兔角膜缘上皮干细胞体外扩增及生物学鉴定

背景:角膜缘干细胞体外培养的关键在于建立稳定的体外培养体系,包括角膜缘干细胞的定位、培养条件、载体选择和鉴别方法等.目的:探索兔角膜缘上皮干细胞体外扩增方法,并对其生物学特性进行鉴定.方法:采用兔角膜缘组织块培养法,以人羊膜为载体,在体外进行兔角膜缘上皮干细胞原代和传代培养.倒置显微镜观察其体外生长特征;苏木精-伊红染色以及扫描电镜观察其形态;AE5和P63单克隆抗体免疫组织化学染色鉴定其蛋白表达.结果与结论:采用组织块培养法可在体外获得角膜缘上皮干细胞,能成功传代培养且保持较高增殖潜能.培养于去上皮羊膜上的干细胞可融合成片,呈"拉网"现象.原代角膜缘上皮干细胞AE5单克隆抗体染色阳性率低于5%,P63染色阳性达90%;随传代次数增加AE5染色阳性率增高,P63染色阳性率降低.结果显示兔角膜缘组织块培养法可以在体外成功获得角膜缘上皮干细胞,原代和传代细胞均具有干细胞特性,以羊膜为载体培养可形成角膜移植片.

Abstract：

BACKGROUND: How to establish a stable in vitro culture system, including location of corneal limbal epithelial stem cells, in vitro sample harvest, in vitro culture, vector selection, as well as identification methods, play a key role in corneal limbal epithelial stem cells culture. OBJECTIVE: To culture the isolated rabbit corneal limbal epithelial stem cells and to identify the biological properties of cultured cells. METHODS: The primary rabbit cornel limbal epithelial stem cells were isolated and cultured with tissue inoculation using human amniotic membrane as vector. The growth features of cells were observed under an inverted microscope. The morphology of cells was observed by hematoxylin-eosin staining and a scanning electron microscope. Furthermore, the monoclonal antibody AE5 and P63 two-step immunohistochemical staining were used to identify limbal epithelial stem cell protein expression. RESULTS AND CONCLUSION: The rabbit corneal limbal epithelial stem cells could be successfully cultured and maintained a relatively high value-added potential in vitro. Rabbit corneal limbal epithelial stem cells cultured on the amniotic membrane pull netted cellular layer. The AE5 monoclonal antibody positive rate of primary cultured cells was about 5% and P63 monoclonal antibody positive up to 90%. AE5-positive rate increased and P63-positive rate decreased with the increase in the number of subculture. The rabbit limbal epithelial stem cells can be successful culture and amplified on human amniotic membrane in vitro by limbal tissue culture method. The cultured cells maintain the characteristics of corneal epithelial cells. The rabbit corneal limbal epithelial stem cells can form grafts on the amniotic membrane.     

自体角膜缘干细胞羊膜移植治疗角膜缘缺陷的实验研究

目的：观察培养生长于羊膜的角膜缘干细胞移植治疗完全性角膜缘缺陷的效果。方法：建立兔完全性角膜缘缺陷模型，7d后分别给予羊膜移植、自体角膜缘移植、体外培养的角膜缘干细胞移植，比较观察3组治疗后的临床表现。结果：羊膜移植组有明显的新生血管和上皮缺损，角膜浑浊。而自体角膜缘移植和体外培养的角膜缘干细胞羊膜移植组术后角膜上皮光滑完整，无上皮缺损和新生血管新成。结论：自体角膜缘十细胞体外培养羊膜移植是治疗完全性角膜缘缺陷的有效方法，可恢复角膜缘屏障功能。     

自体角膜缘上皮移植治疗翼状胬肉

翼状胬肉是眼科常见病、多发病 ,单纯的翼状胬肉切除术术后复发率２０%～３０ % ［１］。近３年来 ,笔者依据角膜缘干细胞的理论学说 ,采用自体角膜缘上皮移植术治疗５３例(６０眼 )初发或复发性翼状胬肉 ,效果满意。１临床资料１．１一般资料本组病例为１９９６年２月～１９９９年８月我院门诊翼状胬肉患者 ,共５３例 (６０只眼 )。其中男３１例３６只眼 ,女２２例２４只眼。年龄３５～７０岁。初发４３例 ,复发１０例。１．２手术方法均在局麻和手术显微镜下操作。沿胬肉颈体部上下两侧及离角膜缘３ｍｍ处剪开球结膜 ,游离胬肉体部 ,在角…     

