并检测0%、0.1%、0.5%、1%血清浓度的培养基饥饿处理0、6、12、18、24 h对细胞周期的影响。结果0.1%Ⅱ型胶原酶消化可 以得到HUVECs,细胞培养呈典型的铺卵石状排列,细胞较密处呈涡旋状排列。免疫荧光检测细胞VIII因子相关抗原表达呈阳 性。流式检测细胞纯度高达99.67%。不同血清浓度培养基培养6 h可获得70%左右的G0/G1期细胞;培养12 h可获得80%~90% 的G0/G1期细胞;培养18、24 h 可获得95%左右的G0/G1期细胞。结论0.1%Ⅱ型胶原酶充盈静脉管腔可以获得高纯度的原代 HUVECs。完全无血清培养基培养12 h即可获得纯度超过80%的G0/G1期HUVECs。     

黄芪微乳载入修饰后胶原对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的:研究黄芪微乳载入修饰后胶原对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响,进一步探讨黄芪微乳对HUVEC增生的作用及其机制?方法:体外培养HUVEC细胞,用含1%FCS的RPMI-1640培养液同步24 h后,分为2组进行观察:空白微乳胶原组和黄芪微乳胶原组,并设定空白微乳和黄芪微乳的浓度分别为16.90?8.50?4.20?2.10?1.05 μg/ml等5个浓度,每组每个浓度设3个复孔?干预48 h后,采用MTT法和流式细胞术检测各组细胞的增殖情况;实时荧光定量RT-PCR检测细胞内血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA表达?结果:干预48 h后,在浓度分别为16.9?8.5?4.2 μg/ml的黄芪微乳胶原组HUVEC的吸光度值?细胞分裂增殖指数和VEGF mRNA表达均明显高于相应浓度的空白微乳胶原组(P < 0.05,P < 0.01)?结论:黄芪微乳能促进HUVEC的增殖,并上调HUVEC的VEGF mRNA表达,推测黄芪微乳可能具有促进血管生成的作用?     

葡萄糖和胰岛素对人脐静脉内皮细胞蛋白C受体分泌水平的影响

目的：探讨在葡萄糖和胰岛素作用下人脐静脉内皮细胞可溶性内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)的分泌,阐明内皮功能损伤与糖尿病血栓形成的机制。方法：将体外培养的人脐静脉内皮细胞分为葡萄糖组(5.5、20.0和40.0 mmol·L-1)、胰岛素组(0.1、1.0和10.0 nmol·L-1)、高糖(40 mmol· L-1)环...     

内皮细胞微粒对人脐静脉内皮细胞VCAM-1和ICAM-1表达的影响

目的:探讨内皮细胞微粒(Endothelial microparticles,EMPs)对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)血管细胞粘附分子-1(Vascular cellular adhesion molecule-1,VCAM-1)和细胞间粘附分子-1 (Intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)表达的影响.方法:取生长良好的第4、5代HUVECs,将细胞以1×105个/ml密度接种于5 cm2的培养皿中,待细胞生长近80％融合时进行干预.按0、1×102、1×103、1×104、1×105个ml浓度的EMPs进行分组及刺激,每组12个样本.在共同培养24h后收集细胞.分别采用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹方法检测VCAM-1和ICAM-1 mRNA和蛋白的表达.结果:HUVECs受EMPs刺激,VCAM-1和ICAM-1 mRNA及蛋白表达显著增加,且EMPs的这种作用呈浓度依赖性增强(均P＜0.05).结论:EMPs能上调HUVECs VCAM-1和ICAM-1的表达,EMPs不仅是内皮功能障碍的标记物,还能加重内皮功能损害.