ERK1/2信号传导通路介导碱性成纤维细胞生长因子诱导人晶状体上皮细胞中环氧合酶2的表达

背景:碱性成纤维细胞生长因子在各种白内障形成中都起着重要的作用,可促进晶状体上皮细胞的增殖并化生为纤维细胞,但其信号通路尚不清楚。目的:探讨ERK1/2信号转导通路在碱性成纤维细胞生长因子诱导的人晶状体上皮细胞环氧合酶2表达中的作用。方法:使用10μg/L的碱性成纤维细胞生长因子干预培养的人晶状体上皮细胞0,1,3,6,12,24h,RT-PCR检测刺激不同时间人晶状体上皮细胞环氧合酶2mRNA的表达,Western blot检测细胞中环氧合酶2及磷酸化ERK1/2的表达。在阻断实验中应用特异性ERK1/2的阻断剂PD98059阻断ERK信号转导通路1h,再用10μg/L碱性成纤维细胞生长因子刺激细胞6h,Western blot检测细胞中环氧合酶2的表达。结果与结论:碱性成纤维细胞生长因子刺激后的人晶状体上皮细胞中环氧合酶2mRNA及其蛋白的表达显著增加(P<0.01),同时碱性成纤维细胞生长因子诱导人晶状体上皮细胞磷酸化ERK1/2活性增强,表达水平随作用时间而增加,30min时达到最高峰(P<0.01),6h后恢复至基线水平;PD98059可抑制人晶状体上皮细胞环氧合酶2的表达(P<0.01)。说明ERK1/2信号转导通路参与了碱性成纤维细胞生长因子诱导的人晶状体上皮细胞中环氧合酶2的表达,在后发性白内障的形成过程中起着重要作用。     

纤维连接蛋白诱导人胚肺成纤维细胞增殖信号转导机制探讨

【目的】探讨纤维连接蛋白（FN）诱导人胚肺成纤维细胞（HFL1）增殖的细胞外信号调节激酶（ERK）信号转导通路。【方法】用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞增殖情况。采用不同浓度FN刺激HFL1并观察不同浓度下细胞ERK信号转导通路阻断剂PD98059对FN诱导HFL1增殖作用的影响;并用蛋白免疫印记法（Western Blot）观察FN浓度为50ng／mL时,PD98059对HFL1中磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）表达的影响。[结果]FN对HFL1诱导增殖作用呈剂量依赖性升高趋势,在50ng／mL时作用显著;ERK抑制剂PD98059可抑制FN诱导的HFL1细胞增殖。【结论】FN诱导HFL1的细胞增殖可以通过ERK信号转导途径实现。     

骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化中电磁场激活ERK通路的作用

背景：研究表明电磁场可调节骨髓间充质干细胞的增殖和分化,但其具体机制尚不清楚。目的：从ERK信号途径探讨电磁场诱导大鼠骨髓间充质干细胞增殖与分化成骨的作用。方法：取第3代生长良好的大鼠骨髓间充质干细胞,暴磁组给予15Hz、1mT的正弦波电磁场刺激,PD98059＋暴磁组在电磁场刺激前给予20μmol/L ERK阻断剂PD98059,PD98059组仅给PD98059不进行电磁场刺激,对照组正常培养。电磁场刺激后,收集各组细胞,Western blot法检测ERK通路的活性,MTT法检测细胞增殖活性,碱性磷酸酶试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性。结果与结论：电磁场刺激后,细胞ERK1/2磷酸化水平、细胞的增殖活性、及碱性磷酸酶活性均明显升高（P〈0.01）;PD98059可明显抑制ERK1/2磷酸化水平及细胞增殖活性的升高（P〈0.01）,而在一定程度上提高细胞的碱性磷酸酶活性（P〈0.01）。说明电磁场刺激可通过激活骨髓间充质干细胞ERK信号通路,并且主要通过该途径促进骨髓间充质干细胞的增殖;而在脉冲电磁场促进骨髓间充质干细胞分化成骨的过程中,激活ERK信号通路所起的作用较小。     

