兔角膜缘上皮干细胞体外扩增及生物学鉴定

背景:角膜缘干细胞体外培养的关键在于建立稳定的体外培养体系,包括角膜缘干细胞的定位、培养条件、载体选择和鉴别方法等.目的:探索兔角膜缘上皮干细胞体外扩增方法,并对其生物学特性进行鉴定.方法:采用兔角膜缘组织块培养法,以人羊膜为载体,在体外进行兔角膜缘上皮干细胞原代和传代培养.倒置显微镜观察其体外生长特征;苏木精-伊红染色以及扫描电镜观察其形态;AE5和P63单克隆抗体免疫组织化学染色鉴定其蛋白表达.结果与结论:采用组织块培养法可在体外获得角膜缘上皮干细胞,能成功传代培养且保持较高增殖潜能.培养于去上皮羊膜上的干细胞可融合成片,呈"拉网"现象.原代角膜缘上皮干细胞AE5单克隆抗体染色阳性率低于5%,P63染色阳性达90%;随传代次数增加AE5染色阳性率增高,P63染色阳性率降低.结果显示兔角膜缘组织块培养法可以在体外成功获得角膜缘上皮干细胞,原代和传代细胞均具有干细胞特性,以羊膜为载体培养可形成角膜移植片.

Abstract：

BACKGROUND: How to establish a stable in vitro culture system, including location of corneal limbal epithelial stem cells, in vitro sample harvest, in vitro culture, vector selection, as well as identification methods, play a key role in corneal limbal epithelial stem cells culture. OBJECTIVE: To culture the isolated rabbit corneal limbal epithelial stem cells and to identify the biological properties of cultured cells. METHODS: The primary rabbit cornel limbal epithelial stem cells were isolated and cultured with tissue inoculation using human amniotic membrane as vector. The growth features of cells were observed under an inverted microscope. The morphology of cells was observed by hematoxylin-eosin staining and a scanning electron microscope. Furthermore, the monoclonal antibody AE5 and P63 two-step immunohistochemical staining were used to identify limbal epithelial stem cell protein expression. RESULTS AND CONCLUSION: The rabbit corneal limbal epithelial stem cells could be successfully cultured and maintained a relatively high value-added potential in vitro. Rabbit corneal limbal epithelial stem cells cultured on the amniotic membrane pull netted cellular layer. The AE5 monoclonal antibody positive rate of primary cultured cells was about 5% and P63 monoclonal antibody positive up to 90%. AE5-positive rate increased and P63-positive rate decreased with the increase in the number of subculture. The rabbit limbal epithelial stem cells can be successful culture and amplified on human amniotic membrane in vitro by limbal tissue culture method. The cultured cells maintain the characteristics of corneal epithelial cells. The rabbit corneal limbal epithelial stem cells can form grafts on the amniotic membrane.     

气液界面培养体外构建角膜上皮的实验研究

目的：建立气液界面培养体外构建兔角膜上皮的方法。评价体外构建角膜上皮的生物学特性。方法：新西兰白兔15只30只眼，取角膜缘上皮组织。组织块接种原代培养。细胞融合生长后，消化传代。以去上皮细胞人羊膜组织为载体，接种培养传代细胞，细胞融合后，用气液界面培养方法继续培养2周。倒置显微镜对体外构建的角膜上皮进行观察。培养细胞膜片固定，苏木精一伊红(HE)染色；AE1细胞角蛋白单克隆抗体免疫组化染色，光镜观察。常规制作电镜标本，透射电镜观察。以传统培养方法作为对照。结果：倒置显微镜观察，气液界面培养可以形成连续的上皮细胞层，细胞和载体之间连接较牢固。HE染色显示体外构建的角膜上皮具有复层扁平上皮的结构。免疫组化染色有较高的阳性率。透射电镜观察细胞之间有丰富的桥粒样连接。结论：气液界面培养方法可以构建复层鳞状角膜上皮。与传统培养方法比较，构建的角膜上皮组织具有较优越的生物学特性。     

