生物人工肝支持系统生物反应器的建立及体外转流试验

目的 探讨由微载体培养的L－02人肝细胞和中空纤维舱构成的生物反应器的生物效能。方法 采用微载体培养高浓度L－02人肝细胞，同时使用中空纤维型生物反应器和血泵等共同构成生物人工肝系统。在体外转流试验中观察循环液中游离胆红素、葡萄糖、白蛋白、谷草转氨酶浓度的变化以及实验对肝细胞的影响等。结果 L－02肝细胞能很好地粘附于cytodex 3微载体上形成微载体诱导的肝细胞聚集体；移入生物反应器内进行体外循环，4h后可见循环液中游离胆红素和葡萄糖浓度显著降低，分别为27.1μmmol/L和1.75mmol/L；白蛋白含量明显增加，为15．21mg/L；肝细胞仍有较高活力达75％。结论 本实验所建立的生物反应器作为生物人工肝系统的核心组件具备一定的生物合成和解毒代谢功能，为进一步建立混合型生物人工肝支持系统奠定了基础。     

大鼠肝细胞的微载体黏附培养及其功能测定

目的 探讨一种简单获取大量高活性肝细胞的培养方法。方法 用半原位酶消化技术对ＳＤ大鼠肝细胞进行分离与微载体黏附培养,连续观察肝细胞的形态。检测肝细胞的白蛋白分泌功能和葡萄糖合成功能,并同时与贴壁培养的肝细胞比较。结果 黏附培养的肝细胞存活率,白蛋白分泌功能,葡萄糖合成功能都保持较高水平,优于贴壁培养的肝细胞。结论 微载体培养提供长时间保持高活性,高密度生长的肝细胞,为肝细胞移植,肝病防治以及生物人     

微囊包载体肝细胞培养方式对肝细胞功能及活性的影响

目的：探讨采用海藻酸钠/壳聚糖/海藻酸钠（ACA）微囊包裹微载体的肝细胞培养方式对肝细胞功能及活性的影响。方法：设立微囊包载体组和普通单层细胞培养组;以微载体Cytodex3进行肝细胞（HL-7702）培养;选择合适时机进行ACA微囊化包裹。收集两组第1～6天的培养液,测定其中白蛋白及乳酸脱氢酶（LDH）含量;并用Calcein-AM/PI双染细胞,在荧光显微镜下观察细胞的荧光强度变化,了解细胞活性的改变。结果：观察培养6d,微囊包载体组培养液中的白蛋白含量至第4天达到峰值,之后缓慢下降;而普通单层培养组培养液中白蛋白含量至第2天达到峰值,之后迅速下降。微囊包载体组培养液的LDH含量明显低于单层培养组（P〈0.01）。微囊包载体组中活细胞的绿色荧光强度逐渐减弱,至培养第6天,显示黄绿色荧光;而单层培养组中每天有大量失活细胞悬浮于培养液中,至培养第6天,贴壁细胞数量仅占培养前的27%。结论：微囊包载体肝细胞培养方式中前期,微载体细胞培养可在较短的时间及较小的空间内实现细胞扩增;外周的微囊机构对肝细胞营养物质的供给及合成产物的排出无影响,但可阻挡大分子免疫球蛋白;两者结合有利于维持肝细胞的白蛋白分泌功能及细胞活性,是一种兼具高密度培养及免疫屏障功能的细胞培养方式,在生物人工肝中有一定的可行性。     

微载体培养L02人肝细胞应用于生物人工肝的初步研究

Ｌ0 2人肝细胞株组织学来源为人正常肝组织 ,具备一定正常肝细胞的生物功能。我们将高密度微载体培养的Ｌ0 2人肝细胞聚集体加入中空纤维生物反应器 ,构建简易体外生物人工肝装置并进行初步的应用研究。一、材料与方法1.材料 :Ｌ0 2人肝细胞株购于中国科学院上海细胞生物学研究所 ;Ｃｙｔｏｄｅｘ3微载体为Ｐｈａｒｍａｓｉａ公司产品 ;聚羟乙基异丁烯酸 (Ｐｏｌｙ ＨＥＭＡ )及ＤＭＥＭ、ＨａｍｓＦ12培养基均为Ｓｉｇｍａ公司产品。2 .Ｌ0 2人肝细胞的微载体培养 :( 1)取 1.4ｇＣｙｔｏｄｅｘ 3,水化处理[1] ;( 2 ) 12 %Ｐｏｌｙ ＨＥＭＡ…     

人肝细胞L-02/聚丙烯杂化界面的初步研究:肝细胞球形聚集体培养

生物人工肝（bioartificial liver，BAL）在肝功能衰竭中的治疗价值已得到肯定，大量高活性的人肝细胞是细胞型体外BAL支持系统的核心原材料。球形聚集体是一种立体、高密度、高活性培养肝细胞的方法，但操作较复杂。我们采用生物材料表面接枝功能化学基团的方法，对人肝细胞L-02／聚丙烯杂化界面进行了研究，并通过简单的静止培养实现了肝细胞的球形聚集体培养方式，极大的简化了既往的肝细胞球形聚集体培养方法。     

