柯萨奇B3病毒对HL-1心肌细胞的影响

目的探讨柯萨奇B3病毒对HL-1心肌细胞影响。方法实时荧光聚合酶链反应检测柯萨奇B3病毒感染的HL-1心肌细胞Bcl-2及Bax的表达：Annexin V-PE凋亡检测试剂盒检测感染的HL-1心肌细胞发生凋亡的比率,并与未感染心肌细胞进行对比。结果感染后4h组（0．199±0．005vs0．104±0．014,P=0．0008）及24h组（0．154±0．005vs0．1044-0．014．P=0．0176）的Bel－2／Bax表达均显著高于未感染组,差异有统计学意义。感染后4h组的Bel-2／Bax表达高于感染后24h组,差异有统计学意义（0．199±0．005孤0．154±0．005,P=0．0009）。感染后4h组（9．160％±0．161％vs．0．908％±0．015％,P〈0．0001）、12h组（6．305％±0．231％vs．0．908％±0．015％．P〈0．0001）、24h组（3．260％±0．162％vs0．908％±0．015％,P〈0．0001）的心肌细胞凋亡率显著高于未感染组,差异均有统计学意义。感染后4h组的心肌细胞凋亡率高于感染后12h组（9．160％±0．161％vs．6．305％±0．231％．P〈0．0001）和24h组（9．160％±0．161％vs．3．260％±0．162％,P〈0．0001）,差异均有统计学意义。结论柯萨奇B3病毒导致HL-1心肌细胞的凋亡,在感染4h后增加尤为明显。     

黄芪甲甙对小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎的抗氧化作用

目的观察黄芪甲甙对小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎的抗氧化作用。方法Balb/c小鼠50只随机分5组(每组10只),空白对照组腹腔无菌注射不含病毒的Eagle’s培养基0.1 mL,在腹腔注射病毒培养基30 min后,以生理盐水0.1 mL灌胃,共7d;病毒性心肌炎对照组小鼠每只腹腔注射0.1 mL内含1×102TCID50柯萨奇B3病毒的Eagle’s培养基,在腹腔注射含病毒的Eagle’s培养基30 min后,以生理盐水0.1 mL灌胃,共7 d;黄芪甲甙低、中、高剂量干预组在腹腔注射病毒30 min后,用黄芪甲甙剂量分别为0.07、0.2、0.6 g/(kg.d)0.1 mL灌胃,共7 d。观察小鼠生存数;心肌病变积分;心肌谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力及逆转录聚合酶链反应检测铜锌超氧化物歧化酶-mRNA水平表达。结果(1)与空白对照组比较,病毒性心肌炎对照组小鼠的生存数明显下降,心肌病变积分明显升高(3.23±0.83,P<0.01);与病毒性心肌炎对照组比较,黄芪甲甙高剂量干预组可明显提高小鼠的生存数(P<0.01),心肌病变积分明显下降(1.86±0.59比3.23±0.83,P<0.01);(2)与病毒性心肌炎对照组比较,黄芪甲甙高剂量干预组心肌组织谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力呈增高趋势,心肌组织谷胱甘肽过氧化物酶(39.73±8.02比9.99±2.71,P<0.05)、过氧化氢酶(6.35±2.33比1.36±0.87,P<0.05)、超氧化物歧化酶(65.71±4.93比40.15±6.03,P<0.01)活力明显增强,铜—锌超氧化物歧化酶-mRNA水平表达明显增高(0.43±0.11比0.32±0.01,P<0.01)。但黄芪甲甙低、中剂量干预组,虽然也在一定程度使心肌组织谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力及逆转录聚合酶链反应检测铜—锌超氧化物歧化酶-mRNA表达水平增加,有一定的量效关系,但与病毒性心肌炎对照组比较无统计学意义(P>0.05)。结论黄芪甲甙通过增加心肌抗氧化酶活力,对小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎具有明显的保护作用。     

苦瓜蛋白对BALB/C小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎核因子κB的调节作用

为探讨苦瓜蛋白对BALB／C小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎的治疗作用机制，以核因子κB为对象，来观察苦瓜蛋白的调节作用。从苦瓜果肉中提取苦瓜蛋白后，将动物分为5组：病毒对照组、正常对照组、药物对照组、高剂量治疗组、低剂量治疗组，分别在实验的第0d,3d,7d,14d和第21d处死动物，提取核蛋白，在用BCA方法进行蛋白定量后作凝胶滞留分析（EMSA），测定核因子κB的活性，并进行比较分析。结果发现：（1）病毒对照组在第21天时仍然有一定量的核因子κB活化，且其活化程度明显高于正常对照组；（2）高、低剂量的苦瓜蛋白对核因子κB表现出不同程度的抑制作用，其中高剂量组核因子κB几乎看不到活化，低剂量组比病毒对照组核因子κB活化程度明显降低；（3）正常对照组和药物对照组核因子κB只有低水平活化。结果提示，苦瓜蛋白对病毒性心肌炎的治疗作用可能与其降低核因子κB的活性有关。     

