SYBR-14/PI双染法流式细胞术检测精子质膜完整性的研究

目的:探讨应用荧光染料SYBR-14/碘化丙啶(SYBR-14/PI)双色标记法进行流式细胞术检测精子质膜完整性的可行性及其临床意义。方法:收集208例男性精液标本,按WHO精液分析标准分为正常组(n=31)与异常组(n=177)。通过计算机辅助精液分析系统进行精液常规分析。精液标本洗涤处理后经SYBR-14/PI双染后上流式细胞仪(FCM)分析,用发绿色荧光精子百分率(SYBR-14+/PI-%)表示质膜完整精子(PMI)的比例。结果:正常组与异常组SYBR-14+/PI-与SYBR-14-/PI+精子百分率均存在统计学差异(P均<0.05)。正常组精子SYBR-14+/PI-%为(55.66±20.64)%,显著高于异常组[(39.71±19.21)%,P=0.000]。208例标本中,SYBR-14+/PI-%与精子活动率呈显著正相关(r=0.408,P=0.000),与(a+b)级精子百分率呈显著正相关(r=0.398,P=0.000),与d级精子百分率呈显著负相关(r=-0.413,P=0.000);SYBR-14-/PI+%与精子活动率呈显著负相关(r=-0.380,P=0.000),与(a+b)级精子百分率呈显著负相关(r=-0.397,P=0.000),与d级精子百分率呈显著正相关(r=0.385,P=0.000);SYBR-14+/PI+%与精子活动率呈正相关(r=0.172,P=0.013),与(a+b)级精子百分率呈正相关(r=0.177,P=0.011),与d级精子百分率呈负相关(r=-0.164,P=0.018)。结论:应用流式细胞术SYBR-14/PI双染法检测精子质膜完整性具有可行性,可用于评估男性生育力。     

JC-1单标法流式细胞术检测精子线粒体膜电位的研究

目的:探讨应用荧光染料JC-1单色标记法进行流式细胞术检测精子线粒体膜电位(MMP)的可行性及其临床意义。方法:收集63例男性精液标本,分为生育组(n=31)和不育组(n=32)。通过计算机辅助精液分析系统进行精液常规分析。精液标本洗涤处理后用JC-1染色后上流式细胞仪分析,用发橙红色荧光精子百分率(JC-1+%)表示MMP正常精子的比例。结果:生育组精子JC-1+%为(75.89±15.69)%,显著高于不育组[(54.04±22.21)%,P=0.000]。63例标本中,JC-1+%与精子活动率呈显著正相关(r=0.610,P=0.000),与(a+b)级精子百分率呈显著正相关(r=0.614,P=0.000),与d级精子百分率呈显著负相关(r=-0.504,P=0.000)。JC-1+%与已建立的罗丹明/碘化吡啶双染法检测结果(Rh123+/PI-%)呈显著正相关(r=0.938,P=0.000)。结论:应用流式细胞术JC-1单标法检测精子MMP具有可行性,精子JC-1+%可作为男性不育的辅助诊断指标。     

二胎备孕男性精液质量与年龄、体质量指数以及肥胖生化指标的相关性分析

目的:探讨广州地区二胎备孕男性的年龄、体质量指数(BMI)以及肥胖生化指标对精液质量的影响。方法:对2017年8月15日至2018年7月18日在广州市妇女儿童医疗中心就诊咨询准备生育二胎的632例男性进行问卷调查,所有参与者采取静脉血进行脂代谢等相关指标检测,并按照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)的要求进行精液常规分析以及改良巴氏染色后精子形态分析,分析年龄、BMI、脂代谢指标、生活环境、职业等因素与精液质量的相关性。结果:年龄、BMI、取精季节、生活环境、职业等因素均可影响男性精液的质量。年龄与前向运动精子百分率呈负相关(r=-0.109,P0.05);BMI与精液量呈正相关(r=0.103,P0.05),并且与正常形态精子百分率呈负相关(r=-0.138,P0.05);高密度脂蛋白(HDL)与前向运动精子百分率呈负相关(r=-0.168,P0.01),与不活动精子百分率呈负相关(r=-0.135,P0.05);低密度脂蛋白(LDL)与精液量呈明显负相关(r=-0.124,P0.01),与前向运动精子百分率呈负相关(r=-0.127,P0.05),与不活动精子百分率呈正相关(r=0.140,P0.01),与精子浓度呈负相关(r=-0.121,P0.05),与精子总数呈明显负相关(r=-0.210,P0.01);进一步多因素回归分析显示:BMI和LDL是精液量的独立影响因素;尿酸(UA)是液化时间的独立影响因素;年龄、HDL和LDL是前向运动精子百分率的独立影响因素;年龄、HDL是不活动精子百分率的独立影响因素;LDL是精子总数的独立影响因素;而BMI和TG则是正常形态精子百分率的独立影响因素。结论:年龄、BMI、取精季节、生活环境、职业等因素均可能影响男性精液的质量。     

