海藻糖对生物人工肝用人永生化肝细胞系C3A细胞低温的保存

背景:随着生物人工肝在临床上的应用,需要有一种方便、有效、实用的保护生物反应器装载细胞活力及功能的方法,设计有自主知识产权的生物人工肝用肝细胞的低温保护液迫在眉梢。目的:验证海藻糖作为低温保护剂在4℃低温保存肝细胞的作用。方法:采用C3A人永生化肝细胞系在不同低温保存液(DMEM培养液,乳酸钠林格氏液,加有不同浓度海藻糖的乳酸钠林格氏液,UW液)4℃保存24,48,72h。复苏后行细胞活力、细胞损伤指标、氧自由基代谢相关指标等检测,并通过荧光双染法观察细胞凋亡情况。结果与结论:不同低温保存液保存不同时间C3A细胞的活力、细胞损伤及细胞凋亡表现均有所不同,其中同时间点不同浓度海藻糖组均优于单用乳酸钠林格氏液组,但不如UW液组(P<0.01)。而保存24h的不同浓度海藻糖组及UW液组与乳酸钠林格氏液组相比差异无显著性意义(P>0.05),提示海藻糖能有效减轻低温对肝细胞凋亡及缺血再灌注损伤的程度,可成为低温保存液中有效及重要的保护剂组分。     

C3A细胞与L-02永生化肝细胞低温保存条件下的生物学特性比较

背景：获得大量功能良好的肝细胞是生物人工肝的核心。探索出一种可靠的肝细胞低温保存方法进而构建一个肝细胞库是目前生物人工肝研究的热点。目的：比较用UW液在4℃条件下保存已经进入Ⅲ期临床试验的C3A细胞与国内构建的永生化肝细胞株L-02细胞的生物学特性。方法：贴壁培养C3A与L-02细胞,胰酶消化,制备成细胞悬液,UW液保存。4℃低温保存0,24,48及72h后,采用流式细胞术分别测定细胞存活率与凋亡率,测定谷草转氨酶与乳酸脱氢酶释放、尿素合成功能及白蛋白分泌功能。结果与结论：随低温保存时间延长,C3A与L-02细胞存活率呈下降的趋势,但C3A细胞的存活率明显高于L-02细胞（P〈0.01）;细胞凋亡率呈上升趋势,但48h后C3A细胞同L-02细胞无差异（P〉0.05）。谷草转氨酶及乳酸脱氢酶释放呈现上升的趋势,但C3A细胞明显低于L-02细胞（P〈0.01）。白蛋白分泌功能呈下降的趋势,但C3A细胞明显优于L-02细胞（P〈0.01）。尿素合成功能呈下降的趋势,但是L-02细胞明显优于C3A细胞（P〈0.01）。结果提示,UW液4℃保存C3A细胞与L-02细胞时间不易超过48h。以C3A细胞为材料的人工肝可能更适用于肝功能衰竭合并低白蛋白血症,以L-02细胞为材料的人工肝更适用于肝功能衰竭合并肝性脑病。     

C3A细胞与L-02永生化肝细胞低温保存条件下的生物学特性比较

背景:获得大量功能良好的肝细胞是生物人工肝的核心。探索出一种可靠的肝细胞低温保存方法进而构建一个肝细胞库是目前生物人工肝研究的热点。目的:比较用UW液在4℃条件下保存已经进入Ⅲ期临床试验的C3A细胞与国内构建的永生化肝细胞株L-02细胞的生物学特性。方法:贴壁培养C3A与L-02细胞,胰酶消化,制备成细胞悬液,UW液保存。4℃低温保存0,24,48及72h后,采用流式细胞术分别测定细胞存活率与凋亡率,测定谷草转氨酶与乳酸脱氢酶释放、尿素合成功能及白蛋白分泌功能。结果与结论:随低温保存时间延长,C3A与L-02细胞存活率呈下降的趋势,但C3A细胞的存活率明显高于L-02细胞(P<0.01);细胞凋亡率呈上升趋势,但48h后C3A细胞同L-02细胞无差异(P>0.05)。谷草转氨酶及乳酸脱氢酶释放呈现上升的趋势,但C3A细胞明显低于L-02细胞(P<0.01)。白蛋白分泌功能呈下降的趋势,但C3A细胞明显优于L-02细胞(P<0.01)。尿素合成功能呈下降的趋势,但是L-02细胞明显优于C3A细胞(P<0.01)。结果提示,UW液4℃保存C3A细胞与L-02细胞时间不易超过48h。以C3A细胞为材料的人工肝可能更适用于肝功能衰竭合并低白蛋白血症,以L-02细胞为材料的人工肝更适用于肝功能衰竭合并肝性脑病。     