ERKl／2信号通路在高糖诱导的HK-2上皮间质转分化中的作用

目的：观察高糖诱导的细胞外信号调节激酶（ERK1/2）信号通路活化在上皮间质转分化中的作用,从而探讨延缓糖尿病肾病肾间质纤维化的发生机制。方法体外培养HK-2细胞,随机分为正常对照组、高糖组、ERK1/2通路抑制剂PD98059＋高糖组和高渗组,处理72 h后收集细胞,应用免疫细胞化学方法检测α-SMA、CK18的表达;应用Western blot法检测磷酸化ERK1/2、总ERK1/2表达水平的变化。结果（1）正常对照组胞质有大量CK18蛋白阳性表达,而α-SMA蛋白表达呈阴性;高糖组胞质中可见大量α-SMA蛋白强阳性染色,而CK18蛋白呈阴性表达;经PD98059处理后,CK18表达较高糖组染色深,而α-SMA表达较高糖组染色浅;高渗组胞质中CK18呈阳性表达,α-SMA表达呈阴性。（2）正常对照组可见少量总ERK1/2表达,p-ERK1/2蛋白仅有微量表达;经高糖刺激48 h后,总ERK1/2表达较正常对照组无明显差异,p-ERK1/2蛋白表达明显增加（P＜0.05）;而使用PD98059处理后,总ERK1/2的变化不大,但p-ERK1/2蛋白的表达却显著降低（P＜0.05）;高渗组与正常对照组无显著差异。结论 ERK1/2信号通路可能参与了高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞（HK-2）转分化过程,阻断 ERKl/2可部分抑制人近端肾小管上皮细胞的转分化,进而延缓肾小管间质纤维化的发生和发展。     

抑制ERK1途径对支气管上皮细胞谷氨酰半胱氨酸合成酶表达的影响

目的探讨抑制ERK1传导路径对支气管上皮细胞谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)合成的影响。方法用4-羟基壬烯醛(4-HNE)做刺激原,分为10μmol/L4-HNE、50μmol/LPD98059(MEK1抑制剂)孵育+10μmol/L4-HNE、正常对照组分别作用支气管上皮细胞0.5、2、4、8、12h后,检测细胞γ-GCSmRNA和蛋白的表达水平;10μmol/L4-HNE刺激细胞0.5、2、4、8、12h后,检测磷酸化JNK、P38MAPK、ERK1/2、活化蛋白-1(AP-1)活性;观察MEK1抑制剂PD98039对AP-1结合活性的影响。结果 10μmol/L4-HNE、50μmol/LPD98059孵育+10μmol/L4-HNE、正常对照组2、4、8、12h,细胞γ-GCS和γ-GCSmRNA表达三组差异有统计学意义,50μmol/LPD98059孵育+10μmol/L4-HNE较其他两组增加。10μmol/L4-HNE刺激0.5、2、4、8、12h组细胞磷酸化ERK1/2水平,AP-1结合活性较对照组增强。PD98059孵育后,4-HNE作用0.5、2、4、8、12h后,AP-1结合活性较未用PD98059孵育4-HNE刺激组降低。结论 MEK1抑制剂PD98059可以抑制支气管上皮细胞16-HBE细胞内ERK1-AP1信号传导通路,对4-HNE引起支气管上皮细胞γ-GCS合成有促进作用,阻断AP-1途径后支气管上皮细胞并不能减少γ-GCS的表达。     

骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化中电磁场激活ERK通路的作用

背景:研究表明电磁场可调节骨髓间充质干细胞的增殖和分化,但其具体机制尚不清楚.目的:从ERK信号途径探讨电磁场诱导大鼠骨髓间充质干细胞增殖与分化成骨的作用.方法:取第3代生长良好的大鼠骨髓间充质干细胞,暴磁组给予15 Hz、1 mT的正弦波电磁场刺激,PD98059+暴磁组在电磁场刺激前给予20 μmol/L ERK阻断剂PD98059,PD98059组仅给PD98059不进行电磁场刺激,对照组正常培养.电磁场刺激后,收集各组细胞,Western blot法检测ERK通路的活性,MTT法检测细胞增殖活性,碱性磷酸酶试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性.结果与结论:电磁场刺激后,细胞ERK1/2磷酸化水平、细胞的增殖活性、及碱性磷酸酶活性均明显升高(P < 0.01);PD98059可明显抑制ERK1/2磷酸化水平及细胞增殖活性的升高(P < 0.01),而在一定程度上提高细胞的碱性磷酸酶活性(P < 0.01).说明电磁场刺激可通过激活骨髓间充质干细胞ERK信号通路,并且主要通过该途径促进骨髓间充质干细胞的增殖;而在脉冲电磁场促进骨髓间充质干细胞分化成骨的过程中,激活ERK信号通路所起的作用较小.     