体脂百分数与体质量指数对精液参数的影响

目的:探讨成年男性体脂百分数(BF%)与体质量指数(BMI)对精液质量的影响。方法:随机选取男性不育患者125例,入选对象当天完成精液参数检查及BMI、BF%测定。以BMI≥28 kg/m~2作为肥胖标准,分为肥胖组50例、非肥胖组75例;以BF% 25%作为肥胖标准,分为肥胖组69例、非肥胖组56例。比较两种评判肥胖标准中肥胖组与非肥胖组患者精液参数的差异,分析年龄、BMI、BF%与精液参数的相关性。结果:以BF%为评判标准,肥胖组患者精液量[(2. 94±1. 15) ml]、a+b级精子百分率[(33. 37±19. 80)%]、精子活率[(56. 31±22. 26)%]较非肥胖组[分别为(3. 51±1. 27) ml、(41. 87±15. 43)%、(64. 95±18. 22)%]显著降低(P 0. 05);以BMI为评判标准,肥胖组精液量[(2. 86±1. 11) ml]、a级精子百分率[(16. 33±13. 80)%]、a+b级精子百分率[(30. 10±18. 43)%]、精子活率[(53. 62±21. 56)%]较非肥胖组[分别为(3. 34±1. 26) ml、(25. 09±15. 06)%、(39. 80±17. 50)%、(62. 83±20. 47)%]显著降低(P 0. 05)。相关性分析结果显示年龄与精子活率呈负相关(r=-0. 20,0. 05); BF%与精液量(r=-0. 21,P 0. 05)、a级精子百分率(r=-0. 21,P 0. 05)、a+b级精子百分率(r=-0. 18,P 0. 05)均呈负相关; BMI与精液量(r=-0. 26,P 0. 01)、a级精子百分率(r=-0. 23,P 0. 01)、a+b级精子百分率(r=-0. 18,P 0. 05)均呈负相关;进一步多因素分析显示,在排除年龄等因素后BF%与精液量、a+b级精子百分率均存在负性相关。结论:肥胖对男性不育患者的精液量、a级精子百分率、a+b级精子百分率、精子活率均存在影响; BF%可作为判断肥胖的纳入指标,检测结果可能更可靠。     

流式细胞术检测吸烟对精子质膜完整性的影响

目的:应用荧光染料SYBR-14/PI双色标记法进行流式细胞术检测不育患者精子质膜完整性,分析吸烟对精子质膜完整性的影响并探讨其临床意义。方法:收集202例男性精液标本,其中132例为本院就诊男性不育患者,分为大烟量组(n=68)与小烟量组(n=64),正常生育男性为正常对照组(n=70)。通过计算机辅助精液分析系统进行精液常规分析。精液标本经PBS洗涤处理后用荧光染料SYBR-14/碘化丙锭(PI)双染后上流式细胞仪分析,用SYBR-14+/PI-(绿)表示质膜完整精子(PMI);SYBR-14-/PI+(红)表示质膜破损而坏死的精子;SYBR-14+/PI+(绿,红)表示正处于由活到死过度状态的精子。检测精子质膜完整性,并对精子质膜完整性与部分精液参数做相关性分析。结果:大烟量组与小烟量组质膜破损的坏死精子(SYBR-14-/PI+%)、过渡态的精子(SYBR-14+/PI-%)与正常对照组存在显著差异(P<0.01或0.05)。大烟量组SYBR-14+/PI-%明显低于小烟量组,SYBR-14-/PI+%明显高于小烟量组。所有202例标本SYBR14+/PI-%与精子活动率呈显著正相关(r=0.938,P=0.000)。结论:应用流式细胞术SYBR-14/PI双染法能快速、准确地检测精子质膜完整性。吸烟会导致精子质膜完整性下降,引起精子活力下降,可能是导致男性不育的重要原因之一。     

