CDK1 siRNA干扰在Taxol诱导细胞凋亡中的作用

目的 研究转染细胞周期依赖性蛋白激酶1(cyclin-dependent kinase 1,CDK1)siRNA、以及转染后进行凋亡刺激对细胞周期和凋亡的影响,探讨CDK1在细胞凋亡中的确切作用,揭示细胞周期与细胞凋亡协调的分子机制.方法 以人宫颈癌细胞株HeLa细胞为研究对象,脂质体转染CDK1 siRNA,转染后48 h加紫杉醇(Taxol) (20 μg/ml)刺激凋亡,Western印迹检测CDK1和抗凋亡蛋白BCL2表达,AnnexinV/PI法检测细胞的凋亡,流式细胞仪分析DNA含量检测细胞周期.结果 转染CDK1 siRNA后,CDK1蛋白的表达下降,细胞周期G2/M期比例增加,细胞凋亡率与对照相比没有明显升高.只加Taxol刺激12 h后细胞凋亡率增加并伴有S期和G2/M期比例增加. 转染CDK1 siRNA后再用Taxol刺激,其细胞凋亡率没有明显改变,G2/M期阻滞效应也没有叠加.BCL2蛋白只在加Taxol刺激组表达下降,与CDK1表达减少没有相关性.结论 siRNA沉默导致的CDK1表达降低只导致细胞周期G2/M期阻滞,没有引起细胞凋亡;CDK1的表达降低对紫杉醇所诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡效应没有明显影响.     

siRNA沉默P21表达对细胞周期解偶联和细胞凋亡的影响

目的： 利用RNAi技术探讨P21蛋白表达对HeLa 细胞周期解耦联和细胞凋亡的影响。方法： 丝裂霉素刺激HeLa细胞后可诱导P21蛋白高表达，采用脂质体转染技术将p21 siRNA 载体转染至HeLa细胞48 h后给予MMC刺激，利用流式细胞术检测HeLa细胞的P21蛋白表达、 细胞倍体的形成和细胞凋亡的改变。结果： p21 siRNA 载体可有效干扰经MMC诱导的HeLa细胞中P21蛋白表达, MMC刺激后24 h和48 h细胞2倍体百分数明显少于对照组(P<0.01)，4倍体和8倍体细胞百分数明显多于对照组(P<0.01)。p21 siRNA沉默HeLa细胞p21后，凋亡细胞百分率明显高于空质粒对照组(P<0.01)。结论： p21 siRNA可有效沉默HeLa细胞P21蛋白表达，在P21蛋白低表达的情况下，HeLa细胞可通过p53非依赖途径诱导细胞死亡，可能与细胞周期解偶联和p53非依赖的细胞凋亡有关。     

siRNA沉默COX-2基因对人胰腺癌Capan-2细胞增殖、细胞周期、凋亡和成瘤能力的影响

目的: 研究siRNA沉默环氧合酶-2(COX-2)基因对人胰腺癌Capan-2细胞增殖、细胞周期、凋亡和成瘤能力的影响。方法: 以Lipofectamine 2000(Lipo)为载体转染siRNA-COX-2至Capan-2细胞。应用RT-PCR、realtime PCR检测COX-2-mRNA表达,Western blotting 检测COX-2蛋白的表达。应用细胞直接计数法检测细胞的增殖,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡与周期。应用裸鼠模型评估COX-2-siRNA转染的Capan-2细胞成瘤能力的影响。结果: 在siRNA-COX-2浓度为50 nmol/L、Lipo为5 μL∶ 2 mL转染容积条件下,在Capan-2细胞的转染效率可达96.47%。siRNA-COX-2沉默Capan-2细胞中 COX-2 基因表达的最佳序列为siRNA006,转染24 h以后沉默效率达73%,COX-2蛋白表达水平在转染后48 h和72 h分别被下调了67% 和 61%。转染48 h后,Capan-2细胞生长明显减慢(P<0.05),48 h和72 h抑制细胞增殖率分别为35.48% 和56.32%。细胞凋亡率较对照组高(P<0.05),48 h和72 h细胞凋亡率为2.03%和3.27%。转染24 h、48 h和72 h G₀/G₁期的比例分别是58.03%、63.31%和65.66%,S期的比例分别是30.27%、24.87%和22.2%。siRNA-COX-2转染Capan-2细胞在裸鼠的皮下形成的肿瘤体积和重量明显减少(P<0.05)。结论: siRNA006-COX-2可有效沉默 COX-2 基因的表达,可明显抑制Capan-2细胞的生长并降低其成瘤能力。     

