反转录病毒介导靶向瞬时感受器电位M7基因siRNA抑制RBL-2H3细胞的活化

背景:钙离子在肥大细胞活化后的脱颗粒反应起重要作用。瞬时感受器电位M7(transient receptor potential melastatin7,TRPM7)是肥大细胞重要的候选通道。目的:构建携带大鼠靶向TRPM7-siRNA的反转录病毒载体并检测其对大鼠RBL-2H3细胞抗原活化的影响。方法:实验设计3个TRPM7-siRNA序列和1个无关对照序列,克隆到酶切的pSuper-retro-neo-GFP反转录病毒载体,用重组质粒pSuper-retro-neo-GFP-shTRPM7-(1,2,3)采用脂质体Lipofectamine 2000转染RBL-2H3细胞,采用Western blot检测干扰效率。筛选出最有效的pSuper-retro-neo-GFP-siTRMP7与包装质粒共转染293FT细胞生成反转录病毒并感染RBL-2H3细胞,荧光实时定量PCR及Western blot检测TRPM7-siRNA的沉默效果。检测β-氨基已糖苷酶活性探讨RBL-2H3细胞抗原活化程度的改变。结果与结论:转染后的各组细胞中siTRPM7-3转染组的沉默效率最高(P<0.05)。pSuper-retro-neo-GFP-siTRMP7-3干扰组的TRPM7基因的mRNA水平和蛋白水平显著下调,致敏后其β-氨基已糖苷酶活性明显降低(P<0.05)。结果提示,降低TRPM7基因的表达可抑制RBL-2H3细胞的抗原活化。     

大鼠RBL-2H3细胞瞬时感受器电位M7通道参与细胞存活及凋亡

背景：瞬时感受器电位M7是肥大细胞上重要的钙离子通道,但其在肥大细胞存活及凋亡过程中的作用仍未明确。目的：观察瞬时感受器电位M7通道对大鼠RBL-2H3细胞存活及凋亡的影响。方法：取对数生长期RBL-2H3细胞,①分别以50,100,200μmol/L瞬时感受器电位通道阻断剂2-APB进行干预,并以0.1%DMSO干预的细胞及正常培养的细胞作对照。②以瞬时感受器电位M7-siRNA反转录病毒载体转染RBL-2H3细胞,并设立空载体组和正常对照组。结果与结论：经过100,200μmol/L的2-APB作用72h后,RBL-2H3细胞数减少,吸光度值降低（P〈0.05）,细胞凋亡增多,早期凋亡率和总凋亡率增加（P〈0.05）;RBL-2H3细胞转染si-瞬时感受器电位M772h后,吸光度值降低（P〈0.05）,细胞凋亡增多,早期凋亡率和总凋亡率增加（P〈0.05）。说明瞬时感受器电位M7通道参与了RBL-2H3细胞存活和凋亡过程。     

大鼠RBL-2H3细胞瞬时感受器电位M7通道参与细胞存活及凋亡

背景:瞬时感受器电位M7是肥大细胞上重要的钙离子通道,但其在肥大细胞存活及凋亡过程中的作用仍未明确。目的:观察瞬时感受器电位M7通道对大鼠RBL-2H3细胞存活及凋亡的影响。方法:取对数生长期RBL-2H3细胞,①分别以50,100,200μmol/L瞬时感受器电位通道阻断剂2-APB进行干预,并以0.1%DMSO干预的细胞及正常培养的细胞作对照。②以瞬时感受器电位M7-siRNA反转录病毒载体转染RBL-2H3细胞,并设立空载体组和正常对照组。结果与结论:经过100,200μmol/L的2-APB作用72h后,RBL-2H3细胞数减少,吸光度值降低(P<0.05),细胞凋亡增多,早期凋亡率和总凋亡率增加(P<0.05);RBL-2H3细胞转染si-瞬时感受器电位M772h后,吸光度值降低(P<0.05),细胞凋亡增多,早期凋亡率和总凋亡率增加(P<0.05)。说明瞬时感受器电位M7通道参与了RBL-2H3细胞存活和凋亡过程。     