流式细胞术检测精索静脉曲张患者精子质膜完整性的研究

目的:应用荧光染料SYBR-14/PI双色标记法进行流式细胞术检测精索静脉曲张患者精子质膜的完整性并探讨其临床意义。方法:随机收集120例男性精液标本,其中90例左侧精索静脉曲张患者分为3组:VC1组(精索静脉曲张Ⅰ度,n=30)、VC2组(精索静脉曲张Ⅱ度,n=30)和VC3组(精索静脉曲张Ⅲ度,n=30),正常生育男性为正常对照组(n=30)。通过计算机辅助精液分析系统进行精液常规分析。精液标本经PBS洗涤处理后用荧光染料SYBR-14/碘化丙锭(PI)双染后上流式细胞仪分析,用发绿色荧光精子百分率(SYBR-14+/PI-%)表示质膜完整精子(PMI)的比例,检测精子质膜完整性,并预见精子的受精能力。结果:精索静脉曲张各组患者与正常对照组之间SYBR-14+/PI-%、SYBR-14-/PI+%均存在统计学差异(P<0.01)。精索静脉曲张患者(VC1、VC2、VC3)代表精子质膜完整性指标(SYBR-14+/PI-%)的百分率分别是:[(54.85±3.78)%]、[(45.37±4.12)%]、[(35.14±4.91)%],均显著低于正常对照组[(70.79±6.71)%],其活力顺序为VC30.05)。结论:应用流式细胞术SYBR-14/PI双染法能快速、准确地检测精子质膜完整性,精索静脉曲张引起精子质膜完整性下降,可能是导致男性不育的重要原因之一。     

黄精赞育胶囊对弱精子症患者精子DNA完整性的影响

目的探讨黄精赞育胶囊对弱精子症患者精子DNA完整性的影响。方法选择弱精子症患者58例,常规服用黄精赞育胶囊3个月,应用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)和计算机辅助精液分析(computerassisted semen analysis,CASA)技术,分别检测并对照分析治疗前后精液参数和精子DNA完整性指标(DFI)变化。结果治疗前58例弱精子症患者精子密度、a级精子百分率、(a+b级)精子百分率、活动率与DFI呈显著负相关(r=-0.38,-0.56,-0.52,-0.64,P均0.05),畸形率与DFI呈显著正相关(r=0.42,P0.05)。治疗3个月后,患者精子密度、a级精子百分率、(a+b级)精子百分率、活动率、畸形率与治疗前相比差异有统计学意义;精液量、pH值、液化时间与治疗前相比差异无统计学意义(P0.05):DFI正常组的DFI值与治疗前相比差异无统计学意义,DFI异常组的DFI值与治疗前相比差异有统计学意义(P0.05)。结论黄精赞育胶囊可显著提高弱精子症患者精子密度、精子总数、活力、活动率,并可显著降低精子的畸形率,对于DFI异常的弱精子患者,使用黄精赞育胶囊可以明显改善精子DNA完整性。     

无症状生殖道感染不育男性精液白细胞亚群与精子DNA损伤的关系

目的:探讨无症状生殖道感染的不育男性精液中白细胞亚群与精子DNA损伤的相关性。方法:选择2013年3月至2015年8月就诊的无症状生殖道感染的不育男性111例,精液常规分析后,采用免疫细胞化学法检测精液中CD45~+白细胞浓度,流式细胞术检测单核细胞/巨噬细胞系CD14抗原~+、活化巨噬细胞HLA-DR~+细胞浓度;TUNEL法检测精子DNA碎片及8-羟化脱氧鸟苷(8-OHd G)表达情况;分析精液白细胞亚群与精子DNA损伤及常规精液参数的相关性。结果:精液CD45~+细胞浓度与CD14~+、HLA-DR~+细胞浓度间有明显相关性(P0.01),而不同亚群白细胞浓度与精液传统参数、碎片率、8-OHd G~+细胞比例均无明显相关性。8-OHd G~+精子百分率与精子碎片百分率呈正相关(r=0.48,P0.01),而与精子浓度呈负相关(r=-0.44,P0.01)。在调整年龄、禁欲时间和吸烟的基础上,精子浓度和精子碎片率(β=-0.25,P=0.008;β=0.23,P=0.05)与8-OHd G~+精子百分率的变化独立相关。结论:无症状生殖道感染的不育男性精子DNA损伤与精液质量下降相关,而与不同白细胞亚群无相关性。     