PDK1对肺癌A549细胞生物学行为的影响

目的:探讨3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)对肺癌细胞株A549生物学特性的影响及其潜在的作用机制。方法:采用Western blot和real-time PCR检测肺正常上皮细胞BEAS-2B和肺癌细胞(H460、SPCA1和A549)中PDK1的表达水平。利用RNA干扰技术下调肺癌A549细胞中PDK1的表达,然后分别采用CCK-8法和流式细胞术检测细胞活力及凋亡的变化;Western blot检测增殖及周期相关蛋白的表达和Akt/Fox O1信号通路的活性。最后通过Akt信号通路特异性激动剂胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)进一步验证PDK1和Akt/Fox O1信号通路的相互作用。结果:相较于肺正常上皮细胞BEAS-2B,肺癌细胞中的PDK1均呈高表达(P0.05)。干扰A549细胞中PDK1的表达后,细胞活力显著降低,周期进程缓慢,而细胞凋亡显著增加。Western blot实验结果显示,干扰PDK1后,细胞中cyclin D1、CDK4、p-Rb、Bcl-2、p-Akt及胞浆中p-Fox O1的含量显著下降,P27、cleaved caspase-3及核内Fox O1的蛋白水平显著升高(P0.05)。预先给予Akt激动剂IGF-1可部分逆转干扰PDK1对Akt/Fox O1信号通路的影响,并增加A549细胞的活力(P0.05)。结论:干扰人肺癌细胞株A549的PDK1可通过抑制Akt/Fox O1信号通路而调控周期及凋亡相关因子的表达,发挥生长抑制及凋亡促进作用,提示PDK1可作为肺癌的潜在诊疗靶点。     

特异性siRNA体外抑制HDGF基因对人大肠癌细胞凋亡的影响

目的：了解HDGF基因在体外是否对大肠癌细胞凋亡具有调控作用。方法设计特异性小干扰RNA抑制HDGF基因表达,本试验分为3组：空白对照组、非特异性siRNA转染的阴性对照组及HDGF特异性siRNA干扰组。通过AnnexinV?FITC流式双染, Hoechst 33258荧光染色等方法检测转染前后细胞凋亡变化,运用免疫印迹法检测转染HDGF?siRNA前后相关凋亡蛋白的变化情况。结果与2个对照组相比, HDGF?siRNA处理组细胞早期凋亡率明显上升至（14．1±1．24）％,差异具有统计学意义（P＜0．05）,在形态学上有20％的细胞出现染色质浓染的凋亡小体,而对照组基本未见;此外与2个对照组相比, HDGF?siRNA处理组细胞中bcl?2及Survivin蛋白含量均有明显下调,而Bax明显上调、 Cyt?c从线粒体释放到胞浆、 caspase?9及caspase?3被激活。结论 HDGF?siRNA能在体外有效诱导大肠癌胞发生凋亡,线粒体凋亡途径在HDGF基因介导的凋亡调控中起重要作用,这暗示HDGF将可能成为大肠癌基因治疗的一个极佳的分子靶点。     

