垂盆草醇提物抑制HepG2细胞STAT-3信号通路诱导细胞凋亡的研究

目的:研究垂盆草醇提物对STAT-3信号通路的影响,及其诱导细胞凋亡的分子机制。方法:MTT法检测垂盆草醇提物对HepG2细胞增殖的影响;流式细胞术分析结合FITC-Annexin V/PI双标记检测对肝癌细胞凋亡的影响,免疫印迹试验检测细胞凋亡Caspase-3,Caspase-9,PARP,P-STAT-3(Tyr705),STAT-3,Bcl-2,Mcl-1相关蛋白表达水平。结果:垂盆草醇提物可明显抑制HepG2细胞的增殖,诱导HepG2细胞凋亡,且抑制作用呈剂量依赖效应。垂盆草醇提物作用后,抑制STAT-3信号转导通路,下调Mcl-1和Bcl-2的表达,引起凋亡相关蛋白Caspase-3,Caspase-9的降解/活化及PARP的降解,并呈剂量依赖效应。结论:垂盆草醇提物通过抑制STAT-3信号转导通路和Mcl-1和Bcl-2的表达,进而抑制HepG2细胞的增殖,诱导其凋亡。     

威灵仙水提物对阿霉素耐药的人甲状腺未分化癌细胞株HTh74Rdox的作用机制

目的:探讨威灵仙水提物对阿霉素诱导耐药的人甲状腺未分化癌细胞株HTh74Rdox增殖的影响及机制。方法:用不同浓度威灵仙水提物处理HTh74Rdox后观察细胞形态;噻唑蓝(MTT)比色法检测威灵仙水提物对HTh74Rdox细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测HTh74Rdox细胞凋亡;蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)及其活性片段(cleaved-Caspase-3),B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达。结果:威灵仙水提物对HTh74Rdox细胞的增殖有明显抑制作用,联合阿霉素后可减少阿霉素剂量;威灵仙水提物可显著诱导细胞凋亡(P0.01);且能明显提高cleaved-Caspase-3/Caspase-3,Bax/Bcl-2(P0.05)。结论:威灵仙水提物可以抑制HTh74Rdox细胞的增殖,其机制可能与提高cleaved-Caspase-3/Caspase-3,Bax/Bcl-2有关;联合化疗药物使用具有减毒增效的作用。     

25种中草药体外抑制鼻咽癌细胞增殖活性研究

目的:从用于鼻咽癌辅助治疗的中成药鼻咽清毒颗粒和广东民间用于治疗鼻咽部疾病的中药中选取25种中药,对它们进行抗鼻咽癌活性筛选,从中寻找具有进一步研究价值的抗鼻咽癌中药。方法:采用四甲基偶氮唑盐吸收减少实验(MTT法),测定25种中药的65个提取物,包括乙醇提取物、水提取物及部分挥发油,对鼻咽癌细胞CNE的体外增殖抑制作用。结果:65个提取物中,只有重楼的醇提物和地胆草的醇提物对CNE细胞显示出很好的增殖抑制作用,在100μg/mL时,两者对CNE的增殖抑制率分别为83.10%和66.50%;并且重楼和地胆草的醇提物对CNE细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为(31.73±0.032)μg/mL和(50.71±0.063)μg/mL。结论:重楼和地胆草的醇提物具有较强的体外抑制鼻咽癌细胞增殖活性,值得进一步研究。     

