人鼻咽癌紫杉醇耐药细胞系与其亲代细胞系比较基因组杂交研究

目的：比较基因组杂交（comparative genomic hybridization, CGH）是一种在荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridiza?tion,FISH）技术上发展起来的用于检测两个基因组间相对DNA拷贝数的改变（缺失或扩增）, 并将这些变化在染色体上进行定位的分子细胞遗传学方法。为了解鼻咽癌紫杉醇耐药细胞 （CNE1/Taxol, HNE2/Taxol, 5-8F/Taxol）与亲代细胞（CNE1, HNE2, 5-8F）在基因组DNA水平上可能存在的差异, 以及这种差异在肿瘤获得性耐药产生中的意义, 采用CGH技术对鼻咽癌紫杉醇耐药细胞与亲本细胞的基因组DNA进行检测和分析。方法：三株鼻咽癌紫杉醇耐药细胞采用大剂量冲击与剂量逐渐递加相结合的方法诱导而成。采用集落形成实验测定药物的敏感性,利用比较基因组杂交技术 （CGH） 对耐药细胞和其亲本细胞的基因组DNA进行检测和分析, 比较耐药细胞与亲本细胞在染色体扩增与缺失上的共同点和差异。结果：三株鼻咽癌紫杉醇耐药细胞耐药指数分别为8.43、 8.27和5.26。鼻咽癌亲本细胞存在广泛的染色体改变,主要表现在3q21-qter, 5p13-pter, 12和20q11-qter的共同扩增以及10q11-qter, 18和X染色体的共同缺失,从亲本细胞系诱导的三株鼻咽癌紫杉醇耐药细胞系表现为3q21-qter, 5p13-pter, 12,20q11-qter和8q21-qter的共同扩增, 无明显共同缺失区域。与亲本细胞共同扩增区域相比, 其中最有意义的是8q21-qter区域在三株耐药细胞中出现了新的共同扩增。结论： 3q21-qter, 5p13-pter, 12和20q11-qter的共同扩增以及10q11-qter,18和X染色体的共同缺失可能与鼻咽癌的发生有关, 而8q21-qter染色体扩增可能与鼻咽癌获得性紫杉醇耐药相关,对这些区域的进一步研究, 有可能为肿瘤发生及耐药机制研究提供新的线索。     

卵巢癌顺铂耐药细胞系及其亲代细胞的比较基因组杂交研究

目的：探讨人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP及其药物敏感细胞株COC1在基因组DNA水平上可能存在的差异,以及这种差异在肿瘤耐药性产生中的意义.方法：采用比较基因组杂交技术分析COC1和COC1/DDP两组癌细胞间基因组的不平衡,即DNA丢失或扩增.结果：COC1细胞系具有广泛的染色体改变,染色体出现扩增的有1p21-31、2q14-24、3q25-29、8q22-24、12p11-12、19p12q12、20q12-13,出现缺失的染色体有4、13q22-31、18q12-21.COC1/DDP细胞系也有较广泛的染色体改变,出现扩增的有6q21-24、17q21-25、18q21-23,出现缺失的有10q11-22、16q12-22、17p11-12.结论：卵巢癌耐药及亲本细胞中存在着广泛的染色体变异,其中6q、17q、18q、10q、16q、17p中的一些已知或未知基因可能参与COC1/DDP耐药性的产生.     

