p53及B7重组痘苗病毒抗肿瘤的实验研究

目的：探索点突变 ｐ５３重组痘苗病毒诱导的抗瘤免疫反应及 Ｂ７对其加强作用,为重组抗原疫苗用于肿瘤免疫治疗提供实验依据。方法：选择人 １３５位 Ｃｙｓ→Ｔｙｒ点突变ｐ５３作为肿瘤相关抗原模型,观察以表达该点突变 ｐ５３的重组痘苗病毒ｒＶＶ－ｐ５３ＦＬ单独和联合表达 Ｂ７的重组痘苗病毒 ｒＶＶ－Ｂ７所诱导的 ＣＴＬ及对荷瘤小鼠的免疫保护和治疗作用。结果：以 ｒＶＶ－ｐ５３ＦＬ经静脉免疫 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠能够诱导以 ＣＤＳ＋ Ｔ细胞为主的特异性 ＣＴＬ。ｒＶＶ－ｐ５３ＦＬ能够保护部分小鼠免遭肿瘤细胞的攻击。以ｒＶＶ－ｐ５３ＦＬ治疗荷瘤小鼠,可显著延长小鼠平均存活期。ｒＶＶ－Ｂ７与ｒＶＶ－ｐ５３ＦＬ以１：１的比例混合接种可部分加强ｒｖｖ－ｐ５３ＦＬ的治疗作用。结论：肿瘤细胞内过度表达的突变Ｐ５３蛋白可作为ＣＴＬ识别和攻击的靶抗原,以突变Ｐ５３蛋白作为肿瘤抗原的疫苗可诱导机体产生 ｐ５３特异性的抗瘤免疫反应。共刺激分子 Ｂ７可加强肿瘤抗原诱导的抗瘤免疫反应。     

表达HPV16 E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒诱发的抗肿瘤免疫反应

目的　观察表达人乳头瘤病毒 (HPV) 16E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒的抗肿瘤免疫效果。方法　以重组痘苗病毒NTVJmE6E7免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,检测特异性的细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)活性 ;经免疫后的小鼠以TC 1肿瘤细胞攻击 ,观察免疫保护效果 ;荷瘤小鼠切除肿瘤后接种重组痘苗病毒 ,观察肿瘤复发情况。结果　以重组痘苗病毒NTVJmE6E7免疫小鼠 ,可诱导产生针对TC 1细胞的特异性的CTL反应 ;加强免疫后的小鼠能耐受 1× 10 4TC 1细胞的攻击 ;以重组痘苗病毒NTVJmE6E7免疫肿瘤术后小鼠 ,能有效地预防肿瘤复发。结论　非复制型重组痘苗病毒NTVJmE6E7可作为HPV16的相关肿瘤及其癌前病变免疫治疗的候选疫苗。     

突变N-ras基因重组痘苗病毒rV-N-ras/61的构建

目的：构建Ｎ－ｒａｓ基因第６１位密码子突变基因（Ｎ－ｒａｓ／６１）的重组痘苗病毒,通过痘苗病毒载体所产生的蛋白的强烈免疫原性来提高变异Ｎ－ｒａｓ蛋白有肿瘤抗原性。方法：利用双ＰＣＲ方法得到第６１位突变的Ｎ－ｒａｓ／６１基因片段（５００ｂｐ）,将该基因生段插入痘苗病毒表达载体Ｐ１１０８,通过Ｃｅｌｌ ＦＥＣＴＩＮ转染ＣＶ－１细胞,以ＰＣＲ,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法鉴定重组痘苗病毒。结果：通过ｔｋ＾－筛选、ＰＣＲ鉴定,得了第６１位突变Ｎ－ｒａｓ／６１基因的重组痘苗病毒ｒＶ－Ｎ－ｒａｓ／６１,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测其在ＣＶ－１细胞中有表达。结论：目前对突变ｒａｓ基因的研究多着重于机理方面,本研究对研制有效的突变ｒａｓ基因疫苗是一个有益的尝试,其免疫治疗作用有待于进一步研究。     