STAT3siRNA对肺腺癌A549细胞STAT3表达和细胞生物学行为的影响

目的:观察经RNA干扰沉默STAT3基因对人肺腺癌细胞A549生长和凋亡的影响。方法:设计并经化学合成了针对STAT3基因不同位点的3条小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列(STAT3siRNA1、STAT3siRNA2、STAT3siRNA3),在脂质体(LipofectamineTM2000)介导下转染人肺腺癌细胞株A549,采用RT-PCR法检测STAT3mRNA表达变化,筛选出抑制作用最强的STAT3-siRNA。免疫印迹法检测细胞STAT3、Cyclin D1、BAX、Bcl-2、Caspase-9蛋白表达。AM-BLUE法测定A549细胞体外增殖情况。流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:经RNA干扰能有效降低A549细胞STAT3mRNA表达水平(P0.05),转染STAT3siRNA后,A549细胞STAT3、Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达水平均显著降低(P0.05),而BAX、Caspase-9蛋白的表达水平升高(P0.05)。STAT3蛋白表达分别与CyclinD1、Bcl-2蛋白表达呈正相关(r=0.854,0.910,P0.05);与BAX蛋白表达呈负相关性(r=-0.848,P0.05);与Caspase-9蛋白表达呈无相关性(r=-0.787,P0.05)。RNA干扰法沉默STAT3基因表达后,A549细胞增殖受到明显抑制,细胞凋亡率明显增加。结论:STAT3siRNA可有效抑制A549细胞STAT3表达,抑制A549细胞生长并促进其凋亡。     

慢病毒介导的靶向骨桥蛋白的siRNA对人脑胶质瘤细胞侵袭和凋亡的影响

目的 研究骨桥蛋白(osteopontin,OPN)下调后对胶质瘤细胞侵袭和凋亡的影响.方法 在体外以慢病毒介导的OPN小干扰RNA(small interference,siRNA)感染胶质瘤细胞系U251细胞,实时PCR和Western印迹检测OPN表达.通过Transwell实验、流式细胞仪检测,观察OPN表达下调后对胶质瘤细胞侵袭和细胞凋亡的影响.结果 慢病毒介导的OPN siRNA感染能显著降低U251细胞OPNmRNA水平及蛋白表达,有效抑制U251细胞侵袭能力,并诱导其凋亡,OPN siRNA感染组中Bcl-2、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)、MMP-2和MMP-9明显减少,Bax显著增多.结论 慢病毒介导的OPNsiRNA可显著抑制U251细胞的侵袭,并促进其凋亡.     

siRNA下调astrocyteelevatedgene-1对神经母细胞瘤细胞增殖和凋亡影响的体外研究

目的: 探讨siRNA下调astrocyte elevated gene-1( AEG-1 )表达对神经母细胞瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法: 用设计合成的AEG-1 siRNA转染神经母细胞瘤细胞株M17和SK-N-SH,采用荧光定量RT-PCR技术观察AEG-1 siRNA对 AEG-1 基因表达的影响;用MTT法和克隆形成实验观察AEG-1 siRNA对神经母细胞瘤细胞的增殖抑制作用;用流式细胞术检测下调 AEG-1 表达对神经母细胞瘤细胞凋亡及细胞周期的影响。结果: 用AEG-1 siRNA转染人神经母细胞瘤细胞,RT-PCR结果证实AEG-1 siRNA能显著基因下调 AEG-1 表达,与对照组相比有显著差异(P<0.01);MTT法和克隆形成实验结果证明下调 AEG-1 表达可显著抑制神经母细胞瘤细胞的增殖;流式细胞术检测结果表明下调 AEG-1 表达可促进神经母细胞瘤细胞凋亡,并将细胞周期阻滞在G₀/G₁期。结论: AEG-1 siRNA可下调基因在神经母细胞瘤细胞中表达,并抑制神经母细胞瘤细胞增殖,促进细胞凋亡。     