自制移植肝低温保存液对氧自由基的影响

背景：在肝脏移植过程中,低温保存和缺血可导致肝脏产生氧自由基而损伤肝组织。目的：研究自制器官保存液对低温保存大鼠肝脏氧自由基的影响,并与器官保存液的＂金标准＂UW液进行对比。方法：16只9周龄SD大鼠随机分为实验组和对照组,每组8只。建立SD大鼠肝脏灌注模型,分别用自制器官保存液组和UW液组灌洗肝脏,取出肝脏置于4℃保存液中,于保存24,48,72h后分别检测肝脏超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、总抗氧化能力和活性丙二醛水平。结果与结论：自制器官保存液对大鼠肝脏低温保存各时点超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、总抗氧化能力活性及丙二醛含量与UW液组比较差异均无显著性意义（P〉0.05）,表明自制器官保存液能够减轻缺血再灌注后氧自由基对大鼠肝脏的损伤。自制器官保存液对低温保存大鼠肝脏在减轻氧自由基损伤方面有较好的效果,与UW液相当。     

玻璃化低温保存卵巢癌细胞的配方及优化降温过程参数

实验采用玻璃化低温保存方法和程序降温方法来研究COC1细胞的低温保存效果。玻璃化低温保存：采用3种玻璃化溶液，①质量浓度为400g／L聚乙烯基吡咯烷酮＋质量浓度为200g／L蔗糖＋质量浓度为100g几甘露醇②VS55。③质量浓度为300gm聚乙烯基吡咯烷酮＋质量浓度为200g／L海藻糖。每种溶液以不同的比例与细胞悬液混合均匀，投入液氮保存。程序降温法：以甘油和二甲基亚砜为低温保护剂，分别以不同的比例添加到含有细胞悬液的冻存管中。然后采用两步降温法，投入液氮保存。结果玻璃化溶液（质量浓度为300g／L聚乙烯基吡咯烷酮＋质量浓度为200g／L海藻糖）保存COC1细胞可以获得最高细胞存活率，且玻璃化方法取得的存活率高于程序降温法。初步表明，用玻璃化方法长期保存卵巢癌细胞具有一定的可行性和前景，使COC1细胞能够最大限度的保持较好的生理功能。     

自制多脏器保存液对大鼠睾丸一氧化氮合酶的影响

背景：在睾丸移植过程中,低温保存和缺血可导致睾丸产生氧自由基而损伤睾丸组织。目的：观察自制多脏器保存液对低温保存大鼠睾丸一氧化氮合酶的影响。方法：采用自制多脏器保存液和UW液低温保存大鼠睾丸,分别于保存24,48,72h时切取睾丸,测定睾丸组织内的总抗氧化能力和一氧化氮合酶活性。结果与结论：自制多器官保存液低温保存各时点大鼠睾丸一氧化氮合酶活性和总抗氧化能力与UW液组比较差异均无显著性意义（P〉0.05）。表明自制多脏器保存液能明显减轻低温保存大鼠睾丸氧自由基损伤,其作用与经典的美国威斯康星大学UW保存液基本相当。     

不同灌注方法对保存期大鼠供肝胆管细胞的影响

目的:研究灌注肝动脉和冲洗胆管方式在冷缺血期对大鼠供肝胆管细胞的影响。方法:各组均以威斯康星大学液(UW液)灌注大鼠供肝门静脉,以不同方式灌注肝动脉和冲洗胆管,在冷保存的不同时间段观察胆管细胞的变化。结果:冷保存4h后,各组光镜下胆管细胞无明显变化。冷保存8h后,UW液灌注大鼠供肝门静脉、肝动脉,经UW液、Ringer's液冲洗胆管的两组胆管细胞变化较其它组变化小,并且两组之间无明显差异。冷保存12h后经UW液灌注大鼠供肝门静脉、肝动脉及冲洗胆管组胆管细胞变化较其它组变化小。结论:灌注肝动脉和冲洗胆管有助胆管细胞保存,8h内只要能够完全清除胆盐或降低胆盐浓度,即可产生相同的保护胆管效果。随着冷保存时间的延长,应用UW液冲洗胆管可以提高供肝胆管细胞的保存效果。     