构建血红素氧合酶1基因真核表达质粒及在大鼠主动脉平滑肌细胞中的表达

目的：克隆血红素氧合酶1基因并构建其真核表达重组质粒，进一步检测血红素氧合酶1基因转染大鼠主动脉平滑肌细胞及其表达目的蛋白的效果。 方法：实验于2007-02／12在泸州医学院中心试验室完成。取雄性健康成年SD大鼠1只，腹腔注射氯化汞（1mg／kg）24h后，麻醉状态下取肾脏，从大鼠肾组织中提取总RNA，通过反转录-聚合酶链反应扩增大鼠血红素氧合酶1基因片段，并将其克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，运用脂质体将重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1转染主动脉平滑肌细胞，通过反转录-聚合酶链反应和Western blot分析血红素氧合酶1基因细胞转染及表达的效果。 结果：经双酶切及测序鉴定证明，正确克隆了血红素氧合酶1基因并成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。反转录-聚合酶链反应及Western blot分析显示血红素氧合酶1基因能成功转染主动脉平滑肌细胞并在mRNA水平和蛋白水平有效表达。 结论：①成功构建血红素氧合酶1基因真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。②脂质体包裹重组质粒瞬时成功转染到体外培养的主动脉平滑肌细胞并得到有效表达。     

人端粒酶反转录酶小发夹RNA质粒表达载体的构建及鉴定

背景:端粒酶反转录酶是端粒酶的活性亚基,已成为肿瘤研究的热点。RNA干扰技术作为一种基因沉默方法,具有高效、特异等优点,现已广泛应用于肿瘤、病毒等研究领域。目的:构建针对人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,并观察其对乳腺癌T47D细胞人端粒酶反转录酶基因的表达和端粒酶活性的影响。方法:以Genbank中人端粒酶反转录酶基因的mRNA序列为基础,设计人端粒酶反转录酶基因的小干扰RNA序列,将其连接到具有G418抗性的质粒pBAsi-hU6-Neo(BamHⅠ/HindⅢ)中,应用基因测序加以验证,扩增提取质粒,以脂质体转染表达小发夹RNA的质粒到乳腺癌T47D细胞,抗生素G418筛选出转染成功的各组细胞。结果与结论:实验所构建的人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,经测序验证无误。将pBAsi-hU6-Neo重组质粒转染入T47D细胞,经G418筛选获得了转染成功的细胞。经RT-PCR和Western blot检测,转染后的人端粒酶反转录酶基因在mRNA和蛋白水平的表达均明显降低(P<0.01),经TRAP-ELISA法检测实验组细胞端粒酶活性出现显著下降(P<0.01)。结果证实,实验成功构建人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,实验所设计的小干扰RNA能有效抑制肿瘤细胞人端粒酶反转录酶基因的表达,进而降低细胞的端粒酶活性。     

STAT3-siRNA诱导前列腺癌细胞凋亡机制的探讨

目的 探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因表达诱导人前列腺癌细胞凋亡的机制。方法 针对人STAT3mRNA序列设计合成编码干扰RNA（siRNA）的DNA模板,构建pSilencer 2.1-U6-STAT3-siRNA重组质粒,转染人前列腺癌细胞株PC3,采用Western blot、Northern blot观察STAT3基因表达抑制后Bcl-2,C-Myc与Cyclin D1表达的变化,并用流式细胞技术及吖啶橙染色方法观察细胞凋亡。结果成功构建pSilencer 2.1-U6-STAT3-siRNA重组质粒,并成功转染PC3细胞;Northern blot及Western blot结果 证实重组质粒在mRNA及蛋白水平均显著抑制STAT3基因表达,抑制率分别为60%及75%,并证实随着STAT3表达的抑制Bcl-2,C-Myc及Cyclin D1的表达明显下调。FCM及吖啶橙染色结果表明上述重组质粒可诱导PC3细胞凋亡。结论 STAT3-siRNA可抑制STAT3在人前列腺癌细胞的表达,诱导肿瘤细胞凋亡。其机制与STAT3抑制Bcl-2,C-Myc及Cyclin D1表达有关。     

