人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景:骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。目的:观察hVEG F165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。方法:体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1:3比例的混合液转染,并分为3组:转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。结果与结论:转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P<0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P>0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P<0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

hVEGF165在兔骨髓间充质干细胞中的表达

目的培养和鉴定兔骨髓间充质于细胞，基因转染后观察hVEGF165在其中的表达。方法体外培养兔骨髓间充质干细胞，以流式细胞仪检测其表面抗原（CD29、CD44、CD45、HLA—DR）的表达。通过腺病毒载体转染hVEGF165后，采用RT—PCR、Western blot法检测hVEGF165在细胞中的表达。结果通过流式细胞仪检测表明培养的细胞为兔骨髓间充质干细胞，RT—PCR法、Western blot法检测结果均表明hVEGF165基因转染兔骨髓间充质干细胞后能在其中表达。结论成功培养兔体外骨髓间充质干细胞，基因转染后细胞能有效表达hVEGF165。     

腺病毒介导的肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死

背景：骨髓间充质干细胞可以分化为心肌细胞,促进血管再生,但在移植早期其自身分泌的细胞因子不足以维持良好的分化和再生。目的：验证腺病毒介导的肝细胞生长因子和血管内皮生长因子双基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞移植对新西兰兔梗死心肌组织的修复重建和血管再生的影响。方法：腺病毒介导肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染BrdU标记的新西兰兔骨髓间充质干细胞。取新西兰兔50只建立急性心肌梗死模型,4周后随机分为5组,分别于梗死心肌内注射：①骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子。②骨髓间充质干细胞/Ad.肝细胞生长因子。③骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子。④骨髓间充质干细胞。⑤对照组注射等量无血清IMDM培养液。移植4周后观察移植细胞的分化和新生血管的形成,并通过超声多普勒检测心功能变化。结果与结论：除对照组外,其余4组兔心功能都较移植前有明显改善（P〈0.05）,其中移植双基因转染骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子组兔的心功能改善程度要明显高于其他3组。部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞,参与构成了梗死区域的新生毛细血管。与对照组比较,其余4组都有明显的血管新生（P〈0.05）,而以骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子组最显著。提示肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞移植于梗死心肌可以促进心肌再生和新生血管的形成,明显改善心功能。     

血管内皮生长因子165转染骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白的表达

背景：血管内皮生长因子是一种有效的血管形成和通透性诱导因子,其中在体内以血管内皮生长因子165和血管内皮生长因子121表达为主,具有强烈的促血管新生作用。目的：观察以血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞,继而分化为血管内皮细胞的可行性。方法：分离提取50gSD大鼠骨髓间充质干细胞,采用流式细胞仪鉴定,将携有血管内皮生长因子165基因的质粒pGLV．EFla,采用慢病毒转染骨髓间充质干细胞,转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。结果与结论：转染后12h可见细胞内有绿色荧光蛋白表达,48h后表达增多,72h后达到高峰,其后部分细胞荧光开始减退。结果证明血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞内有绿色荧光蛋白表达,提示细胞转染成功,骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及血管内皮生长因子对其产生的诱导分化作用

目的：目前有关骨髓间充质干细胞向内皮细胞诱导分化的研究较少。本实验分离和培养人骨髓间充质干细胞，用带有VEGF165的质粒转染人骨髓间充质干细胞，探讨血管内皮生长因子对其体外诱导分化的作用。 方法：实验于2005—04／2006—04在吉林大学人兽共患病教育部重点实验室完成。取成人的已排除血液系统肿瘤疾病的新鲜骨髓（自愿提供），采用Percoll梯度分离培养骨髓间充质干细胞，于倒置显微镜下观察细胞形态变化和生长情况。原代细胞培养至增殖接近融合状态时，单克隆培养法分离传代培养，扩增骨髓间充质干细胞。采用流式细胞术检测细胞免疫学表型。在原核细胞大肠杆菌DH5α中复制扩增和提取，纯化、克隆pcDNA3．0-VEGF165质粒。用脂质体转染法转染骨髓间充质干细胞：应用流式细胞术检测诱导后骨髓间充质干细胞免疫学表型变化j并采用免疫荧光染色鉴定转染情况，并设质粒空载和未转染的骨髓间充质干细胞为对照。 结果：人骨髓间充质干细胞原代培养1周后，造血细胞消失，贴壁细胞体积增大，呈现梭形外观，有粗大的细胞突起伸出。2周后细胞融合成单层，梭形突起变长，排列有明显的方向性，细胞排列成旋涡状、网状、辐射状。流式细胞术显示，人骨髓间充质干细胞免疫学表型CD44、CD29阳性，CD34、CD31、CD45阴性。VEGF165诱导骨髓间充质千细胞后CD44表达明显降低，CD31明显升高。免疫荧光染色显示，用FITC标记后的VEGF抗体使细胞显现绿色荧光，用cy3标记的CD31抗体使细胞显现了红色荧光。 结论：转染后的骨髓间充质干细胞细胞表型发生明显转变，CD31表达率明显增高，呈现典型的内皮细胞的表型特征，这说明骨髓间充质干细胞具有向内皮细胞分化的潜能。     