气液界面培养体外构建角膜上皮的实验研究

目的:建立气液界面培养体外构建兔角膜上皮的方法。评价体外构建角膜上皮的生物学特性。方法:新西兰白兔15只30只眼,取角膜缘上皮组织。组织块接种原代培养。细胞融合生长后,消化传代。以去上皮细胞人羊膜组织为载体,接种培养传代细胞,细胞融合后,用气液界面培养方法继续培养周。倒置显2微镜对体外构建的角膜上皮进行观察。培养细胞膜片固定,苏木精-伊红(H)E染色;AE1细胞角蛋白单克隆抗体免疫组化染色,光镜观察。常规制作电镜标本,透射电镜观察。以传统培养方法作为对照。结果:倒置显微镜观察,气液界面培养可以形成连续的上皮细胞层,细胞和载体之间连接较牢固。HE染色显示体外构建的角膜上皮具有复层扁平上皮的结构。免疫组化染色有较高的阳性率。透射电镜观察细胞之间有丰富的桥粒样连接。结论:气液界面培养方法可以构建复层鳞状角膜上皮。与传统培养方法比较,构建的角膜上皮组织具有较优越的生物学特性。     

不同羊膜为载体的人角膜缘上皮细胞原代培养研究

目的观察完整羊膜与去上皮羊膜两种不同载体上所培养的人角膜缘上皮细胞的生长特点及P63的表达情况。方法采用组织块培养法体外扩增培养人角膜缘上皮细胞,将来自同一供体的2块角膜缘组织随机种植于完整上皮羊膜(A组)和去上皮羊膜(B组)上培养。倒置显微镜下观察培养细胞体外生长的形态及特点,并运用免疫细胞化学方法观察所培养的细胞P63抗体的表达情况。结果 A、B两组细胞(每组10例)分别培养成功8例。两组培养成功的8例细胞均能在体外移行、扩增、连接成片。B组移行扩增的速度较A组快。两组细胞生长至14 d时做免疫细胞化学染色,共16孔细胞中均可见P63阳性细胞,其中A组细胞P63阳性率高于B组细胞(P<0.05)。结论角膜缘上皮细胞在完整羊膜和去上皮羊膜上均能体外扩增,去上皮羊膜为载体的角膜缘上皮细胞增殖分化快,完整羊膜为载体的细胞P63阳性率高于去上皮羊膜为载体的细胞。     

自体组织工程化角膜上皮修复角膜缘缺陷症

目的：用组织工程方法构建角膜上皮组织，观察自体工程化角膜上皮修复角膜缘缺陷症的可行性。 方法：①实验于2000-01／2003-12在南京医科大学第一临床医学院中心实验室和内分泌科实验室完成。选用新西兰白兔15只，雌雄不拘。用手术方法做成单眼角膜缘缺陷动物模型，为移植实验的受体眼。另一只眼为供体眼。