检测大肠杆菌菌体蛋白的夹心ELISA试剂盒的建立及应用研究

目的  建立特异、敏感的检测大肠杆菌菌体蛋白的夹心ELISA试剂盒。方法  采用大肠杆菌菌体蛋白免疫家兔,制备得到高效价抗菌体蛋白抗血清。将经饱和硫酸铵盐析、阴离子交换柱层析和亲和层析纯化的兔抗大肠杆菌菌体蛋白特异性多克隆抗体作为包被抗体和检测抗体,用生物素标记检测抗体,并加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素。结果　建立的大肠杆菌菌体蛋白夹心ELISA检测方法的敏感性为0.32 μg/L,检测范围为1~100 μg/L,与国际同类商品化试剂盒相当。此法具有良好的稳定性,其批内变异系数小于7.7%,批间变异系数小于6.2%。结论  建立了特异、敏感、稳定的检测大肠杆菌菌体蛋白的夹心ELISA试剂盒,为生物制品中残留大肠杆菌菌体蛋白的质量控制提供了一种重要的检测方法。     

人血浆血管抑素ELISA检测方法的建立及初步应用

目的 建立一种检测人血浆中血管抑素(angiostatin,AS)含量的方法,并探讨其在肿瘤中测定的意义.方法 利用基因重组人AS免疫动物,制备特异性抗人AS多克隆抗体,建立人血浆AS酶联免疫吸附检验(ELISA)方法.并检测了73例恶性肿瘤患者血浆AS含量.结果 该方法检测人血浆AS的线性范围为3.13～100 mg/L,灵敏度为5 mg/L.73例肿瘤患者血浆AS水平均显著高于正常对照组(27.16±7.32) mg/L,(P<0.05或P<0.01).结论 以基因重组AS建立的人血浆AS含量ELISA检测方法,灵敏度高,重复性好,可为恶性肿瘤诊断提供一种新检测技术.     

检测百日咳毒素的双抗体夹心ELISA法的建立

目的  建立白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗生产中百日咳毒素（pertussis toxin, PT）含量的测定方法。方法  免疫家兔制备高效价抗PT血清,纯化抗PT多克隆抗体并进行酶标记,建立双抗体夹心ELISA法并对其进行验证。结果  建立的方法在0~20 ng/ml PT测量区间呈现最佳线性,相关系数＞0.99,且重复性好。检测百日咳丝状血凝素和黏着素,结果均为阴性,说明该法特异性良好。试验内10次、不同试验间3次测定16.0、8.0、4.0、3.0 ng/ml PT,变异系数为2.8%~9.7%,回收率为95.7%~106.0%,精密度和准确度验证均符合常规质量控制要求,定量限度为3.0 ng/ml。结论  该方法能有效检测百日咳杆菌大罐发酵过程中分泌的PT,为PT质量控制奠定了重要基础。     

检测黑猩猩腺病毒68型抗原的双抗体夹心ELISA的建立

目的  建立定量黑猩猩腺病毒68型（chimpanzee adenovirus type 68，AdC68）含量的双抗体夹心ELISA，并验证其可行性。方法  用表达绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）的非复制型AdC68（AdC68GFP）感染HEK293细胞，收获病变细胞并进行超速离心纯化AdC68GFP。用纯化AdC68GFP免疫家兔制备抗AdC68GFP抗体。以抗AdC68GFP抗体为包被抗体，辣根过氧化物酶标记的抗腺病毒HEXON IgG为酶标抗体，建立双抗体夹心ELISA，确定该法的线性范围，并验证该法的准确度、精密度、专属性和适用性。结果  纯化AdC68GFP的蛋白浓度为38.8 µg/ml，其中HEK293细胞的蛋白浓度低于0.3 µg/ml。双抗体夹心ELISA的最适包被抗体和酶标抗体浓度分别为1∶50和1∶500。该法的线性范围为0.06~3.88 µg/ml，线性相关系数为0.999 6。高、低浓度AdC68GFP样品的回收率分别为93.17%和94.33%，变异系数分别为6.72%和3.44%。该法可特异性检测AdC68GFP抗原，未发现与HEK293细胞蛋白发生交叉反应。应用该法检测AdC68GFP纯化过程中的样品可反映病毒的纯化效果。结论  建立的双抗体夹心ELISA具有良好的准确度、精密度和特异性，可用于AdC68纯化工艺过程中对病毒蛋白含量的快速检测。     