构建人端粒酶反转录酶基因腺相关病毒2载体在人髓核细胞的表达

背景：动物研究显示,自体髓核细胞移植能有效修复椎间盘退变。然而髓核细胞体外增殖能力差,这就限制了其作为种子细胞在椎间盘退变性疾病治疗中的研究及应用。 目的：构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2载体,观察其转染人髓核细胞后人端粒酶反转录酶基因的表达。 方法：构建pSNAV2.0-pRSV-hTERT质粒并鉴定,采用AAVMaxTM包装系统进行重组腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体的构建,以 PCR 及酶切方法验证构建的质粒,构建成功后扩增,并纯化。利用腺相关病毒2-增强型绿色荧光蛋白载体转染第1代人髓核细胞,测定最佳感染复数。参照此感染复数值,确定腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶对人髓核细胞转染的相关感染复数;对照组采用不含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2进行转染。转染后1,2,4周分别采用RT-PCR对人端粒酶反转录酶基因mRNA水平进行半定量检测。 结果与结论：实验成功构建了腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体;并获得了滴度达2×1011 v·g/mL的腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体。测得腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体对人髓核细胞的最佳感染复数为5×104 v·g/cel。在以1×104,5×104,1×105 v·g/cel 转染人髓核后,均可检测到人端粒酶反转录酶基因mRNA的高量表达。采用RT-PCR半定量检测方法,发现以转染后2周时人端粒酶反转录酶 mRNA表达量相对最高（P 〈0.05）,4周时仍可见人端粒酶反转录酶基因mRNA的稳定表达。而对照组无论在何时间点均未能检测到人端粒酶反转录酶mRNA的表达。提示利用腺相关病毒2可以成功构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的病毒载体,腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶能有效转染人髓核细胞并稳定表达人端粒酶反转录酶基因mRNA,此结果可能为增强髓核细胞性能提供新的策略。     

α-1,2岩藻糖基转移酶基因35C〉T和682A〉G突变点体外表达的研究

本研究探讨35C〉T和682A〉G突变点对α-1,2岩藻糖基转移酶（FUT1）表达活性的影响。PCR扩增FUT1全长编码序列DNA片段,通过TOPOTA技术连接至表达载体pcDNA3.1/V5-His,获取目的重组质粒。采用脂质体转染方法将重组质粒转染COS-7细胞,经G418筛选培养后,利用流式细胞术分析细胞表面H抗原,实时荧光PCR检测fut1 mRNA表达情况。结果表明：成功获取了35T、682G＋35T和682A＋35C重组质粒。转染2天后H抗原在COS-7细胞膜上表达,第4天达最高峰。与野生型（682A＋35C）转染的细胞相比,第4天重组质粒（682G＋35T）转染细胞H抗原的表达量仅为野生型的13.3%,而重组质粒35T转染细胞为野生型的52.7%。转染后fut1mRNA水平随着时间延长而逐渐递减,在第1天重组质粒（682G＋35T）转染细胞fut1 mRNA水平仅为野生型（682A＋35C）的14%。结论：682A〉G突变明显降低α-1,2岩藻糖基转移酶活性,而35C〉T引起H抗原的表达部分下降。     

Galectin-3调控Wnt信号通路影响骨肉瘤细胞增殖侵袭的实验研究

目的探讨沉默骨肉瘤细胞中半乳凝集素-3(Galectin-3)的表达对细胞增殖及侵袭的影响及机制。方法从骨肉瘤组织及相应的瘤旁组织中提取总蛋白,Western blot检测Galectin-3的蛋白表达;阴性对照组(NC-siRNA)和RNA干扰组(Galectin-3-siRNA)转染至人骨肉瘤MG63细胞,不经任何处理的细胞作为空白对照组,转染48 h后,提取细胞中的蛋白,Western blot检测各组细胞中Galectin-3的蛋白表达;CCK8实验和Transwell小室分别检测细胞增殖和侵袭能力;Western blot检测ki67、MMP-2、MMP-9、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达。结果转染Galectin-3-siRNA能显著降低MG63细胞中Galectin-3的蛋白表达;与对照组及NC-siRNA组比较,Galectin-3-siRNA组细胞存活率及细胞侵袭数显著降低,ki67、MMP-2、MMP-9、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著下调(P0.05)。结论 Galectin-3在骨肉瘤组织中的表达显著高于瘤旁组织,RNA干扰沉默Galectin-3的表达可显著降低细胞的增殖及侵袭能力,其机制与抑制wnt信号通路有关。     

碱性成纤维细胞生长因子荧光真核表达载体构建及对过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡的影响

背景：已证实外源性碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）可抑制血管内皮细胞凋亡。目的：构建表达bFGF的荧光真核表达载体,探讨其对过氧化氢（H2O2）诱导的血管内皮细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。方法：通过基因亚克隆构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,利用脂质体介导将bFGF基因导入人脐静脉内皮细胞内,通过荧光观察和RT-PCR检测基因的表达。实验分为3组,对照组（转染pcDNA3.1）、过氧化氢组（转染pcDNA3.1＋H2O2）和bFGF转染＋过氧化氢组（转染pcDNA3.1-bFGF-GFP＋H2O2）,流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测caspase-3 P17活性亚单位和Bax蛋白表达。结果与结论：成功构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,该载体转染人脐静脉内皮细胞后,bFGF mRNA显著增加,并可观察到绿色荧光。与对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量都明显增加（P〈0.01）,而bFGF转染＋过氧化氢组的细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量则比过氧化氢组显著降低（P〈0.01）。证实bFGF基因转染能抑制过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bax蛋白表达和caspase-3活性有关。     