15只兔被随机分为3组：自体角膜上皮移植，羊膜移植组，对照组。②自体角膜上皮移植组：取供体眼角膜缘上皮组织约3mm^3，体外培养。对原代培养和传代培养的角膜干细胞进行形态学观察，采用糖原PAS反应鉴定细胞糖原染色；采用免疫组化法鉴定细胞角蛋白AE1表达；对培养细胞进行透射电镜和扫描电镜观察。在去除上皮的保存人羊膜组织上，接种培养细胞，气液界面培养2周构建复层上皮组织。倒置显微镜观察细胞形态和生长特征；组织固定，包埋，切片，染色，观察细胞生长状态和蛋白表达。透射电镜观察超微结构。5只眼成模后4周，受体眼去除角膜浅层新生血管膜，行自体培养角膜上皮移植术。羊膜移植组：5只眼成模后4周，行羊膜移植修复角膜表面；对照组：5只眼成模后不做处理，为模型对照组。③移植实验后7，10，20，30d，分别行裂隙灯显微镜检查，角膜荧光素染色，眼前部照相。并分别处死各组动物，取手术区域角膜组织，甲醛固定，石蜡包埋，病理切片，染色，镜检观察。 结果：①培养细胞的生长状态：原代培养48h细胞贴壁，15d左右形成单层。传代培养次日细胞贴壁，10d形成良好的单层。细胞胞体饱满，呈多角形，大小基本一致。②培养细胞的形态学特征：苏木精-伊红染色，细胞呈多角形，核呈长圆形，细胞大小一致，排列整齐。AE1单克隆抗体染色阳性，PAS染色阴性。③培养细胞的超微结构：透射电镜可见培养细胞之间有桥粒连接，缝隙连接。扫描电镜可见细胞表面有微绒毛结构。④羊膜上接种细胞的生长特征：24h细胞贴壁生长，1周左右融合成单层；气液界面培养，细胞透明饱满，均匀成片生长，持续培养2周，细胞呈复层生长。⑤组织工程化角膜上皮形态特征：苏木精-伊红染色，细胞呈多角形，在羊膜上融合成片。组织切片，细胞在羊膜上可达到四五层。透射电镜可见桥粒样结构。⑥自体组织工程化角膜上皮修复实验：自体角膜上皮移植组：移植区角膜上皮细胞覆盖，呈复层排列，基底细胞呈柱状，基底膜完整。基质内有炎性细胞和红细胞浸润。供体角膜未出现临床病理性损伤。羊膜移植组：移植区域表层有上皮细胞覆盖，层次紊乱，极性消失。基质内有炎性细胞和红细胞浸润。对照组：角膜上皮排列紊乱，基底膜不完整，基质内有中性白细胞和红细胞浸润。 结论：①角膜干细胞在体外能够培养传代。②培养角膜干细胞在保存人羊膜上能够生长，经气液界面培养，构建出复层上皮组织，与正常角膜上皮组织近似。③自体工程化角膜上皮可用于修复角膜缘缺陷症。     