重型肝炎患者血浆对HepG2细胞的损伤作用

目的观察重型肝炎患者血浆(severe hepatitis plasma,SHP)对HepG2细胞的损伤,为保持生物人工肝反应器内肝细胞材料活力研究提供实验依据,以期提高生物人工肝的临床治疗效果.方法复苏培养HepG2细胞,通过MTT法测细胞活力、检测LDH漏出量和细胞凋亡率及观察形态变化四个方面了解SHP对HepG2细胞的损伤情况.结果①所有浓度SHP培养的HepG2细胞活力都下降,100%SHP组下降幅度最大;②HepG2细胞在SHP作用下乳酸脱氢酶(LDH)漏出量与对照组相比有显著性差异,并且差异随时间延长加大;③不管灭活与否、浓度高低,SHP培养的HepG2细胞凋亡率都远高于对照组,最高为灭活前100%SHP组;④SHP可致HepG2细胞形成膜大疱,高浓度时致较多细胞死亡.结论SHP能够损伤HepG2细胞,在生物人工肝的临床应用中,有必要对反应器中的肝细胞采取防护措施.     

海藻糖保护同种带瓣大动脉的最适浓度

背景：目前液氮低温保护组织和器官技术已经非常成熟,但其保护剂一直以来争论不一。目的：观察不同冷冻保护剂对液氮深低温冻存同种带瓣大动脉组织细胞凋亡和代谢的影响,寻求最佳的冷冻保护剂及冷冻保护剂的最适浓度。方法：取新西兰大白兔带瓣主动脉、肺动脉标本,将其在液氮中冻存12,15,18个月,冻存液分别使用0.1mol/L二甲基亚砜,0.1mol/L海藻糖,0.1mol/L海藻糖＋0.1mol/L二甲基亚砜,0.2mol/L海藻糖＋0.1mol/L二甲基亚砜,0.3mol/L海藻糖＋0.1mol/L二甲基亚砜。标本复温后,免疫组织化学方法检测标本的细胞凋亡情况,葡萄糖消耗量测定法检测组织细胞的代谢水平。结果与结论：免疫组织化学和葡萄糖消耗量测定结果均显示经0.1mol/L海藻糖＋0.1mol/L二甲基亚砜,0.2mol/L海藻糖＋0.1mol/L二甲基亚砜冻存液处理的标本冻存效果最好,其次是经0.3mol/L海藻糖＋0.1mol/L二甲基亚砜处理和经0.1mol/L海藻糖单独处理的标本,单独使用0.1mol/L二甲基亚砜处理的标本冻存效果最差。说明海藻糖对液氮深低温保存同种带瓣大动脉活性有很好的保护作用,单独使用海藻糖优于单独使用二甲基亚砜,联合应用海藻糖和二甲基亚砜效果更好,且联合应用的海藻糖最佳浓度范围是0.10~0.20mol/L。     

自制肾保存液的研制及动物实验研究

目的：探讨自制肾保存液（HCA-Ⅱ）的研制及草犬肾脏的低温保存.方法：采用草犬肾脏非循环离体灌注模型,HCA-Ⅱ液、UW液和高渗枸橼酸盐嘌呤溶液（HC-A液）低温保存肾脏后,观察移植后肾功能恢复情况.结果：HCA-Ⅱ液组保存48、72 h后,移植肾功能指标明显优于HC-A液组（P＜0.05）,与UW液组无明显差异;低温保存供肾24 h,3组上述指标差异无显著性.结论：HCA-Ⅱ液保存犬肾48 h及72 h效果优于HC-A液,与UW液相当.[著者文摘]     