CEA-重组痘苗病毒对CEA阳性肿瘤疗效的实验研究

目的:为探讨CEA-重组痘苗病毒对CEA阳性肿瘤的治疗作用.方法:构建CEA阳性小鼠Hepa肝癌细胞模型(Hepa-CEA);对4组实验鼠进行颈背部皮下注射CEA阳性或CEA阴性同源鼠Hepa肝癌细胞,再接种痘苗病毒(野生型W-VV或重组型CEA-rV)3次:观察动物反应,并在接种癌细胞后每周测量一次皮下肿瘤大小.结果:4组实验鼠颈背部皮下均可见瘤块形成,但3个对照组肿瘤生长迅速,组间差异无统计学意义(P>0.05),而接种Hepa-CEA/CEA-rV组小鼠皮下肿瘤生长缓慢,瘤块较小,与3个对照组比较有统计学上的显著差异(P<0.01),整个实验过程中接种鼠未表现有毒副反应,结论:CEA-rV可能通过诱导机体免疫系统产生CEA特异性的细胞或体液免疫应答反应,对CEA阳性肿瘤的生长明显产生抑制作用.     

CpG-ODN可增强痘苗病毒修饰的癌溶物的抗肿瘤效果

研究CpG联合非复制重组痘苗病毒在肿瘤免疫治疗中的效果。方法 :构建非复制重组痘苗病毒v△ 11β75 ,联合应用免疫刺激寡核苷酸和重组痘苗病毒v△ 11β75进行肿瘤免疫治疗。 结果 :重组痘苗病毒v△ 11β75在人源 143细胞中的不能正常繁殖 ,Southern blot证实痘苗病毒天坛株HindⅢC ,K片段间基因的缺失。在Wistar大鼠的Walker′s肿瘤模型中 ,联合应用CpG ODN和非复制痘苗病毒修饰的WRC2 5 6细胞裂解物进行免疫治疗 ,可以延长荷瘤鼠的生存期 ,肿瘤生长速度降低。结论 :CpG ODN可以增强非复制痘苗病毒修饰的肿瘤细胞裂解物的抗肿瘤治疗效果 ,为肿瘤免疫治疗提供了一种新的途径。     

肿瘤抗原MAGE与p53关系的研究进展

黑色素瘤抗原 (melanoma-associated antigen gene,MAGE）属于癌睾抗原 (cancer/testis antigen,CTA）,CTA在正常组织中仅限于睾丸和胎盘中表达,而在各种肿瘤组织中呈高表达。基于肿瘤特异性基因表达和基因结构的不同,MAGE家族被分为两个亚家族：MAGE-I和MAGE-II,目前研究较多的是MAGE-I。MAGE-I蛋白在细胞增殖的通路调节中发挥了重要的作用,其机制是一些MAGE-I蛋白通过控制p53肿瘤抑制因子的表达来促进肿瘤发生发展。在本文中,我们将讨论MAGE-I蛋白对p53转录活性的调控机制,及其对肿瘤治疗新策略的贡献进行综述。     

人癌胚抗原重组痘苗病毒在接种动物体内的表达

免疫治疗是肿瘤治疗的新模式［１］,主要通过一定技术增强肿瘤抗原或肿瘤相关抗原的免疫原性,诱导机体产生肿瘤特异性的免疫反应,杀伤肿瘤细胞。由于肿瘤细胞自身的复杂性和机体内多种因素的影响,诱发有效的肿瘤特异性免疫反应是免疫治疗的关键。肿瘤相关抗原是肿瘤免疫治疗的靶向物质基础,癌胚抗原（ＣＥＡ）是重要的肿瘤相关抗原［２］,９０％的胃肠道肿瘤,７０％的非小细胞性肺癌和５０％的乳腺癌中有高水平表达,上述肿瘤为ＣＥＡ表达型肿瘤。ＣＥＡ主要分布在细胞浆和胞膜,它的免疫原性很弱,无法激活机体产生ＣＥＡ特异性的免…     