14型肺炎球菌多糖双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的  建立并验证测定14型肺炎球菌多糖（pneumococcal capsular polysaccharide serotype 14,PS14）浓度的双抗体夹心ELISA。方法  采用Protein G亲和层析纯化兔血清,得到兔抗PS14多克隆抗体（多抗）。以鼠抗PS14单克隆抗体（单抗）为捕获抗体,兔抗PS14多抗为检测抗体,碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG为二抗,PS14为参考品建立双抗体夹心ELISA法。确定鼠抗PS14单抗和兔抗PS14多抗的工作浓度,建立标准曲线,并验证该方法的准确性、精密度和特异性,考察佐剂对该方法的影响。结果  鼠抗PS14单抗的最适工作浓度为5 μg/ml,兔抗PS14多抗的最适工作浓度为1 μg/ml,标准曲线的范围为9.375 ~ 600.000 ng/ml,线性良好,相关系数为0.999。测定多糖样品的PS14回收率为110% ~ 140%,多糖蛋白结合物样品的PS14回收率为90% ~110%。平均批内和批间精密度分别是5.64%和7.14%。13价结合物混合样品的PS14回收率为85% ~100%;含有佐剂的疫苗样品的PS14回收率为85% ~110%。结论  成功建立了双抗体夹心ELISA法,该方法准确性、精密度、特异性良好,且检测结果不受佐剂的影响,具有一定耐用性。     

胰蛋白酶原激活肽酶联免疫吸附检测法的建立与应用

目的建立灵敏、特异地检测胰蛋白酶原激活肽(TAP)的酶联免疫吸附(ELISA)方法。方法利用杂交瘤技术制备抗TAPmAb，建立检测TAP的ELISA测定法，并初步用于16例急性胰腺炎患者及20例其他急腹症患者尿液标本的检测。结果本法灵敏度为0．69ng／ml，可测范围为0．69～1000ng/ml，批内变异系数为9．10％，批间变异系数为10．33％，回收率为97．7％。轻型、重型急性胰腺炎患者及对照组患者尿TAP含量(中位值)分别为57．35ng/ml、18．68ng/ml、8．86ng/ml。结论本法具有良好的灵敏度、特异性、稳定性，经进一步研究，可望用于急性胰腺炎的诊断及病情预测。     

检测脑膜炎球菌多糖疫苗Y群多糖含量和分子大小的双抗体夹心ELISA法的建立和初步应用

目的建立测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗（groupsA,C,Y,W135meningococ—calpolysaccharidevaccine,MPV4）Y群多糖含量的双抗体夹心ELISA法。方法采用杂交瘤技术制备抗Y群多糖单克隆抗体,并通过过碘酸钠法用辣根过氧化物酶标记单克隆抗体。分别以抗Y群多糖不同位点的单克隆抗体作为包被抗体和酶标二抗,通过优化反应条件来建立双抗体夹心ELISA法,同时进行方法学验证。结果建立的双抗体夹心ELISA法特异性良好,未检出与A、C、W135群多糖的交叉反应。Y群多糖在2．5～20．0ng／ml范围的剂量反应曲线呈现最佳线性关系,相关系数〉0．99。该法的试验内和试验间准确度较好,精密度较佳,定量限度为4ng／ml。采用该法测定3批MPV4Y群多糖显示,Y群多糖的含量、多糖分子大小‰值和回收率的结果均与先前的检定结果一致,符合暂行质量标准。结论建立的双抗体夹心ELISA法可用于MPV4Y群多糖的关键质量指标测定。     