醋酸林格氏液在肝癌根治术中的应用

目的：观察醋酸林格氏液（勃脉力A）在肝癌根治术中对酸碱平衡和电解质的影响。方法：将42例拟于全麻下行肝癌根治术的患者随机分为两组,每组各21例,术中分别静脉输入勃脉力A（A组）和乳酸林格氏液（B组）。术中胶体液和血液制品的输入根据血压（BP）、心率（HR）、中心静脉压（CVP）和血红蛋白（Hb）等进行调节。于麻醉前（TO）、手术开始时（T1）、肿物切除后（T2）、手术结束时（T3）、术后8h（T4）采取动脉血检测并记录血气、电解质及乳酸值,据检测结果适量输注碳酸氢钠、氯化钾及葡萄糖酸钙,并分别记录用量。结果：两组患者晶体、胶体液和血液制品输入量无统计学意义（P〉0．05）。相比B组,A组使用碳酸氢钠的剂量显著降低,葡萄糖酸钙的剂量显著升高（P〈0．05）;氯化钾使用剂量无统计学意义（P〉0．05）。A组乳酸值、pH值、BE值在不同时间点的比较差异无统计学意义（P〉0．05）,B组乳酸值、pH值、BE值在组间、组内比较差异均有显著性（P〈0．05）。结论：勃脉力A用于肝癌根治术有利于动脉血酸碱平衡的稳定,对稳定机体内环境具有安全、有效的特点,但可引起血钙离子浓度降低,注意加强监测,并补钙。     

心脏骤停后静脉输注4℃冰林格液配合亚低温仪诱导亚低温脑复苏

【目的】观察心脏骤停后静脉输注4℃冰林格液诱导亚低温脑复苏的效果和安全性。【方法】随机将43例不同原因导致心脏骤停患者分成治疗组（21例）和对照组（22例）。治疗组采用快速静脉榆注4℃的冰林格液（20mL／kg,30～50mL／min）。对照组采用传统的头部冰帽降温法。两组均用降温毯维持目标温度（32℃～34℃）达24h后开始复温。记录两组从自主循环恢复（ROSC）后到开始实施降温的时间（ROSC-IH）和从开始降温到达到目标温度的时间（IH—TT）以及并发症的发生率。【结果】治疗组平均IH—TT（3．82±1．61h）短于对照组（7．33±2．50h）（P〈0．01）。治疗组中心律失常、电解质紊乱和肌颤的发生率高于对照组。其它并发症两组无统计学差异（P〉0．05）。治疗组中没有发生快速输液引起的肺水肿。3个月后随访大脑功能评分（CPC）,治疗组良好脑功能级（CPCI）显著高于对照组（P〈0．05）,3个月后脑死之显著低于对照组（P〈0．05）。【结论】静脉输注4℃冰林格液诱导亚低温是一种安全、有效、简单易行的降温技术,值得在基层医院推广。     

丹参对大鼠移植肝血红素氧合酶1表达的影响

背景：器官移植前使用丹参预处理能够保护组织缺血-再灌注损伤,改善移植器官存活率。目的：观察含丹参的冷灌注液对同种异体大鼠移植肝脏中血红素氧合酶1表达的影响,以及对供体肝脏缺血-再灌注损伤的保护作用。方法：将SD雄性大鼠随机分成UW液组（术中使用UW液灌注保存）、丹参＋UW液组（术中使用丹参＋UW液灌注保存）、ZnPP预处理组（移植前24h腹腔内注射ZnPP,术中使用丹参＋UW液灌注保存）,建立稳定的大鼠同种异体肝移植模型。同时取10只正常大鼠作为正常对照。结果与结论：丹参＋UW液组和UW液组血清总胆红素、谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平明显低于ZnPP预处理组（P〈0.01）。血红素氧合酶1mRNA及其蛋白在丹参＋UW液组中较UW组表达更明显,在ZnPP预处理组中表达明显受到抑制（P〈0.05）。丹参＋UW液组肝脏Suzuki标准评分明显低于ZnPP预处理组及UW液组（P〈0.05）。表明丹参能上调同种异体的大鼠移植肝脏中血红素氧合酶1mRNA及其蛋白的表达,减轻供肝缺血-再灌注损伤,保护移植大鼠肝脏。     

Apoptosis inhibition during preservation by fructose-1,6-diphosphate and theophylline in rat intestinal transplantation