抗柯注射液对柯萨奇B3病毒感染小鼠自然杀伤细胞活性的影响

目的 :检测 BAL B/ c小鼠在感染柯萨奇 (cox) B3病毒后自然杀伤 (NK)细胞活性的动态变化以及抗柯注射液 (RSF)对其影响。方法 :将小鼠分为正常对照组、病毒对照组、10 m g/ kg RSF组、2 0 mg/ kg RSF组和 30m g/ kg RSF组 ,每组 17只 ,分别在病毒感染后第 3天、8天、12天用乳酸脱氢酶释放法 ,检测各组小鼠外周血的NK细胞活性 ,并将心脏行组织病理检查。结果 :病毒感染后第 3天 NK细胞活性显著升高 (6 7.11± 2 .5 2 ) % ,之后进行性下降 ,第 12天时低于正常 [(42 .2 6± 1.6 1) %∶ (47.79± 4.0 3) % ];RSF对 cox B3病毒感染小鼠的 NK细胞活性有双向调节作用。大剂量 (2 0 mg/ kg和 30 mg/ kg) RSF在第 3天时对增高的 NK细胞活性有抑制作用 ,第 12天时可使降低的 NK细胞活性恢复至正常水平 ;小剂量 (10 mg/ kg) RSF在第 3天时对增高的 NK活性无抑制作用 ,但第 12天时也能使降低的 NK活性恢复至正常。病毒感染第 8天时心肌病变最重 ,小剂量 RSF组心肌病变改善较少 ,大剂量 RSF组改善明显。结论 :RSF调节 cox B3病毒感染后机体的 NK细胞活性可能是其防治病毒性心肌炎的重要机制之一。     

黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒感染心肌细胞动作电位的作用

目的探讨黄芪总黄酮（TFA）对嗜心性柯萨奇B3病毒（CVB3m）感染心肌细胞动作电位的作用。方法采用体外培养小鼠新生心肌细胞方法,建立柯萨奇B3病毒感染心肌细胞模型,应用膜片钳技术中电流钳记录柯萨奇B3病毒感染心肌细胞动作电位。结果应用TFA组与柯萨奇B3病毒感染模型组相比较,动作电位幅值（APA）下降,差异有统计学意义（P=0．0065,n=8）,动作电位时程（APD）明显延长（P=0．00724,n=8）。结论黄芪总黄酮可显著降低柯萨奇B3病毒感染心肌细胞动作电位幅值（APA）,延长动作电位时程（APD）。     

黄芪、红景天、FTY720对柯萨奇病毒CVB3诱导小鼠病毒性心肌炎的药效学研究

目的：观察黄芪、红景天、FTY720作为单味药物对小鼠柯萨奇B3（CVB3）所致病毒性心肌炎（VMC）的治疗作用。方法：腹腔接种CVB3病毒液以建立VMC模型。随机分为空白组、VMC对照组、黄芪组、红景天组、FTY720组，观察五组动物在心肌重／体重比值；心肌组织切片（HE染色）；心肌酶（LDH．CK-MB）活力改变差异。结果：在心肌重／体重上，给药组与VMC对照组间无显著性差异（P〉0．05）；显微镜下观察心肌组织切片，VMC对照组局部可见广泛增生纤维组织，小鼠淋巴单核细胞浸润严重。药物干预组仅有淋巴单核细胞浸润，无纤维组织增生，空白对照组无病理性组织变化；LDH的活性测定显示黄芪组、红景天、FTY720组酶活性明显降低与VMC对照组有显著性差异（P〈0．01、P〈0．05）。CK-MB测定结果表明黄芪、红景天、FTY720组与VMC对照组有显著性差异（P〈0．01、P〈0．05）。结论：黄芪、红景天、FTY720对CVB，诱导小鼠急性病毒性心肌炎有一定治疗作用。     