重组腺病毒介导的人野生型p53、GM—CSF和B7—1基因在肝癌细胞中的表达

目的：观察腺病毒载体对肝癌细胞的转染效率及其介导的人野生型p53，GM－CSF和B7－1基因在肝癌细胞中的表达。方法：不同MOI的Ad-GFP感染肝癌细胞，48h后计算感染效率；BB－102以50MOI感染肝癌细胞，48h后免疫组化法及western blot检测p53表达，ELISA检测GM0CSF的含量，FACS测定B7－1的表达。结果MOI为50pfu/细胞时对肝癌细胞的转染效率达80％以上，目的基因均可在肝癌细胞中高效表达。结论：腺病毒载体对肝癌细胞具有较高的转染效率，目的基因均可在肝癌细胞中高效表达，为进一步研究BB－102在肝癌治疗中的应用奠定了基础。     

重组腺病毒介导的人野生型p53、GM-CSF和B7-1基因在肝癌细胞中的表达

 目的　观察腺病毒载体对肝癌细胞的转染效率及其介导的人野生型 p5 3、GM CSF和B7 1基因在肝癌细胞中的表达。方法　不同MOI的Ad GFP感染肝癌细胞 ,48h后计算感染效率 ;BB 1 0 2以5 0MOI感染肝癌细胞 ,48h后免疫组化法及westernblot检测 p5 3表达 ,ELISA检测GM CSF的含量 ,FACS测定B7 1的表达。结果　MOI为 5 0 pfu/细胞时对肝癌细胞的转染效率达 80 %以上 ,目的基因均可在肝癌细胞中高效表达。结论　腺病毒载体对肝癌细胞具有较高的转染效率 ,目的基因均可在肝癌细胞中高效表达 ,为进一步研究BB 1 0 2在肝癌治疗中的应用奠定了基础     

CEA-重组痘苗病毒预防CEA阳性肿瘤的动物实验研究

目的：探讨ＣＥＡ－重组痘苗病毒对ＣＥＡ阳性肿瘤的预防作用。方法：构建ＣＥＡ阳性小鼠Ｈｅｐａ肝癌细胞模型。将实验鼠分为４组,先分别皮下接种痘苗病毒３次,再分别颈背部皮下注射ＣＥＡ阳性或ＣＥＡ阴性同源鼠Ｈｅｐａ肝癌细胞。观察动物反应并在接种癌细胞后每周测量一次肿瘤大小。结果：３个对照组各级部皮下均可见有瘤块形成,并且以相近速度快速增长,３组之间无统计学上的显著差异,而接种ＣＥＡ－ｒＶ／Ｈｅｐａ－ＣＥＡ     

IL-2重组痘苗病毒修饰的肿瘤细胞破碎物局部应用后的抗肿瘤作用研究

细胞因子基因转染的瘤苗在体内具有明显的抗肿瘤作用,但逆转录病毒载体转染的肿瘤细胞作为瘤苗在制备及保存上仍然存在不足。本文采用编码人IL-2基因的重组痘苗病毒载体(rVV-IL-2)转染B16-F10小鼠黑色素瘤细胞,经超声破碎及高速离心,制成IL-2基因转染的肿瘤细胞破碎物(IL-2VBO),以此作为瘤苗,局部注射治疗荷瘤小鼠,结果明显抑制了小鼠肿瘤的生长,延长其存活期,外周血淋巴细胞对B16-F10细胞的杀伤活性明显增高,而对YAC-1细胞的杀伤活性则增加不明显,表明IL--2VBO诱导了机体对B16-F10特异性的免疫功能。由于IL-2VBO制备方便,易于保存,同时由于痘苗病毒本身可加强诱导出的免疫反应,因此可望作为一种新的瘤苗应用于肿瘤的主动性免疫治疗。     