利用比较基因组杂交技术分析腺泡状横纹肌肉瘤染色体的变化特征

目的 探讨腺泡状横纹肌肉瘤(ARMS)基因组DNA的变化特征.方法 采用一步法逆转录聚合酶链反应,检测10例原发性ARMS患者标本中PAX3-FKHR和PAX7-FKHR融合基因的mRNA表达.采用比较基因组杂交(CGH)技术,分析ARMS染色体基因组的变化特征.根据融合基因的表达情况以及患者的临床病理特征进行分组比较.同时收集ARMS细胞株A204作为对照.结果 10例原发性ARMS患者标本中,PAX3-FKHR融合基因表达6例,PAX7-FKHR融合基因表达2例,2例未检测到融合基因表达.CGH分析结果 显示,10例ARMS标本中,基因组DNA扩增频率最高的染色体臂为12q,占70.0%;其他依次为2p、6p、6q、10q、2q、4q、15q、1p、9q、14q和18q,均≥30.0%;其中常见的最小重叠扩增区段为12q13、2p24、6p21和2q31.基因组DNA缺失频率最高的染色体臂是3p、6p、20q和21q,均>30.0%;缺失部位比较分散,最小重叠缺失区段无集中趋势.伴有融合基因表达的8例ARMS标本中,基因组DNA扩增频率最高的染色体臂是12q,占87.5%;其他依次为10q、2p、2q、6p、6q、1p、4q、8q、11q、14q和15q,均>30.0%.基因组DNA缺失频率最高的染色体臂是3p、5q、6p、1q、8p、11p、20q和21q,均>30.0%.ARMS的染色体改变与组织学分级、临床分期、年龄和性别均无关(均P>0.05).结论 12q、2p、6p、6q、10q、2q、4q、15q、1p、9q、14q和18q的扩增以及3p、6p、20q和21q的缺失可能与ARMS的发病相关,12q的扩增还可能与PAX3-FKHR和PAX7-FKHR融合基因的表达相关.     

染色体2p22的过度扩增及hmsh2基因的高表达与卵巢癌紫杉醇耐药相关性的研究

目的研究染色体特定区域DNA拷贝改变、基因差异表达及其与紫杉醇耐药的关系。方法运用比较基因组杂交(comparativegenomichybridization,CGH)及RTPCR技术,分析卵巢癌紫杉醇耐药株染色体基因组变化和hmsh2基因在卵巢癌组织中的表达。结果CGH结果显示最有意义的变化是卵巢癌紫杉醇耐药株OC3/Tax300细胞染色体2p22过度扩增。RTPCR检测发现hmsh2基因在OC3/Tax300细胞高度表达。hmsh2基因表达阳性率在组1和组2分别为93.9%(31/33)及47.6%(10/21),差异有显著性;在低分化癌为93.3%,显著高于中、高分化癌的54.2%。结论2p22拷贝数的过度扩增及hmsh2基因的高度表达可能与卵巢癌紫杉醇耐药相关。     

用比较基因组杂交技术研究弥漫大B细胞淋巴瘤分子细胞遗传学异常及其意义

背景与目的：弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是非霍杰金淋巴瘤（NHL）中最常见的一种类型，发病机制较为复杂，且预后较差。为了从基因组水平全面理解DLBCL的分子异常，本研究采用比较基因组杂交技术（CGH）研究DLBCL的分子细胞遗传学异常，探讨DLBCL的分子细胞遗传学异常与临床特征的相关性。方法：采用CGH技术对24例DLBCL患者的全基因组遗传物质的扩增／缺失进行检测，分析CGH检测结果与DLBCL的临床特征及生存期的相关性。结果：24例DLBCL中62．5％病例发生染色体水平的扩增／缺失，20．8％病例发生累及6q的缺失，16．7％病例发生累及18q扩增；CGH检测异常组与正常组比较：CGH异常组患者Annarbor分期多为Ⅲ／Ⅳ期，出现全身症状的机率较高，治疗疗效较差，生存期较短，但2组结外累及发生机率差异无显著性。结论：基因组水平发生的遗传物质扩增／缺失是DLBCL常见的分子细胞遗传学异常；6q15—21缺失和18q11-ter扩增是DLBCL非随机分子细胞遗传学异常；CGH检测异常是DLBCL不良临床过程和预后标志。     