自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉

翼状胬肉术后复发率在２４%到８９%不等［１,２］。虽术后配合放疗或抗代谢药物应用 ,但仍难免复发 ,且有一定并发症［３］。近年我们采用常规胬肉切除联合角膜缘干细胞移植 ,取得了满意的疗效 ,现报告如下。临床资料一、一般资料本组翼状胬肉４７例５９眼 ,其中男２２例 ,女２５例 ,年龄 :３０岁以下５眼 ,３１至５０岁２１眼 ,５１至７０岁１６眼 ,７０岁以上１７眼 ,双眼１２例２４眼 ,单眼３５例３５眼 ,其中初发５０眼 ,复发性９眼 ,所有患者局部均无活动性炎症 ,无睑球粘连 ,胬肉头部进入透明角膜内２ｍｍ至同侧瞳孔区边缘。二、手术…     

HLA匹配角膜缘干细胞联合羊膜移植修复翼状胬肉

背景:HLA匹配的角膜缘干细胞联合羊膜移植治疗翼状胬肉是眼科医生治疗的新理念,该方法治疗后并发症少、康复快、复发率低,尤其是能减少移植排斥反应等已被广泛接受。目的:探讨HLA匹配的角膜缘干细胞联合羊膜移植治疗翼状胬肉疗效。方法:选取2013年3月1日至2014年4月30日行HLA匹配的角膜缘干细胞联合羊膜移植治疗的翼状胬肉患者47例(47眼)作为试验组;回顾性分析2010年3月1日至2012年12月1日采用单纯翼状胬肉切除方法治疗的翼状胬肉患者40例(47眼)作为对照组,对两组患者治愈和复发情况进行比较。结果与结论:试验组47例,全部顺利完成治疗,无并发症,其中1例切口感染,特殊对症治疗后均已好转出院,全部患者均无移植排斥反应。试验组治愈45眼,复发2眼,复发率为4.3%。对照组47眼中治愈32眼,复发15眼,复发率31.9%。结果表明HLA匹配的角膜缘干细胞联合羊膜移植治疗翼状胬肉并发症少、复发率低,是治疗翼状胬肉一种行之有效的方法。     