抗胃癌生物活性肽对荷胃癌裸鼠酯酶同工酶代谢的影响

本文观察了协同刺激分子B7-1某因导入小鼠EL-4淋巴瘤细胞后在小鼠体内诱导的抗瘤效应.结果表明,逆转录病毒(PLXSN)载体重组的小鼠B7-1基因表达质粒导入小鼠EL-4淋巴瘤细胞,经有限稀释法克隆后获得高表达的B7-1~ EL-4细胞.B7-1~ 瘤细胞的形态,体外增殖能力及MHC Ⅰ类分子表达水平与野生型肿瘤细胞无显著差别,但致瘤性显著降低,用野生型肿瘤致死剂量接种C57BL/6小鼠完全排斥.同时免疫原性明显增强,以X-线灭活的B7-1~ 肿瘤细胞免疫后小鼠获得了对随后致死剂量野生型细胞攻击的免疫保护作用.以X-线灭活的肿瘤细胞作为瘤苗进行实验性免疫治疗,对早期(接种7天)形成的肿瘤有一定的治疗效果,但时晚期(接种14天)肿瘤.B7-1和B7-1~ 瘤细胞都未显示出明显的治疗效果.上述结果提示肿瘤细胞表达B7-1分子可有效激发机体的抗肿瘤免疫应答.     

趋化因子MCP-3协同B7诱导小鼠抗宫颈癌的主动免疫效果

目的：探讨趋化因子MCP－3能否增强B7基因诱导小鼠抗宫颈癌主动免疫的效果。方法：实验组：将pCMV/MCP-3以基因药物的方式肌注615小鼠,同时用B7^ U14细胞疫苗在同一部位免疫小鼠,再将野生型U14移植入已免疫的小鼠。对照组A：用B7^ U14细胞疫苗＋生理盐水同时免疫615系小鼠;对照组B：用pCMV/MCP-3＋野生型U14免疫小鼠;其它处理同治疗组。观察3组小鼠的成瘤情况、生存期。用以上3种方案分别处理小鼠,2周后分别取脾T淋巴细胞用MTT法体外检测其对U14的杀伤率。结果：经方差分析比较3组在移植U14后不同时程瘤体平均体积有显著性差异（P＝91．86,P＜0．001）。3组平均生存期分别为100,63,37d,经Kaplan-Meier曲线比较,差异具显著性（P＜0．01）。体外检测经MCP－3和BU^ U14疫苗处理的小鼠,其T淋巴细胞在不同效靶比对U14的杀伤效率均明显高于经MCP－3和U14疫苗处理者（F＝40．62,P＜0．001）。结论：因子MPC－3能增强B7基因修饰的U14细胞疫苗的抗肿瘤效果,其增强作用需疫苗有B7的表达为前提。     

胃癌中B7-H4和B7-H3的表达及薏苡仁酯对表达的影响

目的：探讨共刺激分子B7-H4和B7-H3在胃癌中的表达,以及薏苡仁酯对这两种分子表达的影响。方法：应用免疫组织化学染色检测胃癌组织中B7-H4蛋白的表达,MTT法检测薏苡仁酯对胃癌细胞株BGC-823的生长抑制效应,RT-PCR检测胃癌组织、胃癌细胞株BGC-823中B7-H4mRNA及B7-H3mRNA的表达,Western Blot检测细胞的B7-H4蛋白及B7-H3蛋白的表达。结果：B7-H4蛋白在80例胃癌组织中有60例阳性表达,阳性率75%。B7-H4蛋白的表达与患者性别、年龄、组织类型、肿瘤大小、淋巴结转移、病理分期、浸润深度无关（P〉0.05）。在20例胃癌组织中,B7-H4mRNA表达明显高于癌旁正常组织,B7-H3mRNA表达明显低于癌旁正常组织（P〈0.01）。薏苡仁酯可抑制胃癌细胞株BGC-823的生长,呈时间-剂量依赖性,并下调B7-H4 mRNA及蛋白的表达,上调B7-H3mRNA及蛋白的表达（P〈0.01）。结论：B7-H4和B7-H3在胃癌异常的表达,可能是肿瘤免疫逃逸的原因之一;薏苡仁酯可影响胃癌细胞B7-H4、B7-H3的表达。     