柯萨奇病毒A组10型抗原双抗体夹心ELISA定量方法的建立及应用

目的 建立柯萨奇病毒A组10型（coxsackievirus A10,CV-A10）抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于CV-A10生产过程样品和四价手足口病疫苗的质量控制。方法  以纯化的CV-A10抗原分别免疫绵羊和小鼠获得羊免疫血清和杂交瘤单克隆抗体(单抗)细胞株,以杂交瘤细胞株免疫小鼠制备腹水,羊血清和小鼠腹水分别经亲和层析后获得纯化羊抗CV-A10多克隆抗体（多抗）和小鼠抗CV-A10单抗。采用微量细胞病变法测定纯化多抗和单抗中和抗体效价。分别以纯化羊多抗作为包被抗体、小鼠单抗作为检测抗体,进行配对筛选研究,建立CV-A10抗原定量双抗体夹心ELISA;对方法的线性、专属性、准确度、精密度、范围进行验证,并对CV-A10抗原生产过程中的样品和成品进行检测。结果 纯化抗CV-A10单抗和多抗均具有中和抗体活性。以多抗作为包被抗体、7株单抗作为检测抗体进行配对,其中5株单抗配对成功,选择CY166-14R作为检测抗体用于CV-A10抗原定量检测ELISA的建立;对检测方法进行优化,确定以羊多抗作为包被抗体的使用稀释比例为1：5 000〜1：10 000、小鼠单抗检测抗体稀释比例1 ：2 000〜1：4 000。建立的CV-A10抗原定量检测方法范围为0.42〜10. 00 U/ml,线性决定系数≥0. 99;该方法仅能特异性检测CV-A10抗原,与其他抗原或物质（肠道病毒71型、CV-A6、CV-A16、M199、DMEM、Vero细胞蛋白、牛血清）无交叉反应;对高、中、低浓度样品进行测定,测定值/理论值在95%〜110%之间,相对标准偏差在15%以内。结论 建立了 CV-A10抗原定量双抗体夹心ELISA,该方法在一定范围内的线性、专属性、准确度、精密度均较好,可用于CV-A10抗原生产过程样品和成品的质量控制,为CV-A10抗原的体外效力评价提供方法学基础。     

测定脑膜炎球菌疫苗C群多糖的双抗体夹心ELISA法的建立

目的 建立测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗(groups A,C,Y,W135 meningococcal polysaccharide vaccine,MPV4)C群多糖含量的双抗体夹心ELISA法.  方法 制备抗C群多糖多克隆抗体,所得的多克隆抗体经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后,用过碘酸钠法对其标记辣根过氧化物酶.分别将抗C群多糖多克隆抗体作为包被抗体和酶标二抗,建立双抗体夹心ELISA法,优化反应条件,对C群多糖进行特异性定量测定.  结果 建立的双抗体夹心ELISA法特异性较好,未检出与A、Y、W135群多糖的交叉反应.C群多糖在2.5～20.0 ng/ml质量浓度范围的剂量反应曲线线性最佳,相关系数大于0.99.该法的准确度和精密度均较好,试验内和试验间变异系数和多糖回收率分别为0.6％ ～9.1％和87.5％ ～ 100.0％,定量限度为4.0 ng/ml.采用该法测定3批MPV4显示,C群多糖含量及多糖分子大小KD值和回收率的测定结果均与先前的测定结果一致,均符合暂行质量标准.  结论 建立的双抗体夹心ELISA法可用于MPV4 C群多糖的关键质量指标测定.     

抗紫杉醇单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

目的:制备抗紫杉醇单克隆抗体并建立间接ELISA检测方法。方法:用琥珀酸酐法将紫杉醇(taxol)与牛血清白蛋白(BSA)偶联制成全抗原taxol-BSA,采用紫外波长扫描法和薄层层析检测法对合成抗原进行鉴定;以taxol-BSA免疫Blab/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0进行融合,经间接ELISA法筛选、融合细胞有限稀释法克隆、克隆化杂交瘤细胞株的亚类鉴定等筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特异性进行鉴定;用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化腹水。同时,对间接ELISA法反应条件进行了优化。结果:获得了3株能稳定分泌抗紫杉醇单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为taxol-A1,taxol-A2和taxol-A3;taxol-A3株腹水效价为1∶128 000,属于IgG2b亚型;建立的间接ELISA法检测条件为15μg.mL-1抗原、4℃包被过夜、1%BSA封闭1 h,PBS做抗体稀释液,单抗反应时间为30 min,酶标二抗作用时间1 h,10%浓硫酸终止反应。结论:获得了特异性的抗紫杉醇单克隆抗体并建立了间接ELISA检测方法。本研究制备的抗紫杉醇单克隆抗体及建立的间接ELISA检测方法,为从内生真菌生物合成紫杉醇发酵液中迅速、高效地分离纯化和检测紫杉醇奠定了基础。     