兔角膜缘干细胞的体外低钙原代培养研究

目的：探讨获取较纯的体外培养的兔角膜缘干细胞的方法，为角膜缘干细胞的临床移植奠定实验基础。方法：采用低钙培养法对兔角膜缘组织行体外培养，观察培养细胞的分化状态，并将培养的细胞行AE5免疫荧光染色。结果：体外培养的细胞以未分化的角膜缘干细胞为主。结论：取用角膜缘基底组织进行培养，将无钙培养液与低钙培养基结合，可获得较纯的、未分化的角膜缘干细胞。     

兔角膜缘干细胞的体外低钙原代培养研究

目的:探讨获取较纯的体外培养的兔角膜缘干细胞的方法,为角膜缘干细胞的临床移植奠定实验基础。方法:采用低钙培养法对兔角膜缘组织行体外培养,观察培养细胞的分化状态,并将培养的细胞行AE5免疫荧光染色。结果:体外培养的细胞以未分化的角膜缘干细胞为主。结论:取用角膜缘基底组织进行培养,将无钙培养液与低钙培养基结合,可获得较纯的、未分化的角膜缘干细胞。     

自体组织工程化角膜上皮修复角膜缘缺陷症

目的:用组织工程方法构建角膜上皮组织,观察自体工程化角膜上皮修复角膜缘缺陷症的可行性。方法:①实验于2000-01/2003-12在南京医科大学第一临床医学院中心实验室和内分泌科实验室完成。选用新西兰白兔15只,雌雄不拘。用手术方法做成单眼角膜缘缺陷动物模型,为移植实验的受体眼。另一只眼为供体眼。15只兔被随机分为3组:自体角膜上皮移植,羊膜移植组,对照组。②自体角膜上皮移植组:取供体眼角膜缘上皮组织约3mm3,体外培养。对原代培养和传代培养的角膜干细胞进行形态学观察,采用糖原PAS反应鉴定细胞糖原染色;采用免疫组化法鉴定细胞角蛋白AE1表达;对培养细胞进行透射电镜和扫描电镜观察。在去除上皮的保存人羊膜组织上,接种培养细胞,气液界面培养2周构建复层上皮组织。倒置显微镜观察细胞形态和生长特征;组织固定,包埋,切片,染色,观察细胞生长状态和蛋白表达。透射电镜观察超微结构。5只眼成模后4周,受体眼去除角膜浅层新生血管膜,行自体培养角膜上皮移植术。羊膜移植组:5只眼成模后4周,行羊膜移植修复角膜表面;对照组:5只眼成模后不做处理,为模型对照组。③移植实验后7,10,20,30d,分别行裂隙灯显微镜检查,角膜荧光素染色,眼前部照相。并分别处死各组动物,取手术区域角膜组织,甲醛固定,石蜡包埋,病理切片,染色,镜检观察。结果:①培养细胞的生长状态:原代培养48h细胞贴壁,15d左右形成单层。传代培养次日细胞贴壁,10d形成良好的单层。细胞胞体饱满,呈多角形,大小基本一致。②培养细胞的形态学特征:苏木精-伊红染色,细胞呈多角形,核呈长圆形,细胞大小一致,排列整齐。AE1单克隆抗体染色阳性,PAS染色阴性。③培养细胞的超微结构:透射电镜可见培养细胞之间有桥粒连接,缝隙连接。扫描电镜可见细胞表面有微绒毛结构。④羊膜上接种细胞的生长特征:24h细胞贴壁生长,1周左右融合成单层。气液界面培养,细胞透明饱满,均匀成片生长,持续培养2周,细胞呈复层生长。⑤组织工程化角膜上皮形态特征:苏木精-伊红染色,细胞呈多角形,在羊膜上融合成片。组织切片,细胞在羊膜上可达到四五层。透射电镜可见桥粒样结构。⑥自体组织工程化角膜上皮修复实验:自体角膜上皮移植组:移植区角膜上皮细胞覆盖,呈复层排列,基底细胞呈柱状,基底膜完整。基质内有炎性细胞和红细胞浸润。供体角膜未出现临床病理性损伤。羊膜移植组:移植区域表层有上皮细胞覆盖,层次紊乱,极性消失。基质内有炎性细胞和红细胞浸润。对照组:角膜上皮排列紊乱,基底膜不完整,基质内有中性白细胞和红细胞浸润。结论:①角膜干细胞在体外能够培养传代。②培养角膜干细胞在保存人羊膜上能够生长,经气液界面培养,构建出复层上皮组织,与正常角膜上皮组织近似。③自体工程化角膜上皮可用于修复角膜缘缺陷症。     

自体角膜缘干细胞羊膜移植治疗角膜缘缺陷的实验研究

目的：观察培养生长于羊膜的角膜缘干细胞移植治疗完全性角膜缘缺陷的效果。方法：建立兔完全性角膜缘缺陷模型，7d后分别给予羊膜移植、自体角膜缘移植、体外培养的角膜缘干细胞移植，比较观察3组治疗后的临床表现。结果：羊膜移植组有明显的新生血管和上皮缺损，角膜浑浊。而自体角膜缘移植和体外培养的角膜缘干细胞羊膜移植组术后角膜上皮光滑完整，无上皮缺损和新生血管新成。结论：自体角膜缘十细胞体外培养羊膜移植是治疗完全性角膜缘缺陷的有效方法，可恢复角膜缘屏障功能。     