丁酸钠诱导人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1分化作用中细胞外信号调节激酶通路的改变

本研究探讨细胞外信号调节激酶（ERK）通路在丁酸钠（NaB）诱导人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1分化中的作用,阐明丁酸钠诱导SKM-1细胞分化的分子机制.用Western blot方法检测总ERK和磷酸化ERK的表达水平;将ERK特异性的抑制剂PD98059与丁酸钠联合应用,观察它们对SKM-1细胞生长曲线的影响及分化效应,并用Western blot方法检测P21和组蛋白脱乙酰酶（HDAC）蛋白质的表达水平.结果表明：SKM-1细胞经1mmol/L的丁酸钠作用后,总ERK的表达水平未发生变化,而磷酸化ERK的表达水平下降;丁酸钠及丁酸钠＋PD98059均可以上调P21和HDAC蛋白质的表达水平,且丁酸钠联合PD98059的作用强于丁酸钠单用.结论：ERK通路抑制是丁酸钠诱导SKM-1细胞分化的重要分子机制.     

三七总皂甙通过细胞外信号调节蛋白激酶1／2信号通路促进大鼠骨髓基质细胞向神经样细胞的增殖与分化

背景：三七总皂甙对骨髓基质细胞向神经样细胞分化的效应及相关信号通路目前尚不明确。目的：探讨细胞外信号调节蛋白激酶1,2信号通路对三七总皂甙调节大鼠骨髓基质细胞向神经细胞增殖、分化的作用。设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-05／10在汕头大学医学院分子生物学实验室完成。材料：4-6周龄雄性SD大鼠9只,由汕头大学医学院实验动物中心提供。三七总皂甙为,一两梧州制药集团股份有限公司产品,细胞外信号调节蛋白激酶的抑制剂PD98059为CellSignalingTech公司产品。方法：全骨髓法体外分离纯化大鼠骨麓基质细胞,取传至第3代细胞进行诱导分化,设立3组：单纯诱导组向培养液中加入10ug／L碱性成纤维细胞生长因子,预诱导24h后全量换为正式诱导液（含10P-g／L碱性成纤维细胞生长因子、2％DMSO、200μmol／L丁羟回醚的α-MEM培养基）,每24h半量换诱导液1次;三七总皂甙组向预诱导液和正式诱导液内加入终浓度100mg／L三七总皂甙;PD98059组在三七总皂甙组培养液基础上加入10μmol／LPD98059。主要观察指标：细胞形态学观察,MTT法检测细胞增殖情况,免疫组织化学方法鉴定细胞Nestin的表达。 结果：诱导6h后,少数细胞呈锥形,细胞突起增多伸长,类似神经元,继续诱导培养后细胞突起增多,突起相互连接成网状。与单纯诱导组、PD98059组比较,诱导6,12,24h三七总皂甙组细胞均明显增殖（P〈005）,且随诱导时间延长呈递增趋势（P〈0．05）：单纯诱导组、PD98059组间比较无明显差异（P〉0．05）。与单纯诱导组比较,诱导24h后三七总皂甙组Nestin阳性率明显升高（P〈0．05）,PD98059组Nestin阳性率明显降低（P〈0．05）。 结论：三七总皂甙可以促进骨髓基质细胞的神经分化和分化后增殖,细胞外信号调节蛋白激酶1／2的特异性抑制剂PD98059能够拈抗三七总皂甙促增殖分化作用,提示细胞外信号调节蛋白激酶1,2信号通路是三七总皂甙促进骨髓基质细胞向神经细胞分化和增殖的重要环节。     