人鼻咽癌多药耐药细胞CNE2/DDP与亲本细胞CNE2的生物学特性差异研究

目的:观察人鼻咽癌多药耐药细胞CNE2/DDP与亲本细胞CNE2的生物学特性差异,分析耐药细胞的特点。方法:比较两者在光镜下的形态、生长特点及体外克隆形成率的差异;流式细胞术分析两者细胞周期分布的变化、多药耐药蛋白P-170及ABCG2表达差异;采用MTT法分析耐药谱;动物实验观察两者成瘤差异。结果:光镜下CNE2/DDP细胞呈圆形,CNE2细胞呈多边形;CNE2/DDP生长相对缓慢;CNE2/DDP、CNE2细胞群体倍增时间分别为29.46 h、21.03 h;CNE2/DDP、CNE2细胞G0/G1期分别为(65.77±0.81)%、(44.9±2.21)%,S期分别为(23.63±0.42)%、(39.67±1.27)%,G2/M分别为(10.93±0.25)%、(13.23±0.31)%,两者相比差异均有显著性统计学意义(P<0.01)。CNE2/DDP、CNE2细胞的P-170和ABCG2表达率分别为(75.93±0.86)%、(2.83±0.40)%和(43.37±0.42)%、(4.07±0.59)%,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)。MTT法耐药谱分析表明,CNE2/DDP细胞成瘤前、后对DDP及5氟-尿嘧啶长春新碱(VCR)的耐药指数差异均无统计学意义。动物实验表明,1×106个CNE2/DDP、CNE2细胞皮下接种BALB/c裸鼠均成瘤,CNE2组肿瘤生长迅速。结论:CNE2/DDP细胞株具有多药耐药的特点,可用于耐药鼻咽癌的研究。     

肝母细胞瘤基因组不平衡性与染色体变异

目的建立稳定的比较基因组杂交（CGH）技术,探讨肝母细胞瘤（HB）染色体1p36杂合性缺失（LOH）的特点。方法应用CGH检测30例HBDNA的丢失或扩增;应用聚合酶链反应-简单重复序列多态性（SSLP）方法,对30例HB中染色体1p36上6个微卫星的杂合子丢失进行检测。结果每例HB细胞染色体均有不同程度的变异,HB常见增益的染色体区域是1q、2q、2p、8q、8p、12q和22q,常见丢失的染色体区域为1P、4q、4p、16q、17p和18q。30例HB中,1号染色体上6个基因座发生LOH的总频率为63．3％（19／30）,其中D1S199为最高（66．7％）,其次为D1S450（46．7％）。结论HB存在多条染色体DNA拷贝数扩增或丢失的区域;HB在染色体1p36上存在广泛的LOH;染色体变异引起相应瘤基因扩增和抑癌基因的丢失可能参与了HB的发生、发展。     