自体组织工程化角膜上皮修复角膜缘缺陷症

目的：用组织工程方法构建角膜上皮组织，观察自体工程化角膜上皮修复角膜缘缺陷症的可行性。 方法：①实验于2000-01／2003-12在南京医科大学第一临床医学院中心实验室和内分泌科实验室完成。选用新西兰白兔15只，雌雄不拘。用手术方法做成单眼角膜缘缺陷动物模型，为移植实验的受体眼。另一只眼为供体眼。15只兔被随机分为3组：自体角膜上皮移植，羊膜移植组，对照组。②自体角膜上皮移植组：取供体眼角膜缘上皮组织约3mm^3，体外培养。对原代培养和传代培养的角膜干细胞进行形态学观察，采用糖原PAS反应鉴定细胞糖原染色；采用免疫组化法鉴定细胞角蛋白AE1表达；对培养细胞进行透射电镜和扫描电镜观察。在去除上皮的保存人羊膜组织上，接种培养细胞，气液界面培养2周构建复层上皮组织。倒置显微镜观察细胞形态和生长特征；组织固定，包埋，切片，染色，观察细胞生长状态和蛋白表达。透射电镜观察超微结构。5只眼成模后4周，受体眼去除角膜浅层新生血管膜，行自体培养角膜上皮移植术。羊膜移植组：5只眼成模后4周，行羊膜移植修复角膜表面；对照组：5只眼成模后不做处理，为模型对照组。③移植实验后7，10，20，30d，分别行裂隙灯显微镜检查，角膜荧光素染色，眼前部照相。并分别处死各组动物，取手术区域角膜组织，甲醛固定，石蜡包埋，病理切片，染色，镜检观察。 结果：①培养细胞的生长状态：原代培养48h细胞贴壁，15d左右形成单层。传代培养次日细胞贴壁，10d形成良好的单层。细胞胞体饱满，呈多角形，大小基本一致。②培养细胞的形态学特征：苏木精-伊红染色，细胞呈多角形，核呈长圆形，细胞大小一致，排列整齐。AE1单克隆抗体染色阳性，PAS染色阴性。③培养细胞的超微结构：透射电镜可见培养细胞之间有桥粒连接，缝隙连接。扫描电镜可见细胞表面有微绒毛结构。④羊膜上接种细胞的生长特征：24h细胞贴壁生长，1周左右融合成单层；气液界面培养，细胞透明饱满，均匀成片生长，持续培养2周，细胞呈复层生长。⑤组织工程化角膜上皮形态特征：苏木精-伊红染色，细胞呈多角形，在羊膜上融合成片。组织切片，细胞在羊膜上可达到四五层。透射电镜可见桥粒样结构。⑥自体组织工程化角膜上皮修复实验：自体角膜上皮移植组：移植区角膜上皮细胞覆盖，呈复层排列，基底细胞呈柱状，基底膜完整。基质内有炎性细胞和红细胞浸润。供体角膜未出现临床病理性损伤。羊膜移植组：移植区域表层有上皮细胞覆盖，层次紊乱，极性消失。基质内有炎性细胞和红细胞浸润。对照组：角膜上皮排列紊乱，基底膜不完整，基质内有中性白细胞和红细胞浸润。 结论：①角膜干细胞在体外能够培养传代。②培养角膜干细胞在保存人羊膜上能够生长，经气液界面培养，构建出复层上皮组织，与正常角膜上皮组织近似。③自体工程化角膜上皮可用于修复角膜缘缺陷症。     

骨髓间充质干细胞移植治疗兔角膜缘干细胞缺损的疗效观察

【目的】探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）移植治疗兔角膜缘干细胞缺损的疗效。【方法】选取健康的新西兰兔21只,随机分为角膜缘干细胞缺乏MSCs移植组（A组）、角膜缘干细胞缺乏组（B组）和正常空白组（C组）,每组7只,C组不进行操作,A组、B组使用N aO H破坏角膜来建立兔角膜缘干细胞缺乏动物模型,对兔髂窝处骨髓进行骨髓抽吸,利用密度梯度离心分离并培养MSCs ,A组将培养的MSCs接种在明胶载体膜上,利用组织黏合剂α‐氰基丙烯酸脘基酯,使 MSCs的载体与自体兔角膜植片（机械除去角膜缘干细胞）相互黏合,将载有MSCs的移植片缝合在浅层巩膜上;B组只需将球结膜断裂处缝合在浅层巩膜上。观察评估三组动物的眼表形态和角膜组织恢复情况。【结果】三组手术前的眼表形态评分比较无统计学意义（ P ＞0．05）,在术后第一周开始A组眼表形态评分显著高于B组、C组（ P ＜0．05）;三组细胞层数、表层细胞排列、杯状细胞、胶原纤维排列和炎性细胞比较差异均有统计学意义（P ＜0．05）,A组术后角膜组织恢复情况评分显著高于B组（P ＜0．05）。【结论】MSCs移植于角膜缘,能够改善眼表结构的形态,促进角膜缘组织恢复,治疗角膜缘缺损疗效满意。     