人角膜缘干细胞体外传代及建系

背景：通过体外培养人角膜缘干细胞并进行传代、建系研究可为角膜缘干细胞移植的基础与临床研究提供足够的细胞储备。 目的：探讨一种体外培养人角膜缘干细胞传代、建系的方法。 设计：随机对照观察。 单位：赣南医学院。 材料：实验于2003—06／2004—04在赣南医学院科研中心与中山大学医学院眼科医院国家重点实验室完成。新鲜人角膜缘组织块分别取自2名健康人角膜组织供体，均经过供体者知情同意。RPMI-1640（Sigma R8755，含L-谷氨酰胺），200g／L胎牛血清（Gibco 16140—071）。DMEM培养基、硫酸软骨素、人表皮生长因子购自美国Sigma公司，HEPES、DMSO购自美国Gibco公司，100％甘油购自上海运佳黄浦制药有限公司，戊二醛购自德国E．Merk公司，乙醇、盐酸、丙酮、甲醛等购自北京化学试剂公司，0．25％胰蛋白酶液购自上海新华制药厂，上述试剂均为分析纯级。 方法：人角膜缘深部色素区组织块经消化后，分别在含有RPMI-1640、200g／L胎牛血清的培养瓶与以羊膜细胞外基质为培养载体的培养皿中进行体外培养。光镜及扫描电镜观察原代及传代培养细胞的生长情况；采用台盼蓝排斥实验计算冻存细胞逐代冻存处理后的复苏率。 主要观察指标：①人角膜缘干细胞体外原代及传代培养观察结果。②细胞冻存复苏率。 结果：①原代培养结果：经PRMI-1640培养基中培养1d后，倒置相差显微镜下可见培养瓶中细胞多已贴壁。均匀稀疏排列成单层并贴于培养瓶底部。②传代培养结果：传第2代时添加入表皮生长因子后，细胞分散成单层，贴壁生长旺盛。所有细胞传至第30代后形态的变异性增加明显，细胞体积明显增大，形态呈圆形或不规则圆形，密集成群。在培养液中传33代后，细胞仍然保持旺盛的分化、增殖能力，并且更适宜在羊膜细胞外基质上生长。③细胞冻存复苏率：冻存细胞的复苏率为82，2％。 结论：将人角膜缘干细胞经体外培养33代并逐代冻存后初步建立了人角膜缘干细胞系，人角膜缘干细胞更适合在含有羊膜细胞外基质为底物的培养基中生长。     

自体角膜缘干细胞羊膜移植治疗角膜缘缺陷的实验研究

目的:观察培养生长于羊膜的角膜缘干细胞移植治疗完全性角膜缘缺陷的效果。方法:建立兔完全性角膜缘缺陷模型,7d后分别给予羊膜移植、自体角膜缘移植、体外培养的角膜缘干细胞移植,比较观察3组治疗后的临床表现。结果:羊膜移植组有明显的新生血管和上皮缺损,角膜浑浊。而自体角膜缘移植和体外培养的角膜缘干细胞羊膜移植组术后角膜上皮光滑完整,无上皮缺损和新生血管新成。结论:自体角膜缘干细胞体外培养羊膜移植是治疗完全性角膜缘缺陷的有效方法,可恢复角膜缘屏障功能。     

体外培养人角膜缘上皮细胞抑制激活态角膜基质细胞的生长

背景：角膜受到损伤后,角膜基质细胞激活转变为成纤维细胞,引起角膜基质瘢痕化,导致视力下降甚至丧失。目的：观察角膜不同部位上皮细胞与角膜基质细胞的相互作用,探索角膜缘上皮细胞群能否抑制激活态角膜基质细胞的生长。方法：采用酶消化及机械外力相结合的方法获取人角膜中央、角膜旁中央及角膜缘处角膜上皮细胞与浅层角膜基质细胞,进行体外培养。相差显微镜下观察细胞形态及生长变化。待培养角膜上皮细胞与基质细胞发生接触抑制时,记作＂0周＂,采用免疫荧光染色技术检测培养细胞中PCNA及p63蛋白的表达。结果与结论：培养的角膜上皮细胞与成纤维细胞发生接触抑制时,两种细胞间有明显分界线。角膜缘组上皮细胞中PCNA及p63蛋白均有较高的表达;角膜旁中央组PCNA有较高的表达,p63蛋白阴性表达;角膜中央组PCNA表达较低,p63蛋白阴性表达;从鉴定结果中可以得出只有角膜缘组中存在一定比例的角膜缘上皮干细胞。角膜缘组上皮细胞逐渐包围并化解成纤维细胞,在相互作用4周后,成纤维细胞聚集成死细胞团,缺乏角膜缘干细胞的中央组及旁中央组中成纤维细胞生长面积增加,上皮细胞生长受到抑制甚至死亡。说明体外培养的角膜缘上皮细胞群可以抑制激活态角膜基质细胞的生长。     