胃癌中B7-H4和B7-H3的表达及薏苡仁酯对表达的影响

目的:探讨共刺激分子B7-H4和B7-H3在胃癌中的表达,以及薏苡仁酯对这两种分子表达的影响。方法:应用免疫组织化学染色检测胃癌组织中B7-H4蛋白的表达,MTT法检测薏苡仁酯对胃癌细胞株BGC-823的生长抑制效应,RT-PCR检测胃癌组织、胃癌细胞株BGC-823中B7-H4mRNA及B7-H3mRNA的表达,Western Blot检测细胞的B7-H4蛋白及B7-H3蛋白的表达。结果:B7-H4蛋白在80例胃癌组织中有60例阳性表达,阳性率75%。B7-H4蛋白的表达与患者性别、年龄、组织类型、肿瘤大小、淋巴结转移、病理分期、浸润深度无关(P>0.05)。在20例胃癌组织中,B7-H4mRNA表达明显高于癌旁正常组织,B7-H3mRNA表达明显低于癌旁正常组织(P<0.01)。薏苡仁酯可抑制胃癌细胞株BGC-823的生长,呈时间-剂量依赖性,并下调B7-H4 mRNA及蛋白的表达,上调B7-H3mRNA及蛋白的表达(P<0.01)。结论:B7-H4和B7-H3在胃癌异常的表达,可能是肿瘤免疫逃逸的原因之一;薏苡仁酯可影响胃癌细胞B7-H4、B7-H3的表达。     

B7基因修饰的肿瘤细胞诱导抗大肠癌主动免疫

目的：研究Ｂ７基因修饰的肿瘤细胞诱导抗大肠癌ＣＴＬ的活化。方法：采用电击法将Ｂ７基因导入小鼠大肠癌细胞ＣＭＴ９３,Ｇ４１８筛选阳性克隆,免疫组化显示Ｂ７分子有高效表达,Ｂ７,ＣＭＴ９３（ＣＭＴ９３－Ｂ７）接种于Ｃ５７ＢＬ／６小鼠背部皮下,其致瘤性显著下降,ＣＭＴ９３－Ｂ７致敏的小鼠对野生型瘤细胞具有免疫保护作用;用ＣＭＴ９３和ＣＭＴ９３－Ｂ７细胞分别经腹腔免疫小鼠,得到腹腔浸润淋巴细胞及致敏脾细胞     

mB7－1基因转染小鼠黑色素瘤细胞诱导的抗瘤效应研究

目的：研究共刺激Ｂ７－１（ＣＤ６０）在诱导有效的抗肿瘤免疫反应反应中所起的作用。方法：在体外,三种肿瘤细胞与同上鼠脾淋巴细胞混合培养（ＭＬＴＣＳ）后,测定淋巴细胞增殖指数（ＭＴＴ法）和特异杀伤活性（ＬＤＨ释放改良法）;ＭＴＴＩ地测定肿瘤细胞体外增殖能力后,将Ｂ１６－ｎｅｏ和Ｂ１６－ｍＢ７－１妆种于Ｃ５７ＢＬ／６小鼠皮下后观察成瘤期、荷瘤小鼠存活以及肿瘤结节生长速度。结果：与野生型Ｂ１６细胞和模拟转     

小鼠肺癌B7疫苗细胞FLB2C诱导的抗肿瘤免疫应答

目的：研究小鼠肺癌细胞与活化B淋巴细胞融合的疫苗细胞FLB2c诱导细胞免疫反应情况。方法：用母本细胞LA795作对照，采用体外混合淋巴细胞培养，观察FLB2c细胞刺激T细胞增殖情况，通过CTLL细胞MTT法测定FLB2c刺激T细胞产生分泌IL－2的作用，用FLB2c免疫小鼠，观察疫苗体内诱导小鼠CTL活性的能力。结果：FLB2c细胞在体外刺激T细胞增殖的作用明显比LA795强；FLB2c能刺激T细胞分泌IL－2，而LA795则不能；FLB2c细胞在体内能诱导CTL活性，其诱导CTL在体外对FLB2c细胞和LA795的杀伤率分别为34％－25．3％，而LA795诱导的CTL对FLB2c和LA795杀伤率分别为10．5％和12．25％，两者的杀伤率有显著性差异。结论：FLB2c细胞在体内外均能刺激T细胞免疫应答，其以能力明显强于未融合的LA795小鼠肺癌细胞，将其作为疫苗细胞将有可能通过提高机体免疫应答而达到治疗肺癌的效果。本研究为进一步探讨该疫苗的应用价值奠定了免疫学基础。