α-辅肌动蛋白4对卵巢癌细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响及其机制

目的:探讨体外沉默α-辅肌动蛋白4(alpha-actinin-4,ACTN4)基因的表达对卵巢癌细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响及其可能的机制。方法:化学合成靶向ACTN4基因的ACTN4-siRNA,体外转染至人卵巢癌细胞株SKOV3和OVCA429中,采用real-time PCR检测ACTN4 mRNA的表达,采用MTT法检测卵巢癌细胞的增殖能力及存活率,采用流式细胞术检测卵巢癌细胞的凋亡情况,采用Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达。结果:ACTN4-siRNA转染SKOV3/OVCA429细胞后,ACTN4的mRNA及蛋白的表达均明显下降;细胞增殖能力明显受到抑制。在不同浓度紫杉醇作用下,与转染CtrlsiRNA的对照组相比,ACTN4-siRNA转染组SKOV3/OVCA429的细胞存活率均显著降低,即转染ACTN4-siRNA后的SKOV3/OVCA429细胞对紫杉醇的敏感性明显增加(P0.01)。SKOV3细胞瞬时转染ACTN4-siRNA48 h后,细胞凋亡率[(7.22±0.31)%]明显高于转染Ctrl-siRNA的对照组[(2.07±0.08)%];OVCA429细胞的情况与之一致,转染ACTN4-siRNA后细胞凋亡率为[(23.37±0.18)%],对照组为[(19.49±0.19)%],差异均有统计学意义(P0.05)。转染ACTN4-siRNA后,SKOV3/OVCA429中p-Akt和p-FAK蛋白表达明显减少,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显减少,而促凋亡蛋白Bid和Bim表达则明显增加。结论:ACTN4可以降低卵巢癌细胞的化疗敏感性,这种作用可能通过抑制细胞凋亡实现。     

TA-270 [4-hydroxy-1-methyl-3-octyloxy-7-sinapinoylamino-2(1H)-quinolinone], an anti-asthmatic agent,inhibits leukotriene production induced by IgE receptor stimulation in RBL-2H3 cells

A novel quinolinone derivative, TA-270 [4-hydroxy-1-methyl-3-octyloxy-7-sinapinoylamino-2(1H)-quinolinone], has been shown to inhibit antigen-induced asthmatic responses including the early-phase bronchoconstriction in actively sensitized guinea pigs. Here we characterized the action mechanisms of TA-270 in cellular level in vitro. In RBL-2H3 mast cells sensitized with dinitrophenol (DNP)-specific IgE, the antigen exhibited several mast cell functions, including hexosaminidase release as a marker of degranulation, production of tumor necrosis factor-alpha, and production of immunologically detective leukotrienes. These antigen-induced actions were associated with the activation of several early signaling events, including inositol phosphate production reflecting phospholipase C activation and extracellular signal-regulated kinase activation. When the cells were treated with TA-270, the antigen-induced leukotriene production was almost completely suppressed, but other antigen-induced actions listed above were hardly affected. This drug also failed to affect the antigen-induced phospholipase A2 activation as evaluated by the total release of arachidonic acid and its metabolites from the cells prelabeled with radioactive arachidonic acid. However, TA-270 clearly changed the arachidonic acid metabolic pathway. It suppressed the accumulation of 5-lipoxygenase products, including leukotrienes, but hardly affected the accumulation of cyclooxygenase products. The inhibitory action of TA-270 on leukotriene production was also observed in human neutrophils and eosinophils. We conclude that TA-270 inhibits 5-lipoxygenase activity and, thereby, suppresses the antigen-induced leukotriene production.     