shRNA 干扰长链非编码RNA PVT1 对甲状腺乳头状癌IHH-4细胞增殖、凋亡和周期的影响

目的:探究沉默长链非编码RNA PVT1 对甲状腺乳头癌IHH-4 细胞增殖、凋亡和周期的影响。方法:慢病毒 转染PVT1 shRNA(sh-PVT1),RT鄄PCR 检测PVT1 的表达,CCK8 检测细胞增殖倍数,流式检测细胞凋亡及细胞周期,Western blot 检测细胞Ki67、Caspase-3 和Cyclin A 的表达;复制裸鼠甲状腺乳头状癌肿瘤移植模型,记录肿瘤生长情况,Western blot 检 测肿瘤组织Ki67、Caspase-3 和Cyclin A 的表达。结果:sh-PVT1 转染细胞24 h 后,IHH-4 细胞PVT1 的表达水平明显降低(P< 0.01);转染细胞4 d 后,细胞增殖倍数显著降低,增殖标志蛋白Ki67 表达明显被抑制(P<0.05,P<0.01);同时,sh-PVT1 能显 著升高IHH-4 细胞凋亡率,诱导凋亡标志蛋白Caspase-3 表达(P<0.01);此外,sh-PVT1 还可诱导细胞G2/ M 期阻滞,抑制周期 蛋白Cyclin A 的表达(P<0.05,P<0.01)。干扰PVT1 表达能显著抑制甲状腺乳头瘤生长(P<0.01),下调肿瘤组织Ki67 和 Cyclin A 的表达水平(P<0.01),诱导Caspase-3 表达(P<0.01)。结论:沉默PVT1 表达能显著抑制甲状腺乳头癌IHH-4 细胞 增殖且诱导细胞凋亡和周期阻滞。     

RNAi沉默HMGA1基因对肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响

目的:筛选HMGA1基因沉默稳定转染肝癌细胞株,检测沉默后肿瘤细胞凋亡、周期和增殖的变化。方法:靶向HMGA1的RNAi载体转染肝癌细胞,G418筛选得到稳定转染细胞株并鉴定;MTT法和FACS检测细胞增殖、凋亡及细胞周期。结果:成功建立基因沉默HMGA1稳定细胞株;HMGA1基因沉默后,细胞凋亡百分率(29.46±3.04%)明显高于质粒对照组和空白对照组(1.96±0.76%和2.04±0.70%,P<0.01);G0-G1期细胞百分率(75.21±2.35%)明显高于质粒对照组和空白对照组(37.98±3.02%和39.23±3.63%,P<0.01),G2-S期(24.79±2.35%)显著低于质粒对照组和空白对照组(62.03±3.01%和60.77±3.63%,P<0.01);MTT检测显示,HMGA1沉默细胞增殖与质粒对照组和空白对照组相比显著降低(P<0.01或0.05)。结论:基因沉默HMGA1可促进肿瘤细胞凋亡,抑制细胞增殖。     

MAD2 RNA干扰载体的构建及其对胃癌细胞生长的影响

目的：构建MAD2（有丝分裂阻滞缺陷蛋白2）特异性RNA干扰真核表达载体,体外观察抑制MAD2基因表达对胃癌细胞生长和细胞周期的影响.方法：构建MAD2 siRNA真核表达载体,脂质体法将pSilencer3.1空载体和pSilencer3.1/MAD2-siRNA1和pSilencer3.1/MAD2-siRNA2真核表达载体分别导入人胃癌细胞系SGC7901.稳定转染后Western blot和RT-PCR检测胃癌细胞内MAD2蛋白及mRNA水平的表达情况,挑选出抑制效果最好的单个克隆.MTF法检测各实验组细胞生长情况,流式细胞术检测纺锤体抑制剂长春新碱作用后,胃癌细胞MAD2-siRNA转染组和空载体组细胞周期的分布.结果：成功构建MAD2 siRNA真核表达载体,转染胃癌细胞SGC7901可使其MAD2蛋白及mRNA表达显著下调.MAD2表达降低的胃癌细胞生长速度明显增快（P＜0.01）,经长春新碱作用后不能被阻滞于有丝分裂期.结论：小干扰RNA技术可以有效地特异性抑制胃癌细胞纺锤体检查点关键蛋白MAD2的表达.MAD2的抑制可使胃癌细胞SGC7901生长加速,增殖能力增强,同时减弱纺锤体抑制剂长春新碱阻滞细胞周期的作用.     