柯萨奇B3病毒感染小鼠心肌硫氧还蛋白的表达

目的研究硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)在柯萨奇B3病毒感染小鼠心肌炎模型中表达的变化,探讨Trx在病毒性心肌损伤中的作用。方法建立柯萨奇B3病毒感染鼠心肌炎模型,采用光镜检测心肌形态改变,应用RT鄄PCR技术比较接种病毒后不同时间点(7,14,21d)TrxmRNA表达变化。结果7d时心肌病损严重;14d时部分心肌病损开始修复;21d时心肌修复较完全。接种病毒后21d时,硫氧还蛋白mRNA表达与对照组比较明显上调(P<0.01),7d和14d时同对照组相比表达无显著性差异(P>0.05)。结论在急性柯萨奇B3病毒性心肌炎中,Trx可能被急性炎症刺激素特异地诱导,在疾病的后期TrxmRNA表达上调,促进心肌修复,提示适当剂量的Trx可能对急性柯萨奇B3病毒性心肌炎有潜在治疗作用。     

柯萨奇B3m病毒致小鼠急性心肌损伤的双向凝胶电泳分析

目的建立双向凝胶电泳体系分析柯萨奇B3m病毒(CVB3m)致小鼠急性心肌损伤过程中的蛋白质组差异,探讨CVB3m致心肌损伤的机制。方法分别提取感染CVB3m第0,4,8及21天的BALB/C鼠心肌组织总蛋白,采取固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离总蛋白,用Image Master软件进行图像分析。结果心肌组织总蛋白平均抽提浓度为13.9 g/L;获得正常小鼠和急性CVB3m感染鼠不同感染时期(第4,8和21天)心肌组织双向电泳凝胶图谱,图像分析4块胶平均蛋白点数为(792±32)个,匹配率为61.25%±6.25%。随机选定不同感染时期的8个差异表达的蛋白质点,得到了表观相对分子质量和表观等电点等一系列数据。结论获得了CVB3m致小鼠急性心肌损伤的双向凝胶电泳图谱,建立了该模型的蛋白质双向凝胶电泳数据库,有利于该病毒引起小鼠心肌损伤机制的进一步研究。     

小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎心脏炎症细胞因子基因和蛋白表达及黄芪甲甙干预研究

目的 探讨黄芪甲甙对小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎心脏炎症细胞因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6和白细胞介素10 mRNA表达和蛋白质产生的影响.方法 Balb/c小鼠50只随机分为5组,空白对照组,腹腔无菌注射不含病毒的Eagle's培养基0.1 mL,在腹腔注射病毒培养基30 min后,以生理盐水0.1 mL灌胃,共7 d;病毒性心肌炎对照组,小鼠每只腹腔注射0.1 mL内含1×105TCID50柯萨奇B3病毒的Eagle's培养基,在腹腔注射含病毒的Earle's培养基30 min后,以生理盐水0.1 mL灌胃,共7 d;黄芪甲甙低、中、高剂量干预组,在腹腔注射病毒30 min后,用黄芪甲甙剂量分别为0.07、0.2和0.6 ms/(kg·d)0.1 mL灌胃,共7 d.14 d后处死全部小鼠并取其心脏.心脏组织一半用于逆转录聚合酶链反应法测定心脏细胞因子mRNA表达.另一半用Western blot测定细胞因子蛋白质生成量.结果 空白对照组上述细胞因子均无明显表达,心肌炎对照组肿瘤坏死因子α,白细胞介素1β,白细胞介素6和白细胞介素10 mRNA和蛋白产生均显著高于空白对照组;同心肌炎对照组比较,高剂量黄芪甲甙组的肿瘤坏死因子α,白细胞介素1β.白细胞介素6 mRNA和蛋白生成均显著下降,而白细胞介素10mRNA和蛋白明显升高.结论 黄芪甲甙明显降低小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎心脏的致炎症细胞因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6,而升高炎症保护因子白细胞介素10.     

柯萨奇病毒B3诱导病毒性心肌炎小鼠心肌细胞焦亡的实验研究

目的探讨柯萨奇病毒B3(CVB3)是否可通过诱导心肌发生细胞焦亡促进心肌炎的进展。方法采用CVB3感染Bal b/c小鼠构建病毒性心肌炎动物模型,分为对照组(10只)和实验组(20只)。对照组腹腔注射0.1 mL无菌生理盐水,实验组每只小鼠腹腔注射0.1 mL含10⁵半数组织培养感染剂量(TCID₅₀)CVB3病毒液,分别于感染后第3天、第7天随机选取10只小鼠,摘眼球收集全血,处死后摘取心脏。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中白细胞介素-1β(IL-1β)水平。采用实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测NLRP3炎性小体及半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)mRNA水平。采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测Caspase-1、半胱天冬氨酸蛋白酶酶原(pro-Caspase-1)蛋白表达水平。结果实验组第3天、第7天小鼠心肌组织中NLRP3炎性小体及Caspase-1 mRNA表达较对照组明显增加(P<0.05);pro-Caspase-1、Caspase-1的蛋白表达水平较对照组明显增加(P<0.05);血清IL-1β的表达较对照组明显增加(P<0.05)。结论CVB3可通过诱导心肌发生细胞焦亡促进心肌炎的进展。     