溪黄草水提物和醇提物体外抗肿瘤活性研究

目的:研究溪黄草(Rabdosia Serra)水提取物和醇提取物对人肝癌细胞(HepG2)、胃癌细胞(MKN-45)和食管癌细胞(TE-1)的增殖抑制作用,分析不同提取方式对肿瘤细胞增殖抑制强弱的差异。方法:采用高效液相色谱法(HPLC)建立溪黄草不同提取物的色谱图,MTT法检测溪黄草不同提取物对人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞MKN-45和人食管癌细胞TE-1细胞存活率的影响。结果:溪黄草水提物和醇提物的色谱图存在差异。溪黄草水提物在人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞MKN-45和人食管癌细胞TE-1的IC_(50)值分别是(2.05±0.19) mg/m L、(1.98±0.16) mg/m L和(1.65±0.18) mg/m L。溪黄草醇提物在上述三种细胞株的IC_(50)值分别是(0.93±0.07) mg/m L、(0.68±0.22) mg/m L和(0.63±0.06) mg/m L。溪黄草水提物和醇提物的IC_(50)值存在显著差异(P 0.01),且溪黄草醇提物的IC50值显著小于水提物。结论:两种提取物均具有与浓度相关的细胞体外抑制作用,且醇提物对细胞增殖抑制作用显著强于水提物。     

无尾果抗类风湿关节炎的有效部位筛选研究

目的观察无尾果不同提取部位对人风湿性关节炎成纤维滑膜细胞（MH7A）相关细胞因子分泌及凋亡的 影响,初步筛选其抗类风湿关节炎（RA）的有效部位。方法采用肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导MH7A 细胞建 立类风湿关节炎滑膜细胞模型,并以无尾果总提物、水部位、正丁醇部位、乙酸乙酯部位和石油醚部位进行干 预。采用CCK8 法检测MH7A 细胞的增殖活性,并计算半数抑制浓度（IC50）;流式细胞术检测MH7A 细胞凋 亡;ELISA 法检测TNF-α 诱导MH7A 细胞分泌白细胞介素（IL）-6、IL-4、IL-1β、血管内皮生长因子 （VEGF）、NF-κB 受体活化因子配体（RANKL）水平;Western Blot 法检测MH7A 细胞的凋亡相关蛋白表达水 平。结果无尾果总提物、水部位、正丁醇部位、乙酸乙酯部位和石油醚部位对MH7A 细胞的IC50 值分别为 223.9、99.4、123.7、497.9、＞1 000 μg·mL-1。与正常对照组比较,模型组细胞上清液中的IL-6、IL-1β、IL-4、 VEGF 和RANKL 含量显著升高（P＜0.01）,凋亡细胞显著增多（P＜0.01）,促调亡因子Bax、Caspase-9、 Caspase-3 和抗凋亡因子Bcl-2 的蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较,无尾果总提物组、水部 位组和正丁醇部位组均可显著诱导MH7A 细胞凋亡（P＜0.01）;显著降低IL-6、IL-1β、VEGF 和RANKL 水平 （P＜0.01）,升高IL-4 水平（P＜0.01）;水部位组和正丁醇部位组能明显上调促凋亡蛋白Bax、Caspase-9 和 Caspase-3 的表达（P＜0.01）,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达（P＜0.01）。结论无尾果提取物诱导MH7A 细胞 凋亡及抗炎作用可能是其抗RA 的机制之一,水部位和正丁醇部位为其主要药效部位。     

黄芪水提物抑制PI3K/Akt通路预防肺癌发生的作用及机制研究

目的探讨黄芪水提物对肺癌的抑制作用及相关机制。方法采用MTT实验、Ed U实验以及划痕实验检测黄芪水提物对肺癌A549和H1299细胞的活性、增殖能力和迁移能力的影响,采用流式细胞仪考察黄芪水提物对肺癌细胞周期的影响,通过Western blotting实验检测PI3K/Akt通路相关蛋白表达,通过苯并芘诱导的小鼠肺癌模型观察黄芪水提物对体内肺癌的影响。结果 MTT实验结果表明,黄芪水提物作用于A549和H1299细胞48 h后,细胞的生长活性被抑制;Ed U实验结果表明,黄芪水提物能够显著抑制A549和H1299细胞的增殖能力;对细胞周期考察的实验结果表明,黄芪水提物能够将A549和H1299细胞周期阻滞在S期;划痕实验结果表明,黄芪水提物作用于A549和H1299细胞24 h和48 h后,能够显著抑制细胞的迁移能力;Western blotting实验结果表明,黄芪水提物能够下调A549和H1299细胞磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化的磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(p-PDK1)和磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表达水平;体内实验结果表明,黄芪水提物能够显著抑制小鼠肺部肿瘤数量及大小。结论黄芪水提物能够抑制肺癌,该机制可能与PI3K/Akt信号通路受阻有关。     