兔自体骨髓间充质干细胞移植对角膜缘干细胞损伤的初步疗效研究

目的探讨兔自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对角膜缘干细胞(LSCs)损伤的初步疗效。方法 36只大白兔分为三组:BMSCs组、LSCs组与羊膜对照组,每组12只。BMSCs组采用附着有BMSCs的羊膜治疗角膜缘干细胞损伤,LSCs组将附着有角膜内皮细胞的羊膜治疗角膜缘干细胞损伤,羊膜对照组则仅将羊膜用缝合线固定于浅层巩膜上治疗角膜缘干细胞损伤。于术前、术后1周、术后2周、3周和4周对眼表的形态进行评分;并于术前、术后1周、4周、8周利用聚焦显微镜观察细胞密度和表面积。结果在移植手术实施之前三组兔的眼表形态综合评分之间的差异无统计学意义(P0.05);手术之后4周BMSCs组和LSCs组兔的眼表形态评分得以显著改善,差异有统计学意义(P0.05);手术之后4周羊膜对照组兔的眼表形态评分与手术前相比,差异无统计学意义(P0.05);手术之后4周BMSCs组和LSCs组之间的眼表形态评分之间差异无统计学意义(P0.05)。与羊膜对照组相比,其它两组手术4周之后的眼表形态评分改善更显著,差异有统计学意义(P0.05)。经过共焦显微镜观察,BMSCs组兔移植1周之后的细胞形态为圆形,而非初始的梭边形,细胞较小,密度较高,而随着时间推移,个数逐渐减少,体积变大。随着时间的推移BMSCs组与LSCs组兔移植后的平均细胞密度出现下降。手术前BMSCs组与LSCs组细胞表面积差异无统计学意义(P0.05);手术后1周、4周BMSCs组的细胞表面积显著低于LSCs组,差异有统计学意义(P0.05),手术之后8周和12周时BMSCs组与LSCs组细胞表面积差异无统计学意义(P0.05)。结论与角膜缘干细胞相似,兔自体骨髓间充质干细胞移植治疗角膜缘干细胞可以重建受损的眼表,减轻水肿,抑制血管生成。     

一例体外培养自体角膜缘干细胞移植术的手术配合

急性眼表损伤在急症处理后,对于并发症的治疗是现代眼科领域内棘手问题之一。羊膜移植联合自体角膜缘干细胞移植是治疗眼表疾病的有效手段。体外培养自体角膜缘干细胞移植是近年来开展的一种新的治疗方法,其取材方便,自体体外培养的角膜缘干细胞数量充足,可完全覆盖创面,该术式     

自体组织工程化角膜上皮修复角膜缘缺陷症

目的:用组织工程方法构建角膜上皮组织,观察自体工程化角膜上皮修复角膜缘缺陷症的可行性。方法:①实验于2000-01/2003-12在南京医科大学第一临床医学院中心实验室和内分泌科实验室完成。选用新西兰白兔15只,雌雄不拘。用手术方法做成单眼角膜缘缺陷动物模型,为移植实验的受体眼。另一只眼为供体眼。15只兔被随机分为3组:自体角膜上皮移植,羊膜移植组,对照组。②自体角膜上皮移植组:取供体眼角膜缘上皮组织约3mm3,体外培养。对原代培养和传代培养的角膜干细胞进行形态学观察,采用糖原PAS反应鉴定细胞糖原染色;采用免疫组化法鉴定细胞角蛋白AE1表达;对培养细胞进行透射电镜和扫描电镜观察。在去除上皮的保存人羊膜组织上,接种培养细胞,气液界面培养2周构建复层上皮组织。倒置显微镜观察细胞形态和生长特征;组织固定,包埋,切片,染色,观察细胞生长状态和蛋白表达。透射电镜观察超微结构。5只眼成模后4周,受体眼去除角膜浅层新生血管膜,行自体培养角膜上皮移植术。羊膜移植组:5只眼成模后4周,行羊膜移植修复角膜表面;对照组:5只眼成模后不做处理,为模型对照组。③移植实验后7,10,20,30d,分别行裂隙灯显微镜检查,角膜荧光素染色,眼前部照相。并分别处死各组动物,取手术区域角膜组织,甲醛固定,石蜡包埋,病理切片,染色,镜检观察。结果:①培养细胞的生长状态:原代培养48h细胞贴壁,15d左右形成单层。传代培养次日细胞贴壁,10d形成良好的单层。细胞胞体饱满,呈多角形,大小基本一致。②培养细胞的形态学特征:苏木精-伊红染色,细胞呈多角形,核呈长圆形,细胞大小一致,排列整齐。AE1单克隆抗体染色阳性,PAS染色阴性。③培养细胞的超微结构:透射电镜可见培养细胞之间有桥粒连接,缝隙连接。扫描电镜可见细胞表面有微绒毛结构。④羊膜上接种细胞的生长特征:24h细胞贴壁生长,1周左右融合成单层。气液界面培养,细胞透明饱满,均匀成片生长,持续培养2周,细胞呈复层生长。⑤组织工程化角膜上皮形态特征:苏木精-伊红染色,细胞呈多角形,在羊膜上融合成片。组织切片,细胞在羊膜上可达到四五层。透射电镜可见桥粒样结构。⑥自体组织工程化角膜上皮修复实验:自体角膜上皮移植组:移植区角膜上皮细胞覆盖,呈复层排列,基底细胞呈柱状,基底膜完整。基质内有炎性细胞和红细胞浸润。供体角膜未出现临床病理性损伤。羊膜移植组:移植区域表层有上皮细胞覆盖,层次紊乱,极性消失。基质内有炎性细胞和红细胞浸润。对照组:角膜上皮排列紊乱,基底膜不完整,基质内有中性白细胞和红细胞浸润。结论:①角膜干细胞在体外能够培养传代。②培养角膜干细胞在保存人羊膜上能够生长,经气液界面培养,构建出复层上皮组织,与正常角膜上皮组织近似。③自体工程化角膜上皮可用于修复角膜缘缺陷症。     