脑源性神经营养因子通过AKT和ERK1/2信号通路诱导内皮细胞血管生成

本研究探讨脑源性神经营养因子（BDNF）促进血管新生的作用及其参与的信号通路,为抗肿瘤血管生成的研究提供新的实验依据。以人脐静脉内皮细胞为对象,采用Western blot方法检测细胞内磷酸化Akt、ERK1/2蛋白质的表达;采用Transwell小室迁移实验和管腔形成实验评价体外内皮细胞血管新生的能力,MTT法检测内皮细胞增殖活性,FITC-Annexin-Ⅴ/PI双染流式细胞术分析细胞调亡。结果表明：BDNF以时间依赖性的方式激活PI3K/Akt和MEK1/ERK信号通路。应用PI3K激酶抑制剂Ly294002、MEK1激酶抑制剂PD98059可以明显阻断BDNF对PI3K/Akt、MEK1/ERK信号通路的激活。100ng/ml的BDNF体外促内皮细胞血管新生能力与25ng/ml血管内皮生长因子（VEGF）相当,其中BDNF诱导的细胞迁移分别被Ly294002和PD98059阻断,其抑制率分别约为74%和36%;同样,Ly294002、PD98059可部分阻断BDNF诱导的小管形成效应,其阻断率分别约57%和37%;而BDNF的促增殖效应仅被PD98059拮抗,抑制凋亡效应仅受Ly294002影响。结论：BDNF在体外有促血管新生的作用。PI3K/Akt和MEK1/ERK信号通路以不同机制共同调节这一过程,其中PI3K/Akt信号通路起着更为重要的调节作用。     

丹参酮ⅡA对心脏成纤维细胞转化生长因子β1/Smads信号通路的作用

背景:转化生长因子β1通过Smads信号通路刺激心脏成纤维细胞增殖与分化是心肌纤维化最重要的发生机制之一.前期研究证实丹参酮Ⅱ A能有效抑制心肌纤维化,但是否通过阻断转化生长因子β1/Smads信号通路起作用尚不清楚.目的:观察丹参酮ⅡA对大鼠心脏成纤维细胞内转化生长因子β1信号转导的影响.方法:采用胰酶消化法和差速贴壁法获取新生SD大鼠心脏成纤维细胞,应用5 μg/L转化生长因子β1刺激及不同浓度丹参酮ⅡA(10-6,10-5和10-4mol/L).用反转录聚合酶链反应法和免疫蛋白印迹法分别检测转化生长因子β1刺激后6,12和24 h纤维连接蛋白的表达,免疫蛋白印迹法检测转化生长因子β1刺激后15,30,60和120 min的Smads蛋白表达.结果与结论:纤维连接蛋白mRNA和蛋白表达量在转化生长因子β1刺激6 h后开始呈现上升趋势,至作用24 h时分别增加1.3倍和1.8倍(P<0.01);磷酸化Smad2/3蛋白表达量在转化生长因子β1刺激15 min后开始上升,1 h达到高峰,2 h后虽有所下降,但仍较刺激前增加3.9倍(P<0.01).丹参酮ⅡA(10-5和10-4mol/L)预处理可下调纤维连接蛋白和磷酸化Smad2/3表达(P<0.05或P<0.01),而且效应呈剂量依赖性.由此可知,转化生长因子β1在一定范围内以时间依赖方式诱导纤维连接蛋白及其mRNA和磷酸化Smad2/3表达.丹参酮ⅡA抗心肌纤维化作用可能与其抑制转化生长因子β1诱导的Smad2/3磷酸化,阻断心脏成纤维细胞内转化生长因子β1/Smads信号通路有关.     