Effect of interleukin-15 on the course of myocarditis in Coxsackievirus B3-infected BALB/c mice

OBJECTIVE:

Cytokines have an important role in both the initiation and perpetuation of viral myocarditis. Because a causative therapy of myocarditis is not yet well established and immunomodulation is a promising approach, the influence of interleukin (IL)-15, a proinflammatory cytokine, on the course of experimental myocarditis in Coxsackievirus B3 (CVB3)-infected mice was examined.

METHODS:

Hearts from CVB3-infected (n=14), sham-infected (n=14) and CVB3-infected BALB/c mice treated with IL-15 (n=6) or a competitive IL-15 fusion protein (n=6) were analyzed for hemodynamic function, cellular infiltrates and myocardial collagen content.

RESULTS:

Induction of myocarditis was associated with significant loss of body and heart weight, decreased left ventricular function, and increased collagen content and cellular infiltrates in the myocardium. Treatment of infected animals with IL-15 resulted in normalization of body and heart weight, and significantly improved systolic and diastolic left ventricular function, comparable with that of uninfected animals. This was paralleled by a significant reduction of myocardial collagen content to levels observed in animals without disease and by markedly reduced cellular infiltration of lymphocytes and macrophages in the myocardium. Inhibition of intrinsic IL-15 with IL-15 fusion protein tended to aggravate the disease.

CONCLUSIONS:

Treatment with IL-15 has a positive effect on CVB3-induced murine myocarditis and seems to be a promising approach to modifying clinical course, hemodynamics and histopathology of virus-induced myocarditis. Further studies are needed to identify the underlying mechanisms.     

化学合成siRNA体外对柯萨奇B3病毒的影响

目的RNA干扰是近年来研究基因功能的重要工具。本研究是在培养HELA细胞中，体外化学合成siRNA（small interfering RNA）对柯萨奇B3病毒（Coxsackievirus B3，CVB3）的影响，探讨RNA干扰的抗病毒效应与其应用前景。方法根据siRNA靶序列设计原则，设计了一段针对编码CVB3病毒VP4蛋白基因组的siRNA，并在体外通过化学合成形成siRNA。同时合成一段与CVB基因组序列无关的阴性对照siRNA。用CVB3感染培养HELA细胞，将其分为3组，即siRNA组（n=8），阴性siRNA组（n=8），病毒对照组（n=8），分别观察转染后第1天到第5天的细胞病变，并与未感染CVB3的空白对照组进行比较；采用RT-PCR技术检测感染CVB3各组的病毒RNA片断，观察病毒RNA与内参GAPDH的OD比值；用免疫荧光技术检测各组CVB3蛋白的表达。结果RT-PCR检测各组CVB3病毒5’端非编码区（5’UTR）RNA，siRNA组与阴性siRNA组和病毒对照组比较无明显变化（P〉0．05）；免疫荧光检测各组CVB3病毒蛋白也未见显著差异；细胞病理效应（cytophatic effects，CPE）各组问未见明显差异。结论本文选择针对编码CVB3病毒VP4蛋白基因组的siRNA未能抑制CVB3病毒复制。     

BALB/C小鼠核小体H2B组蛋白Th细胞表位的鉴定

目的 鉴定正常BALB／C小鼠核小体。H2B组蛋白Th细胞表位。方法 根据小鼠H2B确切氨基酸组成序列，利用计算机软件预测可能的Th细胞表位，体外固相合成，然后分别刺激BALB/C小鼠淋巴细胞，根据其中的Th细胞增生程度和白细胞介素(IL)-2分泌水平，判断实验肽是否为具有免疫活性的表位。结果 共预测获得4条可能的核小体H2B组蛋白Th细胞表位，即H2B2-15、H2B14-28、H2B61-76和H2B99-113。其中H2B14-28能够明显刺激BALB／C小鼠Th淋巴细胞增生和分泌IL-2，且有明显剂量依赖关系。结论 H2B14-28可能为BALB/c小鼠核小体。H2B组蛋白Th细胞免疫优势表位之一。     