人角膜缘干细胞体外传代及建系

背景：通过体外培养人角膜缘干细胞并进行传代、建系研究可为角膜缘干细胞移植的基础与临床研究提供足够的细胞储备。 目的：探讨一种体外培养人角膜缘干细胞传代、建系的方法。 设计：随机对照观察。 单位：赣南医学院。 材料：实验于2003—06／2004—04在赣南医学院科研中心与中山大学医学院眼科医院国家重点实验室完成。新鲜人角膜缘组织块分别取自2名健康人角膜组织供体，均经过供体者知情同意。RPMI-1640（Sigma R8755，含L-谷氨酰胺），200g／L胎牛血清（Gibco 16140—071）。DMEM培养基、硫酸软骨素、人表皮生长因子购自美国Sigma公司，HEPES、DMSO购自美国Gibco公司，100％甘油购自上海运佳黄浦制药有限公司，戊二醛购自德国E．Merk公司，乙醇、盐酸、丙酮、甲醛等购自北京化学试剂公司，0．25％胰蛋白酶液购自上海新华制药厂，上述试剂均为分析纯级。 方法：人角膜缘深部色素区组织块经消化后，分别在含有RPMI-1640、200g／L胎牛血清的培养瓶与以羊膜细胞外基质为培养载体的培养皿中进行体外培养。光镜及扫描电镜观察原代及传代培养细胞的生长情况；采用台盼蓝排斥实验计算冻存细胞逐代冻存处理后的复苏率。 主要观察指标：①人角膜缘干细胞体外原代及传代培养观察结果。②细胞冻存复苏率。 结果：①原代培养结果：经PRMI-1640培养基中培养1d后，倒置相差显微镜下可见培养瓶中细胞多已贴壁。均匀稀疏排列成单层并贴于培养瓶底部。②传代培养结果：传第2代时添加入表皮生长因子后，细胞分散成单层，贴壁生长旺盛。所有细胞传至第30代后形态的变异性增加明显，细胞体积明显增大，形态呈圆形或不规则圆形，密集成群。在培养液中传33代后，细胞仍然保持旺盛的分化、增殖能力，并且更适宜在羊膜细胞外基质上生长。③细胞冻存复苏率：冻存细胞的复苏率为82，2％。 结论：将人角膜缘干细胞经体外培养33代并逐代冻存后初步建立了人角膜缘干细胞系，人角膜缘干细胞更适合在含有羊膜细胞外基质为底物的培养基中生长。     