丝裂原活化蛋白激酶与核因子-κB在碳酰氯吸入性肺损伤中的作用

目的:探讨丝裂原活化蛋白激酶[mitogen activated protein kinases,MAPKs;包括细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)、蛋白激酶p38和c-氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)]与核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)在碳酰氯吸入性肺损伤中的作用及相互关系。方法:选取40只雄性Wistar大鼠,体质量220~280 g,随机分为空气对照组、碳酰氯吸入组、PD98059(ERK1/2特异性阻断剂)干预组、SB203580(p38特异性阻断剂)干预组和SP600125(JNK特异性阻断剂)干预组,每组8只。空气对照组吸入空气,碳酰氯吸入组与3个干预组均吸入相同浓度的碳酰氯(8.33 L/mg)。3个干预组均在吸入碳酰氯前给予PD98059、SB203580和SP600125。HE染色后光镜下观察肺组织病理学改变;分别采用免疫组织化学法及蛋白质印迹(Western blotting)法检测各组肺组织中NF-κB p65蛋白的表达。结果:与空气对照组比较,碳酰氯吸入组出现肺损伤的典型病理学特征,SP600125和SB203580干预组肺损伤有不同程度好转。免疫组织化学法及Western blotting法结果显示,与空气对照组比较,碳酰氯吸入组NF-κB p65蛋白表达明显增强(P0.01);与碳酰氯吸入组比较,SP600125干预组、SB203580干预组NF-κB p65蛋白表达明显下降(P0.05)。结论:碳酰氯吸入可激活MAPKs信号通路,可能通过上调NF-κB表达而发挥作用。     

碱性成纤维细胞生长因子对人涎腺腺样囊性癌ACC-2细胞株增殖及MEK/ERK、MKP-1通路的影响

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对人涎腺腺样囊性癌ACC-2细胞株增殖及MEK1/2、ERK1/2及MKP-1表达的影响。方法:培养人涎腺腺样囊性癌细胞株(ACC-2),MTT比色法测定不同浓度bFGF对细胞增殖的影响;免疫沉淀法纯化蛋白并ERK试剂盒测定ERK活性;免疫印迹法测定p-MEK1/2、p-ERK1/2及MKP-1表达。结果:MTT实验显示bFGF明显增强ACC-2细胞增殖,免疫沉淀法显示bFGF上调ERK活性,免疫印迹法显示bFGF明显增强p-MEK1/2、p-ERK1/2表达及抑制MKP-1表达。结论:bFGF可促进人涎腺腺样囊性癌ACC-2细胞株增殖,其途径与上调ERK活性、激活MEK/ERK通路、抑制MKP-1表达有关。     

趋化因子FKN对单个核细胞TNF-α和MMP-2表达的影响及ERK在其中的作用

目的探讨趋化因子Fmetalkine（FKN）对单个核细胞肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor,TNF-α）和基质金属蛋白酶-2（matrix metal proteinase-2, MMP-2）表达的影响及细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）在其中的作用。方法抗凝血用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞;将提取的单个核细胞分为：空白对照组、FKN组及PD98059（ERK阻断剂）组;分别应用ELISA和明胶酶谱法检测各组单个核细胞中TNF-α和MMP-2表达情况。结果FKN诱导组TNF-α表达较空白组明显增多（P〈0．05）,FKN诱导组MMP-2表达较空白组明显减少（P〈0．05）;PD98059组TNF-α和MMP-2表达均较FKN组明显减少（P〈0．05）。结论趋化因子FKN可以诱导单个核细胞TNF-α的表达而促进动脉粥样硬化的形成和进展,这一作用可能是通过ERK途径实现的;FKN可以抑制单个核细胞MMP-2的表达,而这一作用可能与ERK无关。     