自体角膜缘干细胞的培养移植

目的自体角膜缘干细胞培养后自体移植被认为是眼表疾病的最佳治疗方法,因此,有必要深入认识角膜缘干细胞分子生物学的特征、组织学解剖和微环境以及自体角膜缘干细胞移植方面的研究进展.资料来源应用计算机检索Medline 1995-01/2002-12的文章,检索词"limbus corneae,stem cells,autotransplant",限定文章语言种类为English;同时检索/1995-01/2002-12的文章,检索词"角膜缘干细胞,自体移植",限定文章语言种类为中文.资料选择选择与角膜缘干细胞组织学、生理病理学研究的相关及自体角膜缘干细胞培养移植相关文献进行初审.纳入标准①动物实验研究.②临床观察应用研究.排除标准①重复研究.②综述文献.资料提炼共收集到120多篇上述相关文献.选择符合标准的15篇文章进行综合分析.资料综合①角膜缘干细胞分子生物学的特征角膜上皮干细胞具有其他定向干细胞相似的特性,有很强的增殖和细胞分裂能力;处于低分化状态;细胞周期长;分裂不对称.②角膜缘干细胞组织学解剖在角膜缘基底部的Vogt栅栏区乳头状结构中的某些基底细胞即是角膜缘干细胞.③角膜缘干细胞与微环境干细胞的增生和分化受到血清来源的因素及多种细胞因子的调控,因此,微环境中因素的变化直接影响着角膜缘干细胞的增生分化,从而导致各种角膜损伤性疾病的发生.④自体角膜缘干细胞移植将严重眼表疾病患者健眼的自体角膜缘干细胞培养到羊膜载体上进行自体患眼眼表移植.观察术后2～5 d内角膜上皮即可再生,1个月后视觉灵敏度明显增加,术后观察4个月,可见角膜上皮完整性以及持续性新生血管消退.结论自体角膜缘干细胞培养后移植尚处于实验研究阶段,其中自体角膜缘干细胞培养后移植治疗眼表疾病已初步获得成功,然而这种移植术后远期疗效需进一步临床观察.培养后的角膜缘上皮干细胞增殖、分化,生理、生化和免疫特性的变化及移植的载体、移植后细胞的移行、黏附、增殖和分化能力等问题,以及对于干细胞独特的单克隆抗体的筛选,干细胞的纯化与体外培养,如何控制干细胞的分化及细胞因子对干细胞的影响等都尚待需进一步研究.对没有任何自体角膜缘干细胞来源双眼伤患者可否行同种异体角膜缘干细胞培养后移植?是否通过培养角膜缘干细胞的抗原性可能发生改变从而降低排斥反应的发生率?这将是最有前途的发展方向.     

兔自体骨髓间充质干细胞移植对角膜缘干细胞损伤的初步疗效研究

目的探讨兔自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对角膜缘干细胞(LSCs)损伤的初步疗效。方法 36只大白兔分为三组:BMSCs组、LSCs组与羊膜对照组,每组12只。BMSCs组采用附着有BMSCs的羊膜治疗角膜缘干细胞损伤,LSCs组将附着有角膜内皮细胞的羊膜治疗角膜缘干细胞损伤,羊膜对照组则仅将羊膜用缝合线固定于浅层巩膜上治疗角膜缘干细胞损伤。于术前、术后1周、术后2周、3周和4周对眼表的形态进行评分;并于术前、术后1周、4周、8周利用聚焦显微镜观察细胞密度和表面积。结果在移植手术实施之前三组兔的眼表形态综合评分之间的差异无统计学意义(P0.05);手术之后4周BMSCs组和LSCs组兔的眼表形态评分得以显著改善,差异有统计学意义(P0.05);手术之后4周羊膜对照组兔的眼表形态评分与手术前相比,差异无统计学意义(P0.05);手术之后4周BMSCs组和LSCs组之间的眼表形态评分之间差异无统计学意义(P0.05)。与羊膜对照组相比,其它两组手术4周之后的眼表形态评分改善更显著,差异有统计学意义(P0.05)。经过共焦显微镜观察,BMSCs组兔移植1周之后的细胞形态为圆形,而非初始的梭边形,细胞较小,密度较高,而随着时间推移,个数逐渐减少,体积变大。随着时间的推移BMSCs组与LSCs组兔移植后的平均细胞密度出现下降。手术前BMSCs组与LSCs组细胞表面积差异无统计学意义(P0.05);手术后1周、4周BMSCs组的细胞表面积显著低于LSCs组,差异有统计学意义(P0.05),手术之后8周和12周时BMSCs组与LSCs组细胞表面积差异无统计学意义(P0.05)。结论与角膜缘干细胞相似,兔自体骨髓间充质干细胞移植治疗角膜缘干细胞可以重建受损的眼表,减轻水肿,抑制血管生成。     