自体角膜缘干细胞的培养移植

目的自体角膜缘干细胞培养后自体移植被认为是眼表疾病的最佳治疗方法,因此,有必要深入认识角膜缘干细胞分子生物学的特征、组织学解剖和微环境以及自体角膜缘干细胞移植方面的研究进展.资料来源应用计算机检索Medline 1995-01/2002-12的文章,检索词"limbus corneae,stem cells,autotransplant",限定文章语言种类为English;同时检索/1995-01/2002-12的文章,检索词"角膜缘干细胞,自体移植",限定文章语言种类为中文.资料选择选择与角膜缘干细胞组织学、生理病理学研究的相关及自体角膜缘干细胞培养移植相关文献进行初审.纳入标准①动物实验研究.②临床观察应用研究.排除标准①重复研究.②综述文献.资料提炼共收集到120多篇上述相关文献.选择符合标准的15篇文章进行综合分析.资料综合①角膜缘干细胞分子生物学的特征角膜上皮干细胞具有其他定向干细胞相似的特性,有很强的增殖和细胞分裂能力;处于低分化状态;细胞周期长;分裂不对称.②角膜缘干细胞组织学解剖在角膜缘基底部的Vogt栅栏区乳头状结构中的某些基底细胞即是角膜缘干细胞.③角膜缘干细胞与微环境干细胞的增生和分化受到血清来源的因素及多种细胞因子的调控,因此,微环境中因素的变化直接影响着角膜缘干细胞的增生分化,从而导致各种角膜损伤性疾病的发生.④自体角膜缘干细胞移植将严重眼表疾病患者健眼的自体角膜缘干细胞培养到羊膜载体上进行自体患眼眼表移植.观察术后2～5 d内角膜上皮即可再生,1个月后视觉灵敏度明显增加,术后观察4个月,可见角膜上皮完整性以及持续性新生血管消退.结论自体角膜缘干细胞培养后移植尚处于实验研究阶段,其中自体角膜缘干细胞培养后移植治疗眼表疾病已初步获得成功,然而这种移植术后远期疗效需进一步临床观察.培养后的角膜缘上皮干细胞增殖、分化,生理、生化和免疫特性的变化及移植的载体、移植后细胞的移行、黏附、增殖和分化能力等问题,以及对于干细胞独特的单克隆抗体的筛选,干细胞的纯化与体外培养,如何控制干细胞的分化及细胞因子对干细胞的影响等都尚待需进一步研究.对没有任何自体角膜缘干细胞来源双眼伤患者可否行同种异体角膜缘干细胞培养后移植?是否通过培养角膜缘干细胞的抗原性可能发生改变从而降低排斥反应的发生率?这将是最有前途的发展方向.     

自体角膜缘干细胞的培养移植

目的：自体角膜缘干细胞培养后自体移植被认为是眼表疾病的最佳治疗方法，因此，有必要深入认识角膜缘千细胞分子生物学的特征、组织学解剖和微环境以及自体角膜缘干细胞移植方面的研究进展。资料来源：应用计算机检索Medline1995—01／2002—12的文章，检索词“limbus corneae．stem cells，autotransplant”，限定文章语言种类为English；同时检索http：//www．wanfangaata．com．cn1995—01／2002—12的文章，检索词“角膜缘干细胞，自体移植”，限定文章语言种类为中文。资料选择：选择与角膜缘干细胞组织学、生理病理学研究的相关及自体角膜缘干细胞培养移植相关文献进行初审。纳入标准：①动物实验研究。②临床观察应用研究。排除标准：①重复研究。②综述文献。资料提炼：共收集到120多篇上述相关文献。选择符合标准的15篇文章进行综合分析。资料综合：①角膜缘干细胞分子生物学的特征：角膜上皮干细胞具有其他定向干细胞相似的特性，有很强的增殖和细胞分裂能力；处于低分化状态；细胞周期长；分裂不对称。②角膜缘干细胞组织学解剖：在角膜缘基底部的Vogt栅栏区乳头状结构中的某些基底细胞即是角膜缘干细胞。③角膜缘干细胞与微环境：干细胞的增生和分化受到血清来源的因素及多种细胞因子的调控，因此，微环境中因素的变化直接影响着角膜缘干细胞的增生分化，从而导致各种角膜损伤性疾病的发生。④自体角膜缘于细胞移植：将严重眼表疾病患者健眼的自体角膜缘干细胞培养到羊膜载体上进行自体患眼眼表移植。观察术后2～5d内角膜上皮即可再生，1个月后视觉灵敏度明显增加，术后观察4个月，可见角膜上皮完整性以及持续性新生血管消退。结论：自体角膜缘干细胞培养后移植尚处于实验研究阶段，其中自体角膜缘干细胞培养后移植治疗眼表疾病已初步获得成功，然而这种移植术后远期疗效需进一步临床观察。培养后的角膜缘上皮干细胞增殖、分化，生理、生化和免疫特性的变化及移植的载体、移植后细胞的移行、黏附、增殖和分化能力等问题，以及对于干细胞独特的单克隆抗体的筛选，干细胞的纯化与体外培养，如何控制干细胞的分化及细胞因子对干细胞的影响等都尚待需进一步研究。对没有任何自体角膜缘干细胞来源双眼伤患者可否行同种异体角膜缘干细胞培养后移植？是否通过培养角膜缘干细胞的抗原性可能发生改变从而降低排斥反应的发生率？这将是最有前途的发展方向。     