龙葵不同提取部位体外抗肿瘤作用的研究

目的 评价龙葵体外抗肿瘤作用及确定其活性部位.方法 采用MTT法和细胞形态观察法研究龙葵水提物、醇提物及醇提物的5个不同萃取部位对人肝癌细胞株SMME-7721,HepG2和胃癌细胞株MGC-803增殖的抑制作用及对细胞形态的影响.结果 龙葵水提物、醇提物,龙葵石油醚和正丁醇萃取部位对上述3种肿瘤细胞的生长均有不同程度的抑制作用且具有剂量依赖关系,另外均能显著改变细胞形态.结论 龙葵水提物、醇提物具有体外抗肿瘤作用,其石油醚和正丁醇部位是体外抗肿瘤作用的活性部位.     

四味归肝经虫类中药对肝癌HepG_2细胞增殖抑制作用对比研究

目的观察并对比分析四味归肝经虫类中药全蝎、蜈蚣、土鳖虫、水蛭水提物对人肝癌HepG2细胞株增殖抑制作用差别。方法采用液氮冻融法及丙酮沉淀法制备药物,根据回归方程计算半数抑制率（IC50）,MTT法检测各药物对HepG2细胞的增殖抑制作用。结果全蝎、蜈蚣、水蛭水提物具有显著抑制HepG2细胞增殖作用,呈明显的量效关系,土鳖虫水提物作用不明显,各药物的IC50分别为全蝎7.02mg/ml,蜈蚣3.07mg/ml,水蛭9.83mg/ml,土鳖虫433.57mg/ml。结论全蝎、蜈蚣、水蛭取提物均能有效抑制人肝癌HepG2细胞增殖,其中蜈蚣作用最强,而土鳖虫提取物抑制作用不明显。     

肝癌细胞对艾叶水提物的敏感性

目的研究肝癌细胞对艾叶水提物的敏感性。方法制备艾叶水提物溶液,以17.5,35,70 mg(艾叶)/m l分别处理HepG2细胞,采用倒置显微镜观察肝癌细胞的生长状态,MTT法测定肝癌细胞的活力,集落形成实验测试肝癌细胞的增殖潜力。结果不同浓度的艾叶水提物处理肝癌细胞12 h均使细胞严重皱缩,随作用时间的延长,细胞持续皱缩,甚至死亡,其效果与药物浓度呈正相关;处理肝癌细胞12~48 h,细胞OD值均明显下降,与对照组比较均有差异,差异有统计学意义(P<0.01);计数72 h后各处理组10个以上细胞的集落形成率均为0,对照组为100%。结论肝癌细胞对艾叶水提物极敏感,能导致细胞皱缩,阻止细胞增殖,最终诱导细胞死亡。进一步研究艾叶水提物的活性部位具有重要意义。     

基于形态和红外光谱分析的云南重楼及近似种的快速鉴别

目的基于形态和红外光谱法建立云南重楼及近似种的鉴别方法,并进一步分析其亲缘关系,为资源开发利用提供依据。方法对云南重楼及其近似种进行了原植物形态比较,并对光谱数据进行自动基线校正、自动平滑、纵坐标归一化、二阶求导等预处理,采用主成分分析(principalcomponentanalysis,PCA)、偏最小二乘判别分析(partialleastsquares discriminantanalysis,PLS-DA)及系统聚类分析(hierarchicalclusteranalysis,HCA)分析光谱数据。结果云南重楼与近似种在植株大小、叶片、叶脉、萼片、花瓣、花亭和雄蕊等形态特征上存在典型的鉴别特征,可为其提供形态鉴别依据。6种重楼的二阶导数在3 000～2 000 cm-1和指纹区1 800～500 cm-1波段内差异明显,HCA和PLS-DA均能较好地区分云南重楼及近似种,可为其提供红外光谱鉴别证据。HCA结果表明云南重楼、七叶一枝花、狭叶重楼、矮重楼和多叶重楼亲缘关系较近。结论傅里叶变换红外光谱(FTIR)结合原植物形态鉴定能够快速鉴别云南重楼及其近似种,为指导重楼栽培、临床应用和资源开发提供科学依据。     