人鼻咽癌顺铂耐药细胞系(CNE2/DDP)的建立及耐药相关基因的筛选

背景与目的：化疗是鼻咽癌最主要的辅助治疗手段,然而癌细胞耐药性的产生常常导致药物治疗的失败,因此,筛查鼻咽癌耐药相关基因,寻找逆转药物耐受的分子靶点具有重要的现实意义。本研究首先用鼻咽癌药物敏感细胞CNE2作为亲本细胞诱导建立耐药细胞系,并在此基础上,筛选鼻咽癌耐药相关基因,探讨耐药性产生的分子机制。方法：以顺铂（cisplatin,DDP)为诱导剂,采用大剂量冲击与剂量逐渐递加相结合的方法,诱导建立人鼻咽癌耐药细胞系CNE2／DDP。采用MTT法测定药物的敏感性,流式细胞术测定细胞周期及细胞内荧光物罗丹明的蓄积,并进行细胞生长曲线测绘,倍增时间测定及细胞形态学观察。随后,采用基于PCR技术改良的消减杂交法筛选并耐药相关基因,反向点杂交鉴定排除假阳性,DNA测序分析差异表达片段,RT－PCR对差异表达的基因片段做进一步验证。结果：所建立的人鼻咽癌耐药细胞系CNE2／DDP对DDP的耐药指数为27．9,对5－氟尿嘧啶（5－fluorouracil,5-FU)及长春新碱（vincristine,VCR)的耐药指数分别可达227．9和55．5,表明其具有多药耐药的特征,流式细胞测定显示耐药细胞内罗丹明的蓄积明显低于敏感细胞（12．98vs,243.62),镜下观察耐药细胞体积变小,形态变圆,细胞倍增时间明显延长（26hvs,19h)。消减杂交发现了6个差异表达的基因片段,其序列与人已知基因均有部分同源性,其中3个在耐药细胞中高表达,3个在耐药细胞中表达下调。高表达的序列中有一个是功能未知的恶性肿瘤相关基因,有完整的开放读码框,其编码产物是含有79个氨基酸的DC13蛋白,其余两个序列分别是泛素C基因和线粒体编码基因NADH脱氢酶亚单位2（NADH dehydrogenase subunit 2,ND2)。表达被抑制的基因序列分别是细胞色素氧化酶亚单位1（cytochrome C oxidase subunit 1,COX1),核糖体蛋白大亚基27单体（ribosomal protein L27,RPL27)以及核体蛋白小亚基27单体（ribosomal protein S27,RPS28).结论：建立了稳定的人鼻咽癌耐药细胞系CNE2／DDP,为进一步研究恶性肿瘤的耐药机理建立了理想的耐药细胞模型,改良的消减杂交方法是克隆差异表达基因的有效方法,有多个功能已知和未知的基因如DC13,COX1及核糖核蛋白体基因等可能共同参与了鼻咽癌耐药性的产生。     

采用比较基因组杂交方法分析原发性食管癌染色体异常

背景与目的:有研究表明原发性食管癌常有染色体的改变,包括染色体基因组异常扩增和缺失.比较基因组杂交技术可以显示这些染色体的异常变化.本实验采用比较基因组杂交技术研究和分析原发性食管癌染色体基因组的变化特点及其与预后的关系.方法:采用比较基因组杂交技术检测16例食管癌组织中染色体的异常改变,并分析染色体异常与预后的关系.研究的病例中7例食管癌术后2年内死亡(对照组),9例术后生存3年以上(生存组).结果:食管癌患者中多数染色体基因组发生改变,最常见的染色体基因组高扩增频率发生在1q/p,2q/p,3q,5q/p,8q/p,9q/p,11q/p,17和20q/p染色体区段上,在染色体1q/p,4p,9p,18q和xp中常见染色体基因缺失.染色体7q/p和19扩增频率和染色体4q/p和18q缺失频率,生存组与对照组间存在显著性差异.结论:食管癌患者染色体区段基因易发生异常扩增和缺失,生存组与对照组存在明显差异.     

array-CGH技术及其在肿瘤学中的应用和意义

人类肿瘤的发生和发展常与非随机性染色体异常(包括基因组缺失、获得、扩增和重排等)有关[1,2].比较基因组杂交(comparatlve genomlc hybridization,CGH)技术可以快速全面地分析肿瘤组织DNA拷贝数的变化,并在中期染色体上定位,对于肿瘤研究具有重要意义.但是,CGH至今未应用于临床,一个主要的障碍是使用中期染色体铺片作为杂交靶,其局限性为:⑴CGH的分辨率低,不能发现小于2Mb的DNA获得和缺失;⑵不能将DNA拷贝数变化与基因或基因标记物直接联系起来;⑶虽然可经计算机软件识别每条染色体,但仍需要经验丰富的人员进一步确定,这限制了CGH的自动化操作和高通量分析[3～5].为了克服CGH的局限性,人们发明了微阵列一比较基因组杂交(array-CGH,matrix-CGH)技术,将DNA克隆或cDNAs做成微阵列,代替中期染色体作为杂交靶,不仅使分辨率提高,甚至可以确定肿瘤相关基因并提供精确的定位[3,4,6～8].     