兔下颌骨来源骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学特性

背景：以往研究表明骨髓间充质干细胞的获取来源主要是股骨或髂骨,但下颌骨来源骨髓间充质干细胞的研究至今少有报道。目的：观察兔下颌骨来源的骨髓间充质干细胞体外分离、培养及其生物学特性。方法：体外分离培养兔下颌骨骨髓间充质干细胞,取第2或3代检测。MTT法检测细胞增殖,克隆形成试验检测细胞的克隆形成率变化,并对其进行成骨和成脂肪诱导分化。结果与结论：MTT法检测细胞增殖,细胞生长曲线显示下颌骨骨髓间充质干细胞经历潜伏期、对数生长期和平台期。细胞克隆形成实验显示,细胞呈成纤维集落形成单位外观。茜素红、油红O染色结果显示,成骨诱导、成脂诱导后形成钙结节及脂滴。结果证实,兔下颌骨分离出的骨髓间充质干细胞有强大的自我复制及增殖能力,具有多向诱导分化的潜能。     

活体及体外条件下对角膜上皮干细胞的定位

背景：眼表存在两种形式的上皮干细胞即角膜上皮干细胞和结膜上皮干细胞,角膜上皮干细胞在角膜上皮细胞更新和角膜透明的维持方面起着重要作用。 目的：采用活体激光扫描角膜共焦显微镜和免疫荧光染色技术相结合的方法,从活体和体外层面上对角膜上皮干细胞进行定位研究。 方法：收集2009年9月至2012年9月来河南省眼科研究所就诊的单侧角膜缘干细胞缺乏患者,使用活体激光扫描角膜共焦显微镜检查患者双眼,健侧眼为对照。扫描方位依次为中央角膜及上、下、左、右方的角膜缘,记录扫描图像并分析。眼球材料来自于河南省眼库,切取角膜中央和角膜缘组织,组织包埋剂包被、冰冻切片,切片厚度5-7μm;免疫荧光染色技术检测p63、ABCG2、K3和Connexin 43在角膜中央及角膜缘上皮层的表达。 结果与结论：共有24例患者确诊为单侧角膜缘干细胞缺乏,活体激光扫描角膜共焦显微镜下患侧眼角膜病变区可见结膜细胞及杯状细胞;角膜缘区域Vogt栅栏状结构消失,色素细胞消失,取而代之的是大量纤维瘢痕化组织。免疫荧光染色示表达ABCG2和p63的细胞主要在角膜缘上皮基底层,尤其在近结膜侧的角膜缘及角膜缘中间部表达相对较高,而中央角膜上皮层细胞不表达;K3及Connexin43在角膜缘上皮基底细胞层不表达,中央角膜上皮全层表达。通过活体激光扫描角膜共焦显微镜观察及干细胞标记物检测显示角膜上皮干细胞主要存在于角膜缘外2/3区域的Vogt栅栏基底部及钉突结构中。     

Corneal epithelial stem cells for corneal injury

Introduction: Ocular surface diseases with limbal insufficiency represent a therapeutic challenge for restoring vision. This corneal deficiency includes both classical ocular diseases (as chemical burns) and rare ocular diseases (as congenital aniridia and ocular cicatricial pemphigoid).