吸烟对重庆主城区成年男性精子凋亡及精液质量的影响

目的:探讨吸烟对重庆市主城区健康成年男性精子凋亡和精液质量的影响。方法:235例健康成年男性根据吸烟习惯分为吸烟组和不吸烟组。不吸烟组89例,吸烟组146例。采用计算机辅助精液分析系统检测精液常规参数;流式细胞术结合Annexin V-FITC/PI荧光染色检测精子凋亡(AN-/PI-、AN+/PI-、AN+/PI+、AN-/PI+精子比率),并对吸烟组和不吸烟组的各项参数进行比较研究。结果:与不吸烟组比较,吸烟组的早期凋亡精子(AN+/PI-)率高于不吸烟组[(8.1±5.1)%vs(6.8±3.8)%,P=0.039],而晚期凋亡精子(AN+/PI+)率两组间差异无显著性[(5.6±5.2)%vs(5.5±5.1)%,P=0.87];两组间精液量、精子密度、精子活动率、活力和正常形态精子率等精液常规指标的差异均无显著性(P=0.30;0.82;0.37;0.81;0.84)。结论:吸烟者早期精子凋亡率较不吸烟者高,提示吸烟可能诱导精子出现早期的细胞损害。精子凋亡可作为较精液常规指标更为敏感的生物标志物反映吸烟对男性精子造成的损伤。     

少和/或弱精子症患者血浆同型半胱氨酸的测定及意义

目的:检测少精子症和/或弱精子症患者空腹血浆同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平,并探讨其临床意义。方法:86例少精子症和/或弱精子症患者分为3组:少精子症组(n=21),弱精子症组(n=32),少弱精子症组(n=33);对照组(n=19)为精子密度及活力正常的健康男性精液。分别进行精液常规分析和空腹血浆同型半胱氨酸水平测定。结果:3组患者血浆Hcy水平均显著高于健康对照组(P<0.05),3组患者间血浆Hcy水平无显著性差异(P>0.05)。血浆中Hcy水平与3组患者的a级精子百分率、(a+b)级精子百分率及密度之间均呈负相关(r=-0.303、-0.339、-0.433,P<0.05)。结论:人血浆Hcy水平升高可能会直接或间接地影响精子发生,与少和/或弱精子症密切相关。     

添加黄芪注射液对人精子线粒体功能的影响

目的 观察添加黄芪注射液对人精子线粒体功能的影响。方法 弱精子症精子与黄芪注射液共孵化,用若丹明(Rh123)和碘化吡啶(PI)染色并用流式细胞技术检测人精子线粒体功能。结果 添加黄芪组线粒体功能良好的活精子数(9.831.65)明显高于对照组(6.500.41),与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。添加黄芪组(42.493.73)的线粒体荧光值也明显高于对照组(31.074.49),与空白对照组比较差异有显著性(P<0.05)。结论 体外添加黄芪注射液能增强弱精子症精子线粒体的活性,为黄芪作为体外添加剂提高精子活力提供理论基础。     

体外rhTNF-a对人精子运动、线粒体功能影响的实验研究

~~体外rhTNF-α对人精子运动、线粒体功能影响的实验研究@边疆$三峡大学医学院男科学研究所!湖北宜昌443003 @郭贤坤$三峡大学医学院男科学研究所!湖北宜昌443003 @熊承良$华中科技大学同济医学院计划生育研究所!湖北武汉430030 @黎家华$三峡大学医学院病理学教研室!湖北宜昌443003 @田永红$华中科技大学同济医学院计划生育研究所!湖北武汉430030 @马华刚$华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖医学中心!湖北武汉430030 @张燕$三峡大学医学院男科学研究所!湖北宜昌443003 @聂勇$三峡大学医学院男科学研究所!湖北宜…     

Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation

Aim： To investigate whether early apoptotic changes in spermatozoa can be significant markers for sperm quality. Methods： Two early apoptotic changes in the semen of 56 men were assessed using Annexin V （AN）/propidium iodide （PI） staining for phosphatidylserine externalization and JC-1 staining for mitochondrial membrane potential （MMP）. The results were compared with conventional semen parameters and DNA fragmentation identified using the TUNEL assay. Results： The different labeling patterns in the bivariate Annexin V/PI analysis identified four distinctive spermatozoa populations. The percentage of AN^-/PI^- spermatozoa positively correlated with conventional semen parameters and MMP, but negatively correlated with TUNEL （＋） spermatozoa. As for the AN^-/PI^＋ fraction, we found an opposite result in comparison to AN^-/PI^- spermatozoa. The level of early apoptotic AN^＋/PI^- spermatozoa negatively correlated with MMP and sperm motility. The level of late apoptotic AN^＋/PI^＋ spermatozoa negatively correlated with conventional semen parameters and MMP, and positively correlated with TUNEL （＋） spermatozoa. MMP positively correlated with conventional semen parameters, but negatively correlated with TUNEL （＋） spermatozoa. Conclusion： Although early apoptotic AN^＋/PI^- spermatozoa only negatively correlates with sperm motility, the differences in proportion of each subpopulation of spermatozoa （especially, the percentage of AN^-/PI^- spermatozoa）, and decreased MMP might be significant markers for diagnosing male infertility. They possibly bring additional information to predict the outcome of in vitro fertilization. （Asian J Androl 2008 Mar; 10： 227-235）     

Single UV excitation of Hoechst 33342 and propidium iodide for viability assessment of rhesus monkey spermatozoa using flow cytometry

Many fluorescent probes excited by visible light have been used to assess sperm quality by flow cytometry. Developing a viability evaluation method using UV excited stains would be useful for multiparameter analysis of sperm function. This investigation was conducted to determine the efficacy of Hoechst 33342 (H342) and propidium iodide (PI) dual staining for evaluating rhesus monkey sperm viability through use of flow cytometry and excited by a single UV laser. The results showed that the live cells stained only with H342 strongly correlated with expected sperm viability, and flow cytometric analyses were highly correlated with fluorescence microscopic observation. Using H342/PI/SYBR-14 triple staining method, it was found that the live/dead sperm distributions were completely concordant in both H342/PI and SYBR-14/PI assays. In addition, this dual staining was extended with fluorescein isothiocyanate-conjugated peanut agglutinin (FITC-PNA) to simultaneously analyze viability and acrosome integrity of sperm cryopreserved using two different extenders, TTE and TEST, and indicated that TTE offered better preservation of plasma and acrosome integrity than TEST. Therefore, the H342/PI dual staining provides an accurate technique for evaluating viability of rhesus monkey sperm and should be valuable for multiparameter flow cytometric analysis of sperm function.     

Protection of melatonin against damage of sperm mito-chondrial function induced by reactive oxygen species

Aim: To study the mitochondrial function damage of sperm in-duced by reactive oxygen species (ROS) and the protection of melatonin (MLT) against the damage. Methods: Normal function spermatozoa were selected from semen samples by Percoll gradi-ent centrifugation technique. The ROS generated by the hypoxan-thine xanthine oxidase system was incubated with the normal sper-matozoa in the presence or absence of MLT (6 retool/L) for 30 and 60 minutes.     

褪黑素在活性氧致精子线粒体功能损伤中的保护作用

目的 :探讨活性氧 (ROS)对精子线粒体功能的损伤以及褪黑素 (MLT)的保护作用。　方法 :采用Percoll梯度离心法选择具有正常生理功能的精子 ,作为本实验的正常精子模型。应用次黄嘌呤—黄嘌呤氧化酶体系产生ROS ,在MLT存在与不存在情况下 ,与精子模型分别孵育 30和 6 0min后 ,采用酶组织化学方法分析精子线粒体部位的琥珀酸脱氢酶 (SDH)活性 ,采用Rhodamine 1 2 3(Rh1 2 3)荧光探针标记精子 ,通过流式细胞仪检测线粒体膜电位。　结果 :正常精子与ROS孵育后 ,精子线粒体膜电位明显降低 ,线粒体SDH活力降低极为显著 ;而MLT则减轻了ROS对精子线粒体功能的损伤。　结论 :ROS可通过对精子线粒体膜电位和SDH活力的影响 ,而导致精子线粒体功能损伤 ;MLT可通过其有效的抗氧化能力 ,保护精子对抗ROS对其线粒体功能的损伤