活体及体外条件下对角膜上皮干细胞的定位

背景：眼表存在两种形式的上皮干细胞即角膜上皮干细胞和结膜上皮干细胞,角膜上皮干细胞在角膜上皮细胞更新和角膜透明的维持方面起着重要作用。 目的：采用活体激光扫描角膜共焦显微镜和免疫荧光染色技术相结合的方法,从活体和体外层面上对角膜上皮干细胞进行定位研究。 方法：收集2009年9月至2012年9月来河南省眼科研究所就诊的单侧角膜缘干细胞缺乏患者,使用活体激光扫描角膜共焦显微镜检查患者双眼,健侧眼为对照。扫描方位依次为中央角膜及上、下、左、右方的角膜缘,记录扫描图像并分析。眼球材料来自于河南省眼库,切取角膜中央和角膜缘组织,组织包埋剂包被、冰冻切片,切片厚度5-7μm;免疫荧光染色技术检测p63、ABCG2、K3和Connexin 43在角膜中央及角膜缘上皮层的表达。 结果与结论：共有24例患者确诊为单侧角膜缘干细胞缺乏,活体激光扫描角膜共焦显微镜下患侧眼角膜病变区可见结膜细胞及杯状细胞;角膜缘区域Vogt栅栏状结构消失,色素细胞消失,取而代之的是大量纤维瘢痕化组织。免疫荧光染色示表达ABCG2和p63的细胞主要在角膜缘上皮基底层,尤其在近结膜侧的角膜缘及角膜缘中间部表达相对较高,而中央角膜上皮层细胞不表达;K3及Connexin43在角膜缘上皮基底细胞层不表达,中央角膜上皮全层表达。通过活体激光扫描角膜共焦显微镜观察及干细胞标记物检测显示角膜上皮干细胞主要存在于角膜缘外2/3区域的Vogt栅栏基底部及钉突结构中。     

Utilization of human limbal mesenchymal cells as feeder layers for human limbal stem cells cultured on amniotic membrane

Various cell culture techniques for limbal epithelial cells are currently being used for the transplantation of cultured limbal stem cells. In this study, we explored the possibility of using human limbal mesenchymal cells (HLMCs) as feeder layer for the human limbal epithelial cells (HLECs). Single cell suspension of HLECs was seeded onto denuded amniotic membranes with inactivated 3T3 fibroblasts or HLMCs as feeder layer. Expressions of Cytokeratin 3, Np63 and connexin 43 (Cx43) of the cultured epithelial cells were determined at 28 days and the ultrastructure of the epithelium was examined by transmission electron microscope after 14 days and 28 days of cultivation. In both groups, cells were differentiated into multilayer epithelium at 28 days. Basal cells of the cultured epithelium showed a strong nuclear labeling of Np63, but lacked CK3 and Cx43 expression. Transmission electron microscopy examination showed that there were abundant desmosomal contacts between the cells. The key feature the cultured epithelium was occurrence of a typical basement membrane. These results suggested that HLMCs can be used as an alternative feeder layer for HLECs, which makes the bioengineering product biologically safer for the clinical applications. Copyright © 2009 John Wiley & Sons, Ltd.     

羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤

背景：由于人胎盘来源的间充质干细胞具有多方面的优点,近年来已成为干细胞研究的热点。目的：分析鉴定羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞的生物学特性,探讨其作为皮肤种子细胞在三维气液培养构建组织工程皮肤中的应用情况。方法：用胰酶胶原酶多步消化法获取羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞,通过流式细胞术、反转录-聚合酶链反应和免疫荧光染色技术,鉴定两种细胞的表面分子标记、干细胞特性、与皮肤角质形成细胞的相似性,并利用两种细胞为种子细胞以鼠Ⅰ型胶原为基质进行三维气液培养。结果与结论：①流式细胞术检测体外培养羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞均高表达CD90、CD73、CDl05,不表达造血干细胞标志CD34以及MHC-Ⅱ类分子HLA-DR。②反转录聚合酶链反应检测到羊膜间充质干细胞表达干细胞特性基因CMCY和NANOG,羊膜上皮细胞表达干细胞特性基因CMCY和KLF4,两种细胞均有干细胞特性。③反转录-聚合酶链反应检测羊膜间充质干细胞表达皮肤角质形成细胞特性基因K19、β1-integrin、K8,羊膜上皮细胞表达K19、β1-integrin、K5、K8,免疫荧光染色见羊膜上皮细胞表达与角质形成细胞增殖相关的的特性蛋白K14,说明羊膜上皮细胞与皮肤角质形成细胞更具相似性,在特定条件下更易于分化为皮肤角质形成细胞。④利用两种细胞成功构建组织工程皮肤,苏木精-伊红染色切片显示其具有一定的皮肤结构,且羊膜上皮细胞发生了初步分化。以上结果说明羊膜间充质干细胞与羊膜上皮细胞通过三维培养构建人皮肤组织是可行的。     

A novel closed cell culture device for fabrication of corneal epithelial cell sheets

Automation technology for cell sheet‐based tissue engineering would need to optimize the cell sheet fabrication process, stabilize cell sheet quality and reduce biological contamination risks. Biological contamination must be avoided in clinical settings. A closed culture system provides a solution for this. In the present study, we developed a closed culture device called a cell cartridge, to be used in a closed cell culture system for fabricating corneal epithelial cell sheets. Rabbit limbal epithelial cells were cultured on the surface of a porous membrane with 3T3 feeder cells, which are separate from the epithelial cells in the cell cartridges and in the cell‐culture inserts as a control. To fabricate the stratified cell sheets, five different thicknesses of the membranes which were welded to the cell cartridge, were examined. Multilayered corneal epithelial cell sheets were fabricated in cell cartridges that were welded to a 25 µm‐thick gas‐permeable membrane, which was similar to the results with the cell‐culture inserts. However, stratification of corneal epithelial cell sheets did not occur with cell cartridges that were welded to 100–300 µm‐thick gas‐permeable membranes. The fabricated cell sheets were evaluated by histological analyses to examine the expression of corneal epithelial‐specific markers. Immunohistochemical analyses showed that a putative stem cell marker, p63, a corneal epithelial differentiation maker, CK3, and a barrier function marker, Claudin‐1, were expressed in the appropriate position in the cell sheets. These results suggest that the cell cartridge is effective for fabricating corneal epithelial cell sheets. Copyright © 2012 John Wiley & Sons, Ltd.     

体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力

背景：人羊膜上皮细胞具有多系分化能力,是再生医学中重要的细胞来源。目前的研究多集中于对其分化能力的考察,而体外培养过程中羊膜上皮细胞的生物学特征如何变化尚不清楚。 目的：分析体外培养对人羊膜上皮细胞生长、表型及向心肌样细胞分化的能力等生物学特性的影响,探讨原代人羊膜上皮细胞干性标志物SSEA-4的表达水平与人羊膜上皮细胞生物学特性变化之间的关联性。 方法：使用统一分离方法获得原代羊膜上皮细胞并进行体外培养。利用CCK-8、流式细胞仪及real-time PCR等手段检测不同培养阶段人羊膜上皮细胞的增殖、表型以及向心肌样细胞分化的能力。 结果与结论：不同胎儿样本来源的原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达在26.7%-97%,存在很大的个体差异。并且,随着传代次数的增加,人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平显著降低,其下降程度与原代SSEA-4的表达水平无关。另外,培养后人羊膜上皮细胞的心肌分化潜能也存在很大个体差异,且其差异与原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平的高低无关。结果提示,不同胎儿样本来源的原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平受到个体差异的影响,需要建立更准确的临床样本筛选指标来稳定获得原代高表达SSEA-4的胎儿样本,以实现对人羊膜上皮细胞的质量监控。另外,体外培养过程中SSEA-4的表达水平受到培养条件的影响,需要继续优化培养条件以维持其高表达。此外,人羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的能力受到样本个体差异以及培养条件的影响,在今后还需要进一步研究。