Areas covered: Our understanding of limbal epithelial stem cells (LESCs) has increased the potential for treatment options. Pharmacological treatment strategies (as regenerating agent ophthalmic solutions) and especially surgical treatment strategies are available. Isolated LESCs can be produced by limbal primary cultures obtained from explants or cell suspensions. We review the latest cornea surgery techniques.

Expert opinion: The adjunction of human limbal mesenchymal cells as a support for limbal stem cell primary cultures appears to be of great interest. Recently, human-induced pluripotent stem cells have allowed the generation of minicorneal organoids. This potential means of creating a three-dimensional cornea with in vitro maturation opens up important research areas for corneal regeneration therapy.     

羊水多潜能干细胞的体外培养及其生物学特性

背景：近来发现羊水中含有具有多向分化潜能的干细胞，具有向内胚层、中胚层和外胚层分化的能力。目的：建立羊水多潜能干细胞的体外培养方法，并探讨其生物学特性。设计、时间及地点：单一样本实验，于2007—04／2008—01在解放军军事医学科学院生物工程研究所完成。材料：5份羊水标本来自孕16～22周流产孕妇自愿捐献。方法：从人孕中期羊水中，采用贴壁筛选法分离羊水多潜能干细胞。主要观察指标：采用免疫荧光、流式细胞术和反转录聚合酶链反应等方法分析细胞的生物学特性和鉴定细胞表型。结果：体外培养的羊水多潜能干细胞呈梭形或类上皮细胞样，细胞增殖迅速，细胞倍增时间约为24h，细胞周期中G1、S、G2期的细胞所占百分比分别为72．88％、5．77％、21．35％；细胞表达Oct4、Nanog、SSEA-4、CD44和CD105，不表达CD34和CD45。结论：采用贴壁筛选法获得的羊水多潜能干细胞增殖能力强，同时表达胚胎和成体干细胞的部分标志，可能为介于胚胎干细胞与成体干细胞之间的一种过渡阶段的干细胞。     

Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies

Introduction: The corneal epithelium is maintained by limbal stem cells (LSCs) that reside in the basal epithelial layer of the tissue surrounding the cornea termed the limbus. Loss of LSCs results in limbal stem cell deficiency (LSCD) that can cause severe visual impairment. Patients with partial LSCD may respond to conservative therapies designed to rehabilitate the remaining LSCs. However, if these conservative approaches fail or, if complete loss of LSCs occurs, transplantation of LSCs or their alternatives is the only option. While a number of clinical studies utilizing diverse surgical and cell culture techniques have shown favorable results, a universal cure for LSCD is still not available. Knowledge of the potential risks and benefits of current approaches, and development of new technologies, is essential for further improvement of LSCD therapies.

Areas covered: This review focuses on cell-based LSCD treatment approaches ranging from current available clinical therapies to preclinical studies of novel promising applications.

Expert opinion: Improved understanding of LSC identity and development of LSC expansion methods will influence the evolution of successful LSCD therapies. Ultimately, future controlled clinical studies enabling direct comparison of the diverse employed approaches will help to identify the most effective treatment strategies.     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养及多向诱导分化

背景:骨髓间充质干细胞的分离获取及培养鉴定一直以来仍无统一标准和定论.目的:体外获取兔骨髓间充质干细胞、纯化、扩增,同时研究其生物学特性及多向分化潜能.方法:采用贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线;倒置相差显微镜、苏木精-伊红染色及碱性磷酸酶染色观察细胞形态;并向成骨细胞、软骨细胞和血管内皮细胞多向诱导分化,分别采用钙结节茜素红染色、甲苯胺蓝染色和荆豆凝集素染色鉴定.结果与结论:经贴壁筛选法得到的骨髓间充质干细胞性状稳定,为纺锤状,呈克隆样生长,碱性磷酸酶染色弱阳性;经成骨、成软骨、成血管内皮细胞诱导培养的骨髓间充质干细胞,表现出相应细胞的形态特征和生物学特征.提示,全骨髓培养法取材方便,骨髓间充质干细胞增殖能力强,在适宜条件下能够多向分化.