混合丛枝菌根真菌接种时期对滇重楼幼苗内源激素含量的影响

目的研究混合丛枝菌根(AM)真菌不同接种时期对滇重楼Paris polyphylla Smith var. yunnanensis幼苗内源激素含量的影响。方法室内盆栽法,分别将滇重楼种子、1年生苗、2年生苗接种混合AM真菌,于灭菌土壤基质中进行共生培养,采用高效液相色谱法测定内源激素玉米素核苷(ZR)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)含量。结果混合AM真菌对不同时期,不同种源的滇重楼根状茎和根中内源激素ZR、GA、IAA、ABA含量变化的影响不尽相同。整体上,与对照组比较,野生种源和栽培种源滇重楼根状茎和根的ZR和GA内源激素含量均呈增加趋势,ABA含量均呈减少趋势。滇重楼根状茎和根中IAA/ABA、GA/ABA、ZR/ABA增大。结论 1年生苗期接种S2、S6型混合AM真菌,对促进滇重楼幼苗根状茎和根生长的综合效果最佳。     

滇重楼根茎品质与根际土壤因子的相关性分析

目的 探明野生与移栽滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis根际土壤中基本养分、土壤酶活性与根茎品质的关系,筛选影响滇重楼活性成分的主导土壤因子,为滇重楼合理施肥提供参考依据。方法 以采自云贵川33个样点的滇重楼为材料,测定了其根茎品质指标以及生长土壤基本养分含量和土壤酶活性;分析了根茎品质指标与土壤因子的相关性,并采用逐步回归分析方法筛选出影响滇重楼根茎品质的主要土壤因子。结果 滇重楼野生品和移栽品在总皂苷、总多糖、总黄酮含量上具有一定的差异,药材品质具有一定的地域性。所有滇重楼根际土壤样品的酸碱度适中,基本养分充足、含量丰富,土壤酶活性高,适宜于滇重楼的生长发育,野生地土壤肥力质量优于移栽地。野生滇重楼根茎总皂苷与多酚氧化酶活性呈现出极显著正相关,总黄酮与pH值、脲酶活性呈极显著负相关关系。移栽滇重楼根茎总皂苷与速效钾含量呈现出显著负相关,总黄酮与蔗糖酶活性呈显著正相关关系,总多糖与碱性磷酸酶活性呈显著正相关。结论 滇重楼品质主要受到土壤因子综合影响,在滇重楼野外就地保护或人工栽培过程中,注意根据实际情况增减土壤各养分的含量及其比例关系。     

丛枝菌根真菌对滇重楼内源激素的影响

目的初步探索接种不同外源性丛枝菌根(AM)真菌对滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis幼苗内源激素水平变化规律。方法以灭菌土壤为生长基质,于室温盆栽条件下对滇重楼新鲜种子与28种AM真菌共培养后采样,采用HPLC测定和比较分析各处理组滇重楼根茎和须根内源激素玉米素核苷(ZR)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)的量。结果接种外源性AM真菌能提高滇重楼幼苗菌根侵染率和成苗率,AM真菌对滇重楼幼苗根茎和须根中ZR、GA、IAA、ABA 4种激素量的变化表现出不同的规律,但具有偏好性。与对照组相比,整体上接种AM真菌处理组根茎中ZR、GA量呈现增长的趋势,IAA量变化规律不明显,而ABA量呈现减少的趋势,接种AM真菌处理组根茎中ABA/ZR、ABA/GA、ABA/IAA值呈现减少的趋势,但须根与根茎的变化趋势相反。结论 AM真菌能促进滇重楼幼苗的存活率,且不同AM真菌菌株影响滇重楼内源激素量。     