Effect of GINS2 on Proliferation and Apoptosis in Leukemic Cell Line

Although previous researches have demonstrated that GINS2 express abundantly and abnormally in many malignant solid tumors, such as breast cancer, melanoma and hepatic carcinoma. However, the role and precise molecular mechanism in acute promyelocytic leukemia (APL) are rarely reported. In this current study, we investigated the possible effect and particular mechanism of GINS2 in occurrence and development of APL. We synthesized interference plasmid targeted GINS2 successfully in vitro and also constructed recombinant adenovirus vector carrying GINS2 gene in order to down-regulate or up-regulate GINS2 expression from two aspects of positive and negative in APL. After siRNA were transfected into HL60 cells, both GINS2 expression level of mRNA and protein in interfering group were down-regulated when compared with control groups. Together, MTT and flow cytometry technology showed that cell growth was significantly inhibited. Moreover, the expression lever of Bax was distinctly increased whereas Bcl2 was dramatically decreased in transfected group. Further experiments revealed that down-regulation of GINS2 expression inhibited DNA replication and had a G2/M phase block in HL60 cells. What''s more, ATM, CHK2, and P53 gene could involve in the pathogenic signaling pathways of HL60 cells when GINS2 gene was down-regulated. On the contrary, after HL60 cells were infected by recombinant adenovirus vector which contained GINS2 gene, we observed that over-expression of GINS2 could promote HL-60 cell proliferation. What''s more, GINS2 might implicate a potential target for leukemia gene therapy.     

siRNA对卵巢癌细胞周期及EGFR表达的影响

目的体外构建编码人类表皮生长因子受体（EGFR）的小干扰RNA（siRNA）的质粒表达载体,观察其对卵巢癌Skov-3细胞EGFR的特异性抑制作用及对细胞凋亡和周期的影响。方法构建pSilencer-EGFR siRNA真核基因表达载体,采用脂质体介导的方法将其转染到卵巢癌细胞株Skov-3,实验分为以下3组：空白对照组（未经转染的人卵巢癌Skov一3细胞）、非特异性转染组（转染非特异性质粒载体）及特异性转染组。用RT-PCR的方法检测mRNA水平的变化,用免疫荧光法检测EGFR蛋白水平的变化,流式细胞仪检测其对卵巢癌细胞周期及凋亡的影响。结果成功构建pSilencer—EGFR siRNA真核基因表达载体。psiRNA—EGFR质粒明显下调Skov-3细胞中EGFR的表达,阻断细胞周期在G1期,促进细胞凋亡。结论重组质粒psiRNA—EGFR能有效地抑制Skov-3细胞内EGFR的表达、抑制细胞增殖,其抑制机制可能与引起细胞周期再分布、降低S期细胞比例和促进细胞凋亡有关。     

人类P100蛋白表达抑制稳定株的建立及其对HeLa细胞周期的影响

目的构建针对人类P100(hP100)基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)质粒,转染后筛选P100表达抑制的稳定细胞株并鉴定其表达情况;同时检测其对细胞周期的影响。方法设计针对hP100基因的siRNA序列,构建pGenesil-shRNA-hP100质粒(smallhairpinRNA,shRNA,小发夹RNA),经测序鉴定后转染入宫颈癌细胞HeLa;经G418筛选出稳定株;Western印迹检测稳定株之抑制率。流式细胞术检测hP100蛋白表达抑制对细胞周期的影响。结果成功构建了针对hP100的siRNA质粒,并用之筛选出hP100蛋白表达抑制的稳定株,瞬时转染及稳定株hP100表达明显降低。流式细胞术显示抑制hP100蛋白表达使G1期细胞比例增加,S期和G2/M期细胞比例降低。结论RNAi(RNA interference,RNA干扰)可持续稳定地抑制人类P100蛋白的表达,人类P100蛋白表达抑制对细胞周期有调节作用。     

细胞周期调控与肿瘤

Cyclin、CDK、CKI是细胞周期调控的内源性分子,三者在细胞周期中相互协调并与细胞信号转导通路之间形成复杂的调控网络,与细胞增殖、细胞分化及细胞凋亡相关联。现发现肿瘤中存在相应基因的突变和表达失调,这些改变直接、间接导致细胞周期紊乱,与肿瘤发生密切相关,是分子遗传学和肿瘤生物学研究的热点。     