结核分枝杆菌感染对BALB/c小鼠B细胞发育分化的影响

目的 探讨结核分枝杆菌感染对小鼠B淋巴细胞分化发育的影响。方法 建立Mtb感染BALB/c小鼠模型,在感染早期(4周)及晚期(8周)分别取小鼠骨髓细胞及脾脏细胞,或经培养后,荧光抗体染色,用流式细胞术对感染早期及晚期小鼠的B细胞表型进行分析,设生理盐水处理的小鼠作为对照。结果 Mtb感染组与对照组比较,pro-B细胞(CD45R⁺CD43⁺)(4周:t=2.886,P<0.05)、未成熟B细胞(CD45R⁺IgM⁺IgD^-)(4周:t=4.760,P<0.05)减少,骨髓成熟B细胞(CD45R⁺IgM^+/-IgD⁺)(4周:t=-3.485,P<0.05;8周:t=-2.594,P<0.05)与脾脏成熟B细胞(CD45R⁺IgMlowIgDhi)(4周:t=-2.275,P<0.05;8周:t=-2.97,P<0.05)增多;小鼠脾脏B细胞活化分子CD69表达升高(4周:t=-2.271,P<0.05;8周:t=-2.052,P<0.05);小鼠脾脏记忆性B细胞 (CD45R⁺CD27⁺IgD^+/-)升高(4周:t=-4.203,P<0.05;8周:t=-5.280,P<0.05)。结论 Mtb感染能影响B细胞的分化发育,促使B细胞向成熟细胞分化,并能促使B细胞活化,使机体更有利于抗结核的感染。     

应用静脉及脾内注射法对BALB／C鼠免疫效果的初步探讨

本文报道用杜氏利什曼原虫前鞭毛体免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠，采用尾静脉注射三次，第四次和加强免疫则只剪开皮肤，直接刺入脾内注射前鞭毛体，每次注射虫体０．５～１×１０￣７只，每次免疫间隔２周，用ＢＡＬＢ／Ｃ鼠的脾细胞与ＳＰ２／Ｏ瘤细胞融合，再克隆技术获得２株杂交瘤细胞分别命名为１Ｆ＿７－Ｄ＿６和２Ａ＿２－Ｎ＿（１１），抗体滴度分别为１：５１２００，１：２０４８００以上，可见此法个仅免疫时间短，抗原用量少，且抗体效价高，用双向琼脂扩散法，亚类鉴定均为ＩｇＧ＿３。     

Coxsackievirus B3m与T-2毒素对小鼠脂质过氧化物代谢的影响

目的 探讨Ｔ－２毒素与ＣｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓＢ３ｍ的双重作用小鼠肝脏脂质过氧化物的影响。方法 实验采用析因设计，ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠随机分为４组，Ｉ正常对照组，ＩＩ病毒组，ⅢＴ－毒素组，Ⅳ病毒＋毒素组，病毒组常腹腔接种０．１ｍｌ内含１０００ＴＣＩＤ５０的１６４０营养液，毒素组隔日按１．０ｍｇ／ｋｇ体重Ｔ－２毒素灌胃，直至实验结束，病毒＋毒素组先Ｔ－２灌胃，３周后腹腔接种同稀释度病毒，各组鼠于病毒     

HIV-1 Env-Specific Memory and Germinal Center B Cells in C57BL/6 Mice

Continued efforts to define the immunogenic properties of the HIV-1 envelope glycoproteins (Env) are needed to elicit effective antibody (Ab) responses by vaccination. HIV-1 is a highly neutralization-resistant virus due to conformational and glycan shielding of conserved Ab determinants on the virus spike. Elicitation of broadly neutralizing Abs that bind poorly accessible epitope regions on Env is therefore extremely challenging and will likely require selective targeting of specific sub-determinants. To evaluate such approaches there is a pressing need for in vivo studies in both large and small animals, including mice. Currently, most mouse immunization studies are performed in the BALB/c strain; however, the C57BL/6 strain offers improved possibilities for mechanistic studies due to the availability of numerous knock-out strains on this genetic background. Here, we compared Env immunogenicity in BALB/c and C57BL/6 mice and found that the magnitude of the antigen-specific response was somewhat lower in C57BL/6 than in BALB/c mice by ELISA but not significantly different by B cell ELISpot measurements. We then established protocols for the isolation of single Env-specific memory B cells and germinal center (GC) B cells from immunized C57BL/6 mice to facilitate future studies of the elicited response at the monoclonal Ab level. We propose that these protocols can be used to gain an improved understanding of the early recruitment of Env-specific B cells to the GC as well as the archiving of such responses in the memory B cell pool following immunization.