不同缺氧状态下骨髓间充质干细胞表达血管内皮生长因子的差异

背景:骨髓间充质干细胞在植入心肌缺血,梗死区域后,面临缺氧缺血微环境,其如何通过旁分泌细胞因子来发挥重建侧支微循环、修复心肌的作用,是目前存在争论的焦点之一.目的:探讨骨髓间充质干细胞在不同时程缺氧环境下血管内皮生长因子的表达规律.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-03/1 1在南昌大学第二附属医院分子医学实验中心完成.材料:清洁级新西兰大白兔2只,由南昌大学医学院实验动物中心提供.方法:常规差速贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞.细胞缺氧微环境在AnaeroPack密闭方盒中产生,盒中置入一次性缺氧催化袋GENbox anaer(可吸收O2,产生CO2),指示条监测氧的耗竭,根据缺氧培养时程分为缺氧0,6,12,24 h组.主要观察指标:RT-PCR法检测血管内皮生长因子mRNA的表达,Western Blot法检测血管内皮生长因子蛋白的表达.结果:血管内皮生长因子mRNA及蛋白的表达水平均为缺氧0 h组<6 h组<12 h组<24 h组(P<0.01).结论:缺氧24 h以内的培养环境下,骨髓间充质干细胞表达血管内皮生长因子的水平呈缺氧时程依赖性增加.     

腺病毒介导血管内皮生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞移植梗死心肌的血管再生

背景：骨髓间充质干细胞的存活率与良好的血液供应关系密切，在移植早期其自身所分泌产生的促血管生长因子不足以刺激血管新生而容易导致移植的细胞死亡。目的：观察骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染对大鼠梗死心肌组织修复重建、血管再生的影响。设计、时间及地点：随机分组设计的细胞基因工程实验，于2006-01／2007-12在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。材料：选取具有相同遗传背景的雄性SD大鼠40只建立急性心肌梗死模型，6~8周龄．体质量250～300g。方法：体外分离、培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞，以BrdU标记骨髓间充质干细胞。腺病毒介导血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞。将造模后大鼠随机分为4组．每组10只：基因转染骨髓间充质干细胞组，梗死心肌内注射体外转染腺病毒介导血管内皮生长因子的骨髓间充质干细胞；骨髓间充质干细胞组，梗死心肌内注射骨髓间充质干细胞；基因转染组，注射腺病毒介导的血管内皮生长因子；对照组，注射无血清IMDN培养液。主要观察指标：移植4周后观察移植细胞分化和新生血管的形成，并通过超声多普勒检测心功能变化。结果：细胞移植4周后，基因转染骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组移植区移植细胞表现为心肌肌钙蛋白T染色阳性，细胞呈肌样细胞形态，并且两组心功能都较移植前有明显改善，基因转染骨髓间充质干细胞组改善程度优于骨髓间充质干细胞组。部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞，参与构成了梗死区域新生毛细血管，相对于单纯细胞移植与细胞因子移植，细胞移植结合血管内皮生长因子基因转染促进毛细血管新生更明显。结论：骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染可以通过促进心肌再生和新生血管的形成来重建缺血心肌，明显改善心功能。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染免骨髓间充质干细胞