AM真菌对滇重楼光合参数及生理指标的影响

通过室温盆栽接种试验与室内分析相结合的方法,观察灭菌土壤条件下接种28种丛枝菌根(AM)真菌对滇重楼光合参数和生理生化指标的影响。结果表明,滇重楼与AM真菌形成了良好的共生关系。AM真菌诱导处理后,不同AM真菌对滇重楼叶片的光合参数和生理生化指标的影响有所差异,AM真菌的施用能够提高滇重楼叶肉细胞的光合作用强度,提高滇重楼叶片可溶性蛋白和可溶性糖含量及保护酶活性,增强了滇重楼抗不利环境的能力,促进了滇重楼的生长,而滇重楼与AM真菌之间存在一定的相互选择性。从综合接种效应来看,瑚状盾巨囊霉Racocetra coralloidea、美丽盾巨孢囊霉Scutellospora calospora、近明球囊霉Claroideoglomus claroideum、透明盾巨孢囊霉S. pellucida和明球囊霉Rhizophagus clarus是最适宜滇重楼大田栽培时推广应用的优良备选菌株。     

基于生物量和活性成分的滇重楼幼苗优良菌根真菌筛选

目的以菌根生活力、根茎生物量和活性成分为指标,筛选适宜滇重楼幼苗生长发育的优良丛枝菌根(arbuscular mycorrhizal,AM)真菌。方法以灭菌土壤为生长基质,采用室温盆栽试验,研究接种28种外源性AM真菌对滇重楼幼苗菌根生活力、根茎生物量和重楼皂苷产量(单株幼苗所含的重楼皂苷量、重楼皂苷含量与幼苗生物量的乘积)、根茎重楼皂苷与核苷含量的影响。结果接种的28种AM真菌与滇重楼幼苗均形成了共生体系并且发育良好,并能提高滇重楼幼苗菌根生活力,但具有偏好性。大多数AM真菌处理组能提高滇重楼根茎生物量,促进了滇重楼幼苗重楼皂苷和重楼核苷的积累,表现为重楼皂苷含量和产量的提高。菌根形成对滇重楼幼苗次生代谢的影响还表现在重楼皂苷和重楼核苷的器官分配上,菌根化滇重楼幼苗须根中4种重楼皂苷总量具有高于根茎的趋势,而根茎中9种核苷总量明显高于须根。结论本研究中不同AM菌株的表现,对进一步提高滇重楼幼苗生物量和品质的菌株筛选具有重要的借鉴作用,巨大巨孢囊霉Gigasporagigantea、美丽盾巨孢囊霉Scutellospora calospora、沾屑多孢囊霉Diversispora spurca、异配盾孢囊霉Dentiscutata heterogama、沙荒球囊霉Septoglomus deserticola、薄壁两性囊霉Ambispora leptoticha可望能作为培育滇重楼菌根化苗的理想菌株。     

不同生长年限滇重楼的生物量分配与异速生长研究

目的 比较不同产地和生长年限栽培滇重楼Paris polyphylla var. yunnanensis生物量和性状差异,并对植株生物量积累和生长发育规律进行异速生长分析。方法 使用Pearson相关分析研究滇重楼根茎生物量与采集地经纬度、气候因子间的相关性;单因素方差分析（One-Way ANOVA）与独立样本T检验用于样品间植物性状的差异显著性比较;利用标准化主轴回归分析（standardized major axisregression）对滇重楼的生物量积累和生长发育规律进行异速生长研究。结果 研究表明12个不同产地的5年生滇重楼根茎生物量平均值在1.19～19.73 g,不同产地之间具有显著差异（P<0.05）,但该差异与产地经纬度、年均温度、年均降水量之间不存在显著相关性（P>0.05）。滇重楼植株的根茎生物量均随生长年限增加而增加,种植5年后根茎生物量一直呈现快速积累趋势。相同生长年限植株中,云南省元阳县样品根茎生物量显著高于姚安县样品（P<0.05）,并且数值具有更高的变化范围。滇重楼植株的总生物量、株高、叶生物量、叶长、叶宽、叶面积均随生长年限增加而增...     