survivin基因沉默对“三阴”乳腺癌细胞株中caspase3和caspase7基因的影响

目的 探讨“三阴”乳腺癌细胞中沉默survivin基因对抑癌基因caspase3和caspase7的影响.方法 针对survivin基因设计干扰片段并与真核表达载体pGCsilencerTMU6/Neo/GFP进行连接,之后转染“三阴”乳腺癌细胞MDA-MB-231;通过RT-PCR鉴定survivin基因mRNA水平沉默效果;用RT-PCR检测沉默survivin基因对caspase3和caspase7表达及细胞凋亡的影响.结果 survivin基因沉默可引起MDA-MB-231细胞凋亡;caspase3和caspase7表达升高,灰度分析结果显示差异具有统计学意义（P =0.008）.结论 （1）RNAi技术沉默MDA-MB-231细胞中survivin基因,达到了对其表达的抑制效果;（2）survivin基因沉默可上调caspase3和caspase7的表达;（3） survivin基因沉默可引起细胞凋亡;（4） survivin基因可作为“三阴”乳腺癌基因治疗的新靶点.     

siRNA沉默VDAC1对MCF-7细胞增殖、周期的影响及其作用机制

[目的]观察siRNA沉默VDAC1基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖及细胞周期的影响.[方法]针对人VDAC1基因设计并合成siRNA,并将VDAC1-siRNA转染MCF-7细胞后,应用实时荧光定量PCR和Western印迹法检测MCF-7细胞中VDAC1的表达水平,MTT法检测MCF-7细胞的增殖情况,流式细胞术检测MCF-7细胞的周期分布,同时Western印迹法检测周期蛋白D1的表达.[结果]MCF-7细胞转染VDAC1-siRNA后能够有效抑制VDAC1的表达,显著抑制其增殖水平,促使MCF-7细胞发生G1期阻滞,同时下调Cyclin D1蛋白表达.[结论]VDAC1沉默能够有效抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖,促使细胞发生G1期阻滞.VDAC1可作为乳腺癌治疗的新靶点.     

慢病毒介导shRNA沉默STAT3表达对大肠癌HT-29细胞生长的影响

目的 观察慢病毒介导shRNA沉默STAT3表达对大肠癌HT-29细胞生长的影响.方法 将pRNAT-shSTAT3重组慢病毒质粒进行包装产生病毒液,测定其滴度,感染大肠癌HT-29细胞,筛选获得阳性细胞株,实时定量PCR和Western blot 检测shRNA对STAT3基因的沉默效率, MTT法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期变化.结果 成功包装慢病毒,其病毒悬液的滴度为2×107 TU/mL.病毒液感染大肠癌HT-29细胞,经G418筛选获得稳定细胞株,实时定量PCR和Western blot结果分别显示HT-29细胞STAT3mRNA表达和蛋白明显减弱,表达量分别为（16.9±2.1）%、（18.8±2.4）%（P＜0.01）.MTT结果显示STAT3基因沉默后的大肠癌HT-29细胞生长明显减慢, G0/G1期细胞占（68.73±2.88）%, S期细胞占22.93±1.10%, 与对照组相比差异显著（P＜0.01）.结论 慢病毒介导shRNA沉默STAT3表达对大肠癌HT-29细胞生长有明显的影响,细胞生长速度明显减慢,细胞阻滞于G0/G1期.     

人雌激素β受体RNAi反转录病毒载体在人成骨样MG63细胞中的表达

背景：目前已有较多关于雌激素α受体基因如何参与骨代谢的研究,而对雌激素β受体基因如何参与骨代谢的研究则相对较少。目的：构建人雌激素β受体RNAi反转录病毒表达载体,并通过病毒介导其在人成骨样MG63细胞中表达。方法：根据GeneBank数据库提供的雌激素β受体基因核苷酸序列,选择设计3条针对人雌激素β受体干扰靶序列,并与pRNAT-H1.4/Retro质粒定向连接,构建真核表达载体pRNAT-H1.4/Retro-雌激素β受体-shRNA,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。将pRNAT-H1.4/Retro-雌激素β受体-shRNA经脂质体转染至293细胞包装成反转录病毒。将包装好的反转录病毒,以空白及非特异性shRNA作为对照,感染人成骨样MG63细胞株。结果与结论：3个连接了雌激素β受体-shRNA的重组质粒经酶切鉴定分析证实目的序列己插入到预计位点,符合设计要求,测序鉴定表明重组质粒中含有针对雌激素β受体基因目的序列,表明重组质粒构建成功。并经脂质体转染至293细胞后成功包装成反转录病毒。反转录病毒载体能高效、稳定的感染人成骨样MG63细胞株,感染效率为70%左右。包装后的3种雌激素β受体-shRNA反转录病毒均能高效、稳定的感染人成骨样MG63细胞,并显著抑制雌激素β受体的表达。其中以雌激素β受体-shRNA3为最佳的干扰序列。