酶免分析法检测甲状腺双抗体在临床中的应用

目的：探讨抗甲状腺球蛋白抗体（Anti-Tg）和抗甲状腺过氧化物酶抗体（Anti-TPO）检测在临床上较高阳性率。方法：采用微粒子酶免分析法（MEIA）分析医院就诊疑似甲状腺疾病的患者225例,并与健康体检人群42例检测Anti-Tg和Anti-TPO检测阳性率进行对照。结果：医院就诊疑似甲状腺疾病的患者阳性率（Anti-Tg为40.9%、Anti-TPO为31.6%）明显高于健康体检人群阳性率（Anti-Tg为16.7%、Anti-TPO为14.3%）,两组比较差异有统计学意义。结论：通过MEIA检测血清中Anti-Tg和Anti-TPO水平,与甲状腺疾病有密切关系,可作为甲状腺疾病的诊断指标。MEIA对Anti-Tg和Anti-TPO进行定量测定,其检测速度快、灵敏度高、重复性好,自动化程度高,具有良好的稳定性,检测效率高,能及时为临床上诊断、治疗甲状腺疾病提供实验依据,值得推广。     

高尔基蛋白73(GP73)ELISA定量检测方法的建立及临床应用

目的 建立双抗体夹心ELISA定量检测人血清高尔基蛋白73(GP73)的方法,并用于检测血清GP73含量.方法 利用杂交瘤法制备纯化的抗GP73单克隆抗体(mAb)进行辣根过氧化物酶(HRP)标记后,通过棋盘滴定法确定包被抗体和酶标抗体及其最适工作浓度;以重组人的GP73抗原为标准品建立标准曲线;以重复性、灵敏性和回收率实验评价ELISA方法.应用该ELISA法对正常人、肝炎、肝硬化及肝癌患者血清中的GP73水平进行定量检测.结果 当抗GP73 mAb 3D5A10和7H3F5分别为捕获抗体和酶标抗体、工作浓度分别为40 μg/ml和1∶ 4000时,双抗体夹心ELISA法最优.该方法的平均批内和批间变异系数分别为4.6％和7.6％,灵敏度达3.76 ng/ml,平均回收率为(102.2±5)％.用本方法重复测定肝癌(33例)、肝硬化(28例)、乙型肝炎(44例)及正常人(44例)血清样本中GP73浓度(中位数)分别为25.9、27.6、16.7、9.9μg/L;除肝癌与肝硬化组间差异无统计学意义外,其余各组间均有统计学差异(P＜0.05).结论 成功建立了双抗体夹心ELISA定量检测GP73的方法.检测血清GP73可作为诊断肝脏疾病的重要辅助手段之一.     

双抗体夹心ELISA法定量检测左旋多巴

目的建立左旋多巴的酶联免疫定量分析方法。方法以左旋多巴与载体蛋白钥孔戚血蓝素偶联,制备免疫抗原Levodopa-KLH。采用杂交瘤技术制备的特异性抗左旋多巴单克隆抗体作为包被抗体,待测左旋多巴为夹心抗原,免疫抗原Levodopa-KLH免疫新西兰兔得到的多克隆抗体为检测抗体,建立了一种定量测定左旋多巴的双抗体夹心ELISA方法。结果左旋多巴浓度在40～2 000 ng/mL范围内呈良好线性关系,Y=0.8367 X+0.3423,相关系数r2=0.993 3,检测限为20 ng/mL。经方法学考核,批内、批间变异系数分别为9.53%和12.77%,平均回收率为87.86%,与卡比多巴、多巴胺、异丙肾上腺素、去甲肾上腺素、肾上腺素、维生素C、5-羟色胺、金刚烷胺基本无交叉反应,健全性分析表明,人血清稀释倍数对该方法无影响,8 d连续检测标准曲线表明稳定性良好。结论这种定量检测左旋多巴的双抗体夹心ELISA方法,灵敏度高,重复性好,为左旋多巴研究提供了定量检测的方法,并为药代动力学、临床血药浓度监测提供备选方法。     

酶联免疫白喉抗体定量试剂的研制及应用

目的 研制白喉抗体定量试剂,用于白喉疫苗免疫后抗体水平监测.  方法 采用双抗原夹心法原理,用白喉抗体国家参考品为定量依据,建立ELISA定量检测系统.  结果 试剂经系统优化后,检测抗体浓度在10～120 IU/L之间,呈良好的线性关系(r=0.996).精密度(CV)≤4.6%.实际应用验证,用ELISA试剂对不同年龄组的检测结果显示,白喉抗体水平的变化趋势与国家计划免疫程序密切相关.在白喉疫苗效力检定中,用ELISA试剂直接测定免疫后小鼠的抗体水平与Vero细胞法测定结果之间具有良好的相关性(r=0.974).  结论 该试剂可用于白喉抗体的定量检测.     