背景:碱性成纤维细胞生长因子对于创伤修复具有明显的促进作用,但局部应用难以持久地发挥作用.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞后的表达情况.设计、时间及地点:细胞基因学体外观察,于2009-03/08在云南大学生命科学院完成.材料:日本大耳白兔1只,购于昆明医学院动物科.pCDNA3.1质粒为美国Invitrogen产品.方法:抽取兔髂前上棘骨髓,采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,待细胞融合至培养瓶底80%时消化传代.参考GeneBank碱性成纤维细胞生长因子cDNA序列设计合成基因,电泳纯化后xhol I、BamH I双酶切回收凝胶,以限制性核酸内切酶对PcDNA Vector质粒进行酶切、电泳和凝胶回收,连接碱性成纤维细胞生长因子DNA与PcDNA Vector质粒,构建pCDNA-碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体,运用脂质体转染法将重组体转染至兔骨髓间充质干细胞中,并筛选稳定转染株.主要观察指标:骨髓间充质干细胞表面抗原的表达,Western blot法检测目的蛋白的表达.结果:流式细胞仪检测结果示所培养细胞表面抗原呈CD90,CD44阳性,CD45呈阴性;免疫组化检测结果示骨髓间充质干细胞血管源性细胞表面抗原CD34呈阴性,而相对特异性标记物CD44呈阳性.转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞提取的细胞裂解液中,在M_r 23 000处有一条明显阳性杂交带;而转染pCDNA3.1(-)空载体的骨髓间充质干细胞提取蛋白未见阳性条带.结论:实验成功地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞,该目的基因可稳定表达.     

骨髓间充质干细胞的基因转染

1人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达,2011年15卷10期1769页。2体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定,见2010年14卷19期3507页。3碱性成纤维细胞生长因子基因转染兔骨髓间充质干细胞,见2009年13卷49期9687页。     

血管内皮生长因子对人骨髓和脐带间充质干细胞中内皮细胞组分的影响

本研究旨在比较人骨髓间充质干细胞(BM-MSC)和脐带间充质干细胞(UC-MSC)中的内皮细胞(EC)比例,并探讨血管内皮生长因子(VEGF)对MSC中EC比例的影响。利用流式细胞术检测EC标志CD34+CD133+和vWF+CD31+双阳性细胞的比例,用瑞氏染色观察经VEGF作用的MSC细胞形态变化,免疫荧光技术观察CD34、CD133、CD31、VWF的表达,最后采用实时荧光定量PCR检测VEGF对EC标志性基因表达的影响。结果表明:BM-MSC和UC-MSC中存在少量EC及内皮祖细胞(EPC),经VEGF 10 ng/ml作用24 h后,MSC的长宽比变大,EC比例上升而EPC比例下降,EC相关标志基因Tie-2和ecNOS等的表达均上调,其中UC-MSC对VEGF的反应更明显。结论:BM-MSC和UC-MSC中存在少量的EC及EPC,VEGF可以提高EC的比例和细胞功能。     

hVEGF165基因转染后骨髓间充质干细胞蛋白分泌功能及成骨活性的检测

目的：血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在血管再生和骨组织再生过程中起着重要的调节作用。观察hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞分泌VEGF的功能及转染后细胞的成骨活性。 方法：实验于2004—07／2005—12在江苏省血液研究所国家重点实验室完成。①体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞，传代培养后以1μg PcDNA3．1-hVEGF165：3μL阳离子脂质体Lipofectamine的比例转染，通过免疫组织化学SP方法检测转染后细胞中外源性VEGF的表达。②体外分离、培养大鼠肾微血管内皮细胞，分别加入hVEGF165基因转染48h及1周后细胞上清、空载体转染及未转染组细胞上清，MTT法观察细胞增殖情况，以了解转染后细胞培养上清中VEGF的生物学活性。③测定在正常条件培养和成骨条件培养下，转染后细胞上清中碱性磷酸酶、骨钙素的水平。 结果：①hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF蛋白。②hVEGF165基因转染48h组大鼠肾微血管内皮细胞A值高于空载体转染及未转染组（P〈0．05），但低于hVEGF165基因转染1周组。③成骨条件培养下，基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的分泌量明显高于未转染组（P〈0．05）；而在正常条件培养下，基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的表达分泌量较低。 结论：①采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF，且这种生物学活性呈剂量依赖性。②在成骨条件培养下，转染hVEGF165基因后骨髓间充质干细胞的成骨能力增强。     

腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染促进人骨髓间充质干细胞的成骨特点

目的：课题组以前的实验证实，人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒可高效感染人骨髓间充质干细胞，使之大量表达人血管内皮生长因子165，促进局部新生血管生成，有利于组织修复。实验观察腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨能力的影响。 方法：实验于2005—03／2006—01在郧阳医学院附属人民医院临床研究所和创伤骨科完成。人骨髓间充质干细胞取自健康成年男性自愿者，得到医院伦理道德委员会批准。将人骨髓间充质干细胞体外扩增纯化后随机分为4组：①人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组。②β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组。③阳性对照组：培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠。④空白对照组：不给予特殊处理。各组细胞处理后12d，应用全自动生化分析仪检测各组培养上液碱性磷酸酶活性；于处理后14d，应用VonKossa染色法检测人骨髓间充质干细胞中骨胶原结节形成情况。 结果：①经多次换液传代，人骨髓间充质干细胞呈均一梭形形态。处理后人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组细胞形态逐渐趋于扁平，突起减少；β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组形态无明显变化。②Yon Kossa染色人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组可见大量红色骨胶原结节形成，明显多于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组。③人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组培养上清碱性磷酸酶活性显著高于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组（F=165．18，P=0．00）。结论：人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒基因转染对人骨髓间充质于细胞成骨能力具有促进作用，验证了转染人血管内皮生长因子165的人骨髓间充质干细胞移植治疗骨疾病的可行性。     

pcDNA3．1-VEGF165质粒转染骨髓基质干细胞后血管内皮生长因子的表达

目的:检测pcDNA3.1-VEGF165载体转染对兔骨髓基质干细胞血管内皮生长因子表达的影响。方法:实验于2005-07/2006-01在山东省青岛市市立医院中心试验室完成。①pcDNA3.1-VEGF165质粒由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科杨述华教授惠赠。②选取1月龄新西兰大白兔1只,无菌条件下取胫骨和股骨,进行骨髓基质干细胞的分离与培养。③转染前24h计数细胞,每孔5×105细胞接种于6孔板,待骨髓基质干细胞达到80%～90%融合时准备转染,设立未转染组、空载体组和载体组。未转染组无特殊处理,空载体组转染pcDNA3.1载体,载体组转染pcDNA3.1-VEGF165。④转染后72h,反转录聚合酶链反应检测各组骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子165mRNA的表达;酶联免疫吸附法检测各组骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子165蛋白的含量。结果:①骨髓基质细胞分离培养形态观察:初始分离的骨髓细胞呈圆形,大小不一;24h后有少量细胞贴壁;48h后贴壁细胞部分为成纤维样细胞;72h贴壁的成纤维样细胞数不断增加;96h后贴壁生长的细胞主要为梭形的成纤维样细胞;分瓶后细胞形成克隆;传代后细胞贴壁生长,分裂相增多,并不断增殖分化形成均一的梭形细胞。②转染72h后各组细胞血管内皮生长因子165mRNA的表达情况:反转录聚合酶链反应检测到载体组在576bp处有明显条带,空载体组和未转染组均未见血管内皮生长因子165表达。③转染72h后各组细胞血管内皮生长因子165蛋白含量检测结果:酶联免疫吸附结果显示,载体组转染pcDNA3.1-VEGF165载体的骨髓基质细胞培养上清液中血管内皮生长因子165蛋白浓度为(170.1±14.3)ng/L,而空载体组与未转染组均未检测到血管内皮生长因子165蛋白表达,差异有显著性意义(t均=42.206,P=0.000)。结论:应用pcDNA3.1-VEGF165载体转染,可使兔骨髓基质干细胞获得外源性血管内皮生长因子165基因和蛋白的表达。     