OBJECTIVE: This study evaluated the effect of fructose-1,6-diphosphate (FDP), theophylline, or the addition of both together to the preservation solution (University of Wisconsin [UW]) on apoptosis during preservation and the effect of apoptosis minimization on the early reperfusion period after transplantation. DESIGN: Prospective, randomized, and controlled animal study. SETTING: Laboratory of a research institute. SUBJECT: Male Wistar rats. INTERVENTIONS: The jejunum was isolated and preserved for 6 hrs in UW solution. FDP and theophylline were added to the UW solution to evaluate their effects on apoptosis both alone and together. The role of adenosine with respect to FDP was examined by increasing endogenous adenosine. In addition, rats were subjected to intestinal transplantation for the evaluation of the effect of apoptosis on bacterial translocation, histology, and neutrophil infiltration after reperfusion. MEASUREMENTS AND MAIN RESULTS: Caspase-3 activity, assayed both in vitro or by cleaved caspase-3 levels in Western blots or immunohistochemically, and the number of terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated biotin-dUTP nick-end labeling (TUNEL)-positive cells decreased with FDP and with theophylline addition to UW solution. Increase of endogenous adenosine reversed the antiapoptotic effect of FDP. FDP and theophylline together demonstrated a more pronounced antiapoptotic effect and prevented bacterial translocation after transplantation. CONCLUSION: Supplementary FDP to UW solution decreased apoptosis through an adenosine-independent mechanism. Addition of theophylline to UW solution decreased both apoptosis and bacterial translocation. Concomitant theophylline and FDP addition to preservation solution is recommended to maintain low levels of apoptosis during intestinal hypothermic preservation and to decrease bacterial translocation.     

左卡尼汀强化St.Thomas No.2液对低温离体心脏的保存效果

背景：在心脏瓣膜置换中应用添加左卡尼汀的心脏停搏液可明显减轻心肌线粒体的脂质过氧化反应,保护心肌细胞。目的：观察加入左卡尼汀的St.Thomas No.2液对大鼠离体心脏低温保存的效果。方法：利用Langendorff灌注装置建立SD大鼠离体心脏灌注和工作模型,随机分成4组,其中2组采用St.Thomas No.2液作为心脏停搏液与保存液分别保存心脏4h、6h,另2组采用添加左卡尼汀的St.Thomas No.2液作为心脏停搏液与保存液分别保存心脏4h、6h。结果与结论：与St.Thomas No.2液保存4h组比较,添加左卡尼汀的St.Thomas No.2液保存4h组心脏心率、冠状动脉流量、左心室收缩峰压和左心室内最大上升速率及心肌含水量、ATP含量差别无显著性意义（P〉0.05）,但心肌酶漏出量明显减少（P〈0.05）;添加左卡尼汀的St.Thomas No.2液保存6h组上述指标检测结果均优于St.Thomas No.2保存6h组（P〈0.05）。提示左卡尼汀强化的St.ThomasNo.2液可显著提高大鼠离体心脏的低温保存效果。     

前列腺素E1对大鼠供肝灌注冷保存的保护作用

目的应用高渗构橼酸盐腺嘌呤液（HCA液）加前列腺素E1（PGE1）对大鼠供肝进行灌注,探讨PGE。在供肝灌注冷保存中对肝脏的保护作用。方法采用雄性SD大鼠肝脏单纯冷保存离体灌注模型,随机分为实验组和对照组。每组30只。实验组是HCA灌注液中加入PGE．加器官保存液（UW液）注取肝,对照组则单纯使用HCA液加UW液灌注取肝。经不同冷保存时间后,检测丙氨酸转氨酶（ALT）、乳酸脱氢酶（LDH）、髓过氧化物酶（MPO）以及丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及病理学变化。结果在10h和20h保存时间点,实验组ALT和LDH以及MDA和MPO均明显低于对照组,且酶值水平均随冷保存时间延长增高（P〈0．01）;实验组SOD高于对照组,且随时间延长降低（P〈0．01）。病理变化可见实验组肝窦、肝细胞索结构清晰,肝轻度肿胀,无细胞坏死。结论HCA液中加入PGE1后对肝脏冷保存损伤具有一定的保护作用,其机制可能与PGE1在灌注过程中通过改善微循环提高组织的抗氧化能力,减少中性粒细胞与肝窦库普弗细胞及内皮细胞的黏附,减轻多种组织和细胞损伤等因素有关。