Different recognition by peroxisome proliferator structures in rat peroxisomal induction: application of sandwich ELISA using monoclonal antibody against rat peroxisomes

A novel assay for a peroxisomal beta-oxidation enzyme by sandwich ELISA using a monoclonal antibody (RPX-5) against purified rat liver peroxisomes was developed. Immunoblot analysis revealed that RPX-5 recognized a 78 Kd protein, which is a peroxisomal bifunctional enzyme (PBE) in the beta-oxidation pathway. Immunoprecipitation by RPX-5 and the resulting reduction of PBE activity were dependent on RPX-5 concentrations. Sandwich ELISA using RPX-5 could be used to assay PBE in the range of 30 to 2000 ng protein/ml. In rat hepatocyte cultures, the PBE amount by this assay correlated well with PBE activity, with correlation coefficients of 0.965. Studying the mechanisms of peroxisomal induction, patterns of peroxisomal induction were examined by co-treatment of rat hepatocytes with various peroxisome proliferators (PxPs). Treatment with clofibrate and bezafibrate resulted in neither an additive nor synergistic effect on PBE level. On the other hand, co-treatment with either bezafibrate-Wy-14,643 or clofibrate-MEHP(mono(2-ethylhexyl)phthalate) both resulted in an additive effect. From these results, it is suggested that PxPs of the fibrate group may exert their functions via a common process, and non-fibrate PxPs via a different process in hepatocytes. The cognition site for peroxisome proliferators, therefore, might not involve a single site for inducing peroxisomal enzymes.     

Monoclonal antibodies and sandwich ELISA for quantitation of HM-1 killer toxin

To establish a method for quantitative analysis of HM-1 killer toxin (HM-1), two purified mouse monoclonal antibodies, 1F1 and 4A2, and rabbit polyclonal antiserum against HM-1 were prepared. Both monoclonal antibodies were classified as IgG1(kappa) subtype, and did not neutralize the killing activity of HM-1. By SPOTs analysis, the epitope of 1F1 was found in the sequence of CDPNTG with a corresponding sequence of 11-16 from N-terminal amino acid residues of HM-1, but the epitope of 4A2 was not determined. Using 4A2 and polyclonal antiserum, the sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was applied to establish the quantitative determination of HM-1. The concentration of HM-1 was determined successfully at the range of 2.5-100 ng/ml. But in the case of 1F1, the method was not established. Genes were constructed to apply the system to the measurement of the secreted concentrations of mutant HM-1, and it was evident that the production of mutant toxins varied among HM-1 mutant genes. The findings of this study are unique in determinimg the epitope of monoclonal antibody against HM-1, and in quantifying the HM-1 using the spot analysis and sandwich ELISA methods.     

ELISA法检测外周血环氧合酶-2活性在亚临床冠状动脉粥样硬化中的应用探讨

目的:探讨酶联免疫法(ELISA)检测外周血环氧合酶-2(COX-2)活性在亚临床冠状动脉粥样硬化(AS)中的应用价值。方法:应用选择性COX-2抑制剂(塞来昔布)对亚临床冠状动脉粥样硬化进行短期干预,ELISA法检测各分组血浆COX-2水平,并结合临床资料进行分析。结果:亚临床AS组COX-2水平[(10.84±3.11)U/L],明显高于正常对照组[(6.97±1.25)U/L](P<0.05);塞来昔布组在接受塞来昔布后COX-2水平显著降低(P<0.05),接近正常对照组水平(P>0.05),与安慰剂组有明显差异(P<0.05)。结论:亚临床AS血浆COX-2水平明显升高,ELISA法测定血浆COX-2活性可作为亚临床AS的诊断、预后的参考指标。