同种异体骨髓间质干细胞移植联合血管内皮细胞生长因子基因转染治疗心肌梗死

背景:骨髓间质干细胞和血管内皮细胞生长因子移植具有促进血管再生、改善心功能的作用,但是二者联合应用是否优于单独应用尚不清楚。目的:观察同种异体骨髓间质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染对大鼠急性心肌梗死血管再生和心功能的影响。设计:大鼠骨髓间质干细胞培养采用单一样本观察;细胞移植和基因转染采用随机对照动物实验。单位:华中科技大学协和医院心内科,同济医学院心血管病研究所。材料:健康雄性Wistar大鼠94只。表达载体PAdTrack/VEGF165。方法:实验于2004-06/2005-06在同济医学院心血管病研究所实验室完成。①体外分离、纯化、培养大鼠骨髓间质干细胞,以5-溴-2’-脱氧尿苷标记细胞。②制备、抽提、纯化、鉴定质粒PAdTrack/VEGF165。③结扎冠状动脉建立急性心肌梗死模型2周后,随机将其分为4组,每组均为12只,干细胞 质粒组、干细胞组、质粒组、对照组,分别进行心肌内大鼠骨髓间质干细胞移植和/或VEGF165转染、DMEM注射。④4周后行免疫组织化学和超声心动图检查。主要观察指标:①各组大鼠梗死及缺血区免疫组织化学和苏木精-伊红染色检查。②血管计数。③超声心动图检查。结果:48只大鼠进入结果分析。①干细胞 质粒组和干细胞组梗死及缺血心肌处可见大量5-溴-2’-脱氧尿苷标记的移植细胞,其中缺血心肌处部分移植细胞分化为血管内皮细胞并形成新生毛细血管。②Ⅷ因子染色阳性的新生血管密度分布为干细胞 质粒组>质粒组>干细胞组>对照组(P均<0.01)。③细胞移植和基因转染治疗后室壁厚度和室壁运动幅度改善,射血分数值增加幅度为干细胞 质粒组>干细胞组>质粒组>对照组(P均<0.01)。结论:同种异体骨髓间质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染能进一步增强大鼠梗死缺血区血管再生、改善室壁厚度和心功能。     

同种异体骨髓间质干细胞移植联合血管内皮细胞生长因子基因转染治疗心肌梗死

背景：骨髓间质干细胞和血管内皮细胞生长因子移植具有促进血管再生、改善心功能的作用，但是二者联合应用是否优于单独应用尚不清楚。目的：观察同种异体骨髓间质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染对大鼠急性心肌梗死血管再生和心功能的影响。设计：大鼠骨髓间质干细胞培养采用单一样本观察；细胞移植和基因转染采用随机对照动物实验。单位：华中科技大学协和医院心内科，同济医学院心血管病研究所。材料：健康雄性Wistar大鼠94只。表达载体PAdTrack／VEGF165。方法：实验于2004—06／2005—06在同济医学院心血管病研究所实验室完成。①体外分离、纯化、培养大鼠骨髓间质干细胞，以5-溴-2’-脱氧尿苷标记细胞。②制备、抽提、纯化、鉴定质粒PAdTrack／VEGF165。③结扎冠状动脉建立急性心肌梗死模型2周后，随机将其分为4组，每组均为12只，干细胞＋质粒组、干细胞组、质粒组、对照组，分别进行心肌内大鼠骨髓间质干细胞移植和／或VEGF165。转染、DMEM注射。④4周后行免疫组织化学和超声心动图检查。主要观察指标：①各组大鼠梗死及缺血区免疫组织化学和苏木精-伊红染色检查。②血管计数。⑧超声心动图检查。结果：48只大鼠进入结果分析。①干细胞＋质粒组和干细胞组梗死及缺血心肌处可见大量5-溴-2’-脱氧尿苷标记的移植细胞，其中缺血心肌处部分移植细胞分化为血管内皮细胞并形成新生毛细血管。②Ⅷ因子染色阳性的新生血管密度分布为干细胞＋质粒组〉质粒组〉干细胞组〉对照组（P均〈0．01）。③细胞移植和基因转染治疗后室壁厚度和室壁运动幅度改善，射血分数值增加幅度为干细胞＋质粒组〉干细胞组〉质粒组〉对照组（P均〈0．01）。结论：同种异体骨髓间质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染能进一步增强大鼠梗死缺血区血管再生、改善室壁厚度和心功能。     