Hydrogen Peroxide Induces G2 Cell Cycle Arrest and Inhibits Cell Proliferation in Osteoblasts

Reactive oxygen species (ROSs) are involved in osteoporosis by inhibiting osteoblastic differentiation and stimulating osteoclastgenesis. Little is known about the role and how ROS controls proliferation of osteoblasts. Mammalian target of rapamycin, mTOR, is a central regulator of cell growth and proliferation. Here, we report for the first time that 5–200 μM hydrogen peroxide (H₂O₂) dose‐ and time‐dependently suppressed cell proliferation without affecting cell viability in mouse osteoblast cell line, MC3T3‐E1, and in human osteoblast‐like cell line, MG63. Further study revealed that protein level of cyclin B1 decreased markedly and the percentage of the cells in G₂/M phase increased about 2‐4 fold by 200 μM H₂O₂ treatment for 24–72 hr. A total of 0.5–5 mM of H₂O₂ but not lower concentrations (5–200 μM) of H₂O₂ inhibited mTOR signaling, as manifested by dephosphorylation of S6K (T389), 4E‐BP1 (T37/46), and S6(S235/236) in MC3T3‐E1 and MG63 cells. Rapamycin, which could inhibit mTOR signaling and cell proliferation, however, did not reduce the protein level of cyclin B1. In a summary, H₂O₂ prevents cell proliferation of osteoblasts by down‐regulating cyclin B1 and inducing G₂ cell cycle arrest. Inhibition of mTOR signaling by H₂O₂ may not be involved in this process. Anat Rec, 292:1107–1113, 2009. © 2009 Wiley‐Liss, Inc.     

丝/苏氨酸激酶Pim-1与肿瘤

人类pim-1基因编码一种丝/苏氨酸激酶(serine/threon ine k inase):P im-1,它广泛表达于人类各种组织细胞中,并且能够磷酸化多种在细胞凋亡、细胞周期调控中起着重要作用的细胞因子,如:STATs、Bad、cdc25A等,从而在肿瘤发生及发展过程中发挥着重要的作用。pim-1激酶可以作为肿瘤基因以及药物治疗的靶物,为临床治疗提出新思路。     

细胞周期失调与大肠癌

细胞周期需要一系列因子组成的复杂网络系统和信号传导途径的准确调节,细胞周期失调与肿瘤发生密切相关,本文对细胞周期调节网络系统的组成及细胞周期失调与大肠癌的关系作一综述。     

Cell cycle regulation and its aberrations in human lung carcinoma

Cell cycle is strictly regulated by complex and redundant mechanisms. Basically, cell cycle transition is promoted by accelerator molecules termed 'cyclin' and 'cyclin-dependent kinase' (cdk), and inhibited by brake molecules termed 'cdk-inhibitor' (CKI). Although based on the results of early experimental studies and of clinicopathological analyses, there was much speculation that gene aberration of those molecules would be common; this has not turned out to be the case. One reason may be that activation or inactivation of a single molecule by itself usually does not lead to cell transformation, but rather to apoptosis. Successful transformation and unchecked cell proliferation appears to require the coordinated up-regulation of cyclin/cdk and/or suppression of CKI. In this article, I focus on the precise regulation of the cell cycle and describe abnormalities found in these proteins in lung carcinoma. Notable findings in lung carcinoma include: (i) cyclin A/cdk2 plays a key role in cell proliferation, while protein amount of cyclin E does not necessarily reflect cellular proliferative activity, depending on the tumor type; (ii) CKI function not only as suppressors, but also as activators of cdk, depending on expression levels; and (iii) aberrant expression of cyclin/cdk can lead to apoptosis in vivo in humans. Another key point is that as lung carcinoma is composed of a mixture of heterogeneous histological subtypes, the growth control of carcinoma cells is diversely regulated, depending on each histological subtype. This diversity is also described with our experimental results.