分子靶向药物诱导耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达

目的：探讨不同分子靶向药物对高表达与低表达ATP结合转运蛋白G超家族成员2（ATPbinding cassette superfamily G member 2,ABCG2）的人耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞（分别简写为ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP）表面NKG2D配体（natural killer group 2 member D ligands, NKG2DLs）表达的诱导作用及其对NK细胞杀伤敏感性的影响。方法：免疫磁珠法分选ABCG2 highCNE2/DDP、ABCG2lowCNE2/DDP细胞及NK细胞。流式细胞术检测分选细胞的纯度和不同分子靶向药物（硼替佐米、索拉非尼、舒尼替尼）处理前后ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达率。LDH释放法检测不同药物处理前后ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞对NK细胞杀伤的敏感性。结果：ABCG2 highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞表面ABCG2的表达率分别为（91.40±2.32）%和（1.70±0.24）%。分选后NK细胞中CD3-CD16+CD56+细胞的比例达90%以上。药物处理前,ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3呈弱表达;经不同分子靶向药物处理后,5种NKG2DLs的表达率均明显上升(P<001),以舒尼替尼处理后NKG2DLs的表达率升高最明显。随着NKG2DLs表达的上调,ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞对NK细胞杀伤的敏感性也随之升高。结论：不同分子靶向药物可诱导耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达,以舒尼替尼的诱导作用最强,且肿瘤细胞NKG2DLs的表达与其对NK细胞杀伤敏感性之间存在线性关系。     

三种食管鳞癌细胞系的染色体异常研究

目的:分析食管鳞癌(ESCC)细胞系的染色体异常,为将来寻找食管癌相关基因提供线索。方法:采用比较基因组杂交法(CGH)分析3种ESCC细胞系的染色体DNA拷贝数改变情况。结果:9q(3/3)、3q(2/3)、5q(2/3)、5p(2/3)、8q(2/3)、12p(2/3)和20q(2/3)为常见的染色体增加区。4q(2/3)和6q(2/3)是常见的染色体丢失区。结论:这些常见的染色体异常有助于寻找和定位食管癌相关基因。     

舒尼替尼诱导耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞表达NKG2DLs的机制

目的：初步探讨舒尼替尼诱导高、低表达ABCG2(ATPbinding cassette superfamily G member 2)分子的耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞（简称ABCG2highCNE2/DDP细胞、ABCG2lowCNE2/DDP细胞）中NKG2D配体（natural killer group 2 member D ligands,NKG2DLs）表达的分子机制。方法：Caspase8活化试剂盒和线粒体膜电位法分别检测NK细胞处理后ABCG2highCNE2/DDP细胞和ABCG2lowCNE2/DDP细胞caspase8活化水平和线粒体膜电位。RTPCR检测舒尼替尼处理前后两种CNE2/DDP细胞DNA损伤修复系统相关信号分子mRNA的表达。结果：CNE2/DDP细胞+NK细胞组中两种CNE2/DDP细胞caspase8活性均明显增强;舒尼替尼处理后的ABCG2low CNE2/DDP细胞+NK细胞组和ABCG2highCNE2/DDP细胞＋NK细胞组中caspase8的活性是处理前的2～2.5倍（P<0.01）。舒尼替尼预处理后,CNE2/DDP细胞和NK细胞共培养体系中两种CNE2/DDP细胞的线粒体膜电位分别为(76.58±2.32)%和(73.11±1.93)%,较舒尼替尼处理前明显降低（P<0.05）。舒尼替尼可上调两种CNE2/DDP细胞中ATR、CHK1和CHK2 mRNA的表达,并诱导P53和NFκB mRNA的表达。结论：舒尼替尼可能通过激活DNA损伤修复系统相关信号分子和NFκB的表达,诱导耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达,同时经由死亡受体信号通路和线粒体信号通路增强NK细胞诱导的肿瘤细胞凋亡。     