腺相关病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染后人骨髓基质细胞的成骨分化

背景:现阶段诱导骨髓基质细胞分化成骨的方法大致分为在化学药物作用、细胞因子作用以及转基因作用下的分化等.目的:观察腺相关病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染对人骨髓基质细胞成骨能力的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/12在郧阳医学院附属人民医院临床研究所和骨关节科完成.材料:人骨髓基质细胞取自健康成年男性自愿者.人血管内皮生长因子165基因重组腺相关病毒、β半乳糖酐酶基因重组复制缺陷性腺相关病毒由课题组前期构建.方法:抽取健康志愿者髂前上棘骨髓,采用全骨髓法分离培养人骨髓基质细胞.体外扩增纯化后取50%融合的P2代细胞,随机分为4组:腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组向细胞培养液中加入人血管内皮生长因子165基因重组腺相关病毒1×1010OPU/mL,孵育24 h后换为普通完全培养液继续培养.β半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒组加入半乳糖酐酶基因重组复制缺陷性腺相关病毒,其余处理与前组相同.阳性对照组向培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠.空白对照组仅加入普通完全培养液,不进行特殊处理.主要观察指标:全自动生化分析仪检测培养上清碱性磷酸酶活性,免疫组化染色观察血管内皮生长因子的表达,Von Kossa染色检测人骨髓基质细胞中骨胶原结节形成.结果:处理后2周,腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组与阳性对照组的培养上清碱性磷酸酶活性基本相似(P>0.05),而β半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒组、空白对照组的培养上清碱性磷酸酶活性均明显降低(P<0.01).血管内皮生长因子主要在骨髓基质细胞的胞浆内表达,腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组阳性细胞数明显多于其他3组.腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组和阳性对照组可见大量红色骨胶原结节形成,明显多于β半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒组、空白对照组.结论:基因重组腺相关病毒人血管内皮生长因子165转染对人骨髓基质细胞成骨能力具有促进作用.     

重组hVEGFl65腺相关病毒载体构建及体外感染骨髓基质干细胞血管内皮生长因子的表达

背景:目前用于基因治疗的病毒载体对机体具有一定免疫原性,且存在潜在感染危险,限制了临床的应用.目的:拟构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒,以其作为基因载体感染兔骨髓基质干细胞,体外检测病毒生物学活性及功能.设计、时间和地点:开放性实验,于2007-03/11在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:兔骨髓基质干细胞由试验者原代培养,取自成年新西兰大白兔;人脐静脉内皮细胞取自健康产妇婴儿脐带,产妇对本实验知情同意.方法:从含有hVEGF165基因的pUC18-hVEGF165质粒中扩增出hVEGF165片段,构建重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP.将此质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper共转染AAV-293细胞,通过同源重组产生重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP.应用该重组病毒感染体外培养的兔骨髓基质干细胞主要观察指标:荧光显微镜下监测病毒包装效率,感染AAV-HT1080测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.检测重组病毒的感染效率.ELISA法检测培养上清中血管内皮生长因子含量,人脐静脉内皮细胞管状血管形成试验检测血管内皮生长因子蛋白活性.结果:扩增产物经DNA测序确定为hVEGF165cDNA片段,重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP经双酶切鉴定正确.病毒包装效率达95%以上,收获纯化病毒滴度达5.5×1011 vg/mL.提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因片段,证实重组病毒rAAV-VEGF165-GFP包装成功.重组病毒rAAV-VEGF165-GFP感染骨髓基质干细胞效率为40%,感染72h后骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子含量达(85.58±5.37)μg/L,分泌的血管内皮生长因子蛋白可以使人脐静脉内皮细胞拉长变形、出芽且相互交联成管状样结构.结论:成功构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒rAAV-VEGF165-GFP,该重组病毒能够高效感染兔骨髓基质干细胞并表达血管内皮生长因子,分泌的血管内皮生长因子蛋白具有良好的生物活性,可有效促进人脐静脉内皮细胞的增殖.