基于SSR分子标记的滇重楼遗传多样性研究

目的研究滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis自然居群的遗传多样性,为滇重楼资源的保护和合理利用提供数据。方法采用SSR分子标记对滇重楼5个不同居群共115份样品进行遗传多样性分析。结果筛选出8对可用SSR引物,多态位点百分率(PPB)为100%,多态信息量(PIC)为0.745 6。在居群水平和物种水平上,观测等位基因数(N_a)分别为8.425 0和17.750 0,有效等位基因数(N_e)分别为4.960 9和7.500 7,观测杂合度(H_o)分别为0.295 5和0.294 8,期望杂合度(H_e)分别为0.654 8和0.774 4,Shannon’s信息指数(I)分别为1.520 1和2.038 6。遗传分化系数(F_(st))为0.172 8,基因流(N_m)为1.196 6。利用UPGMA聚类分析,将5个居群分为2类。结论滇重楼遗传多样性水平较高,居群内和居群间具有一定的遗传分化。对保护和发展滇重楼资源提出若干措施,为滇重楼的保护和科学可持续利用提供参考。     

我国滇重楼种植的气候适宜性研究

该文在对云南、四川、贵州3省175个滇重楼种植区进行实地调查的基础上,根据"中药资源空间信息网格数据库"提供的1950—2000年1 km×1 km空间分辨率的气候资料,基于全国区域和年尺度选取影响我国滇重楼分布的潜在气候因子,利用最大信息熵模型(MaxEnt)和ArcGIS空间分析技术,研究了影响我国滇重楼潜在种植分布的主导气候因子及其气候适宜性。结果表明,影响我国滇重楼潜在种植分布的主导气候因子是8月平均降雨量、最干季平均温、等温性、10月平均降雨量、季节降水量变异系数和7月平均温,累积贡献率达到了97.2%。利用所建模型给出的滇重楼在待预测地区的存在概率,将我国滇重楼潜在种植分布区划分成气候不适宜区、次适宜区、较适宜区和最适宜区,并给出了各气候适宜区的气候特征。研究结果可为优化我国滇重楼生产布局及引种提供参考。     

滇重楼鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达研究

目的克隆滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis三萜皂苷生物合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行原核表达。并用Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1基因和SE2基因的相对量。方法以滇重楼根为材料提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板,根据转录组数据中的2组SE基因全长序列设计特异性引物,对SE基因进行克隆后转入到pEASY-T1 Simple Cloning Vector中,经测序鉴定正确后,构建pEASY-E1-SE表达载体,利用Art Media protein Expression/Amp+培养基自动诱导表达。Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1和SE2基因的相对量。结果获得了2条滇重楼SE基因,命名为ppSE1和ppSE2。ppSE1的全长为1 932 bp,开放阅读框(ORF)为1 578 bp,编码525个AA;ppSE2的全长为1 828 bp,ORF长为1 548 bp,编码515个氨基酸。荧光定量PCR结果显示ppSE1基因和ppSE2基因在茎和叶中的表达具有显著差异,ppSE1的表达在叶中最为显著。酶切和测序结果表明,原核表达载体pEASY-E1-SE构建成功;SDS-PAGE分析显示,在BL21(DE3)表达感受态细胞中成功诱导表达了SE基因的2种融合蛋白。结论克隆了滇重楼的SE基因,获得了在体外具有生物学活性的SE蛋白。ppSE1基因和ppSE2基因在滇重楼中具有不同的表达模式,在滇重楼次生代谢产物的合成中起着不同的作用。