采用对比基因杂交技术建立嗅神经母细胞瘤基因畸变模型

目的建立嗅神经母细胞瘤(ENB)的基因畸变模型并分析其特征。方法采用对比基因杂交(CGH)技术对12例原发、3例复发、7例转移ENB标本进行基因检测,用特殊软件系统对所采集照片的荧光信号进行量化分析,确定肿瘤DNA与正常对照DNA之间的基因差别。结果ENB常见DNA丢失主要见于1P、2q、3p／q、4p／q、5p／q、6q、8p／q、9p、10p／q、11P、12q、13q、18q和21q,DNA过度表达见于1p、7q、9q、1lq、14q、16p／q、17p／q、19p／q、20p／q和22p／q。ENB的1p21-p31DNA丢失与该类肿瘤患者预后差有明显相关性。死于ENB的患者均具有以下共性：1p21-p31DNA丢失、临床分期为C或D期、分化程度低(Ⅲ或Ⅳ级)。对4例发生转移、复发的患者,将检测结果与其原发病灶基因畸变情况进行对比分析表明,转移、复发病灶与其原发病灶间具有高度的克隆一致性。结论采用CGH能建立ENB的典型基因畸变模型,该模型有助于解释此肿瘤的生物学特性并对其预后进行评估,并与神经母细胞瘤、小细胞肺癌以及头颈部鳞癌进行鉴别。     

Exploration of multigene, multistep and multi-pathway models of nasopharyngeal and colorectal carcinogenesis

Objective To construct tree models for nasopharyngeal carcinoma (MPC) and colorectal carcinoma (CC) and explore the oncogeneic process of NPC and CC. Methods Based on the software that Desper et al. developed, tree models were constructed for CC from the comparative genomic hybridization (CGH) data of 118 CC patients and for NPC from the CGH data of 140 southern Chinese patients, respectively. Results Tree models for CC suggested that loss of 18q and gain of 20q were important early events in colorectal carcinogenesis. As changes in - 18q occurred prior to those in —17p, a cause-effect relationship might exist between them. Tree models for NPC suggested that loss of 3p was an important early event in nasopharyngeal carcinogenesis, and deletion of 11q. 14q. 16q and 9p were also nonrandom genetic events in carcinogenesis. suggesting that there might be tumor -associated genes existing on these chromosome arms. The tree model also indicated the existence of oncogenes on the short arm of chromosome 12. Conclusion Constructing tree models based on the CGH data to demonstrate the initiation and progression of NPC might help elucidate its multigene, multistep and muitipathway development. It may provide valuable clues to explore the mechanism of tumorigenesis. This work was supported by the grant from the Ministry of Science and Technology Key Basis Research Program(973) (Grant. 1998051201)     

Exploration of Multigene, Mulfistep and Multipathway Models of Nasopharyngeal and Colorectal Carcinogenesis

OBJECTIVE To construct tree models for nasopharyngeal carcinoma (NPC) and colorectal carcinoma (CC) and explore the oncogeneic process of NPC and CC .METHODS Based on the software that Desper et al. developed, tree models were constructed for CC from the comparative genomic hybridization (CGH) data of 118 CC patients and for NPC from the CGH data of 140 southern Chinese patients, respectively. RESULTS Tree models for CC suggested that loss of 18q and gain of 20q were important early events in colorectal carcinogenesis. As changes in -18q occurred prior to those in -17p, a cause-effect relationship might exist between them. Tree models for NPC suggested that loss of 3p was an important early event in nasopharyngeal carcinogenesis, and deletion of 11q, 14q, 16q and 9p were also nonrandom genetic events in carcinogenesis, suggesting that there might be tumor-associated genes existing on these chromosome arms. The tree model also indicated the existence of oncogenes on the short arm of chromosome 12.CONCLUSION Constructing tree models based on the CGH data to demonstrate the initiation and progression of NPC might help elucidate its multigene, multistep and multipathway development. It may provide valuable clues to explore the mechanism of tumorigenesis.