脑室周围白质软化症的体外模型中磷酸化ERK蛋白的表达及应用PD98059后对其表达的影响

目的观察体外构建脑室周围白纸软化症（Periventricular leukomalacia,PVL）模型的发病过程中磷酸化细胞外信号调节激酶（phosphorylated extracellular signal regulated kinase,p-ERK）的表达变化及应用ERK通路抑制剂PD98059后对其表达的影响,以探讨ERK通路是否参与PVL的发病过程。方法共分为三种干预方法：给予CG4细胞糖氧剥夺（oxygen-glucose deprivation,OGD）6,12,24hr,以构建PVL体外模型,检测p-ERK蛋白表达变化;给予CG4细胞OGD6,12,24hr后诱导分化3davs,以构建PVL后分化发育的体外模型,检测p-ERK蛋白表达变化;PD98059干预后给予OGD12,24hr,检测p-ERK表达的变化。以上蛋白检测均采用蛋白免疫印迹方法。结果与对应时间点的正常对照组比较,OGD实验组p-ERK在OGD6,12,24hr后均出现明显的下降（P〈0．01）;OGD后诱导分化3days实验组,p-ERK在OGD6hr后诱导分化先出现暂时性的表达升高,随后在12和24hr时间点,p-ERK表达均出现明显的下降（P〈0．01）;应用PD98059后OGD12,24hr实验组,p-ERK反而出现明显的升高（P〈0．01）。结论在构建的PVL和随后的分化发育的体外疾病模型中,ERK信号转导通路参与其中。此外,PD98059作为ERK通路的抑制剂在OGD过程中反而起到激活的作用。     

Dexamethasone inhibits epidermal growth factor-stimulated gastric epithelial cell proliferation

Epidermal growth factor (EGF) is essential to heal gastric ulcers, whereas glucocorticoid delays rat gastric ulcer healing. We found that dexamethasone inhibited EGF-stimulated rat gastric epithelial cell (RGM-1) proliferation by cell count and DNA synthesis analysis of flow cytometry and attempted to elucidate the possible mechanistic pathway via Western blot analysis. EGF (10 ng/ml) treatment for 24 h significantly increased RGM-1 cell proliferation, and dexamethasone (10(-8) and 10(-6) M) markedly suppressed EGF-stimulated cell proliferation. Western blotting results demonstrated that the phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (pERK) (pERK1/pERK2) significantly increased at 10 min after EGF treatment. This was followed by increase of cyclooxygenase (COX)-2 expression at 3 h after EGF treatment. The continued increase of COX-2 (up to 18 h) resulted in increased intracellular prostaglandin E(2) and cyclin D1 expression significantly after 8 and 12 h of EGF treatment. Dexamethasone substantially reduced EGF-stimulated COX-2 expression at 3 and 6 h and cyclin D1 expression at 8 and 12 h. Pretreatment of RGM-1 cells with dexamethasone or 2'-amino-3'-methoxyflavone (PD98059)-mitogen-activated protein kinase kinase inhibitor (5 x 10(-5) M) significantly reduced EGF-stimulated pERK1/pERK2 expression. Simultaneous treatment of RGM-1 cells with PD98059 and EGF also markedly decreased EGF-stimulated COX-2 expression at 6 h. These findings indicate that dexamethasone significantly suppresses EGF-stimulated gastric epithelial cell proliferation, and one of the pathways involved is via inhibiting activation of ERK1/ERK2, followed by inhibition of COX-2, cyclin D1 expression, and finally DNA synthesis.     

良性前列腺增生MSCT多期增强特征与VEGF、bFGF表达和血管生成关系的探讨

目的：探讨良性前列腺增生（BPH）的MSCT多期扫描强化特征与VEGF、bFGF及微血管生成之间的关系。材料和方法：对经病理证实的35例BPH患者术前行MSCT平扫和增强扫描，用免疫组化检测增生组织的VEGF、bFGF的表达以及MVD和微血管相关指标表达情况，将MSCT强化特征与免疫组化结果进行分析。结果：MSCT多期动态增强扫描见BPH强化峰值71．43％（25／35）位于延迟期（180s），28．57％（10／35）位于静脉期（75s）；VEGF、bFGF的阳性表达率分别为31．43％（11／35）和14．29％（5／35）。MVD与VEGF、bFGF有相关性（P〈0．01）；MAV与MVD、VEGF、bFGF亦有相关性（P〈0．01），与微血管的平均直径、平均周长、平均面积呈负相关（P〈0．01），与微血管的异型指数无相关性（P〉0．01）；VEGF与bFGF的表达之间具有相关性（P〈0．01）；结论：bFGF、VEGF及MVD在BPH呈现不同程度的表达，MSCT强化特征与增生组织中bFGF、VEGF的表达及微血管的生成关系密切。