红细胞携氧促进多层平板型生物反应器中肝细胞氧供

目的 生物人工肝作为肝功能衰竭的一种有效支持手段,近年来得到不断的改进,如何解决反应器中的氧供问题成为目前人们研究的焦点.本研究拟通过在循环培养液中加入红细胞为这一问题提供可能的解决方案.方法 将新鲜分离的原代猪肝细胞接种于笔者自主构建的新型生物反应器内.实验分为两组,对照组在反应器内仅加入RPMI1640培养液直接循环;实验组在培养液中同时加入猪红细胞(2.5×1011/L)进行循环,两组循环液均经过膜肺进行氧合.采用血气分析仪检测反应器中氧耗情况,同时检测反应器中葡萄糖消耗及肝细胞的功能表达.结果 实验组反应器中肝细胞氧耗率为对照组的1.5倍,葡萄糖消耗为对照组的2倍.同时,实验组肝细胞的白蛋白分泌及尿素合成各项功能均明显高于对照组.结论 在培养液中加入红细胞能显著改善反应器中肝细胞的氧供,从而提高反应器中细胞的葡萄糖代谢及各种肝特异功能的表达.该方法简便易行,效果明显,有望成为解决反应器中氧供的有效手段.     

人肝细胞系L-02与聚丙烯生物杂化界面构建的初步研究

目的　建立与人肝细胞相容的聚丙烯生物杂化界面 ,为用聚丙烯中空纤维管构建生物人工肝反应器奠定基础。方法　通过化学接枝的方法在聚丙烯表面引入聚丙烯酰胺形成聚合反应 ,并对人肝细胞系L 0 2在其表面的生长特点进行检测评价。结果　聚丙烯膜的静态水相接触角由接枝前的 (72± 5 )°降低为接枝改性后的 (30± 4 )°,明显提高了接枝改性聚丙烯膜的亲水性 ,并通过简单的静止培养使人肝细胞系L 0 2在其表面呈球形聚集体生长 ,提高了培养密度和活性。结论　在聚丙烯表面接枝聚丙烯酰胺可初步建立良好的人肝细胞系L 0 2与聚丙烯生物杂化界面 ,此肝细胞球形聚集体培养方法较为简单     

壳聚糖微载体的制备及原代大鼠肝细胞培养

目的 探讨制备壳聚糖微载体在原代大鼠肝细胞培养中的应用效果。方法 利用甲苯—四氯化碳作有机分散介质，戊二醛作交联剂，通过反相悬浮交联制备微米级的壳聚糖微载体。用其进行原代大鼠肝细胞培养，利用相差显横镜和扫描电镜对细胞形态进行观察，测定细胞的代谢活性。结果 通过对壳聚糖浓度和戊二醛用量等反应条件的优化，制成了性能优良的微载体。肝细胞在壳聚糖微载体上保持良好的球形状态，白蛋白分泌可维持7天以上，最高分泌量达到26．7μg／24h／m1。结论 壳聚糖微载体是一种优良的肝细胞培养支架。     

基于纳米支架材料的新型多层平板型生物反应器的构建

4～60 μmol/h.培养过程中,仅有少量的酶(AST、LDH)漏出.结论 初步构建的新型多层平板型生物反应器,符合生物人工肝基本的要求.其内培养的细胞能保持良好的活性,并具有相应的功能.     

骨髓间充质干细胞维持猪肝细胞形态与功能的实验研究

目的 建立猪肝细胞与骨髓间充质干细胞(MSCs)体外共培养体系,为生物人工肝的构建提供理想细胞来源.方法 自中华实验猪(n=3)髂前七棘抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁传代培养至第3代;原位两步胶原酶法分离猪肝细胞后与MSCs随机混合培养,观察共培养肝细胞形态和功能的变化水平.结果 第3代MSCs纯度>90%,肝细胞活率>95%,纯度>99%.共培养组肝细胞迅速黏附于MSCs表面,在三维空间呈球形聚集生长.异质细胞间出现细胞连接,超微结构与正常肝细胞接近.共培养组肝细胞白蛋白分泌水平和尿素合成能力自第1天培养起均显著高于对照组(P<0.05),并在第2天达到高峰.结论 猪肝细胞与MSCs共培养可维持肝细胞形态与功能,使构建功能性生物人工肝成为可能.     

乳猪肝细胞的聚集培养术

目的　建立乳猪肝细胞与非实质细胞大量聚集培养技术。探讨获取大量高活性乳猪肝细胞的培养方法。方法　采用磁力悬浮培养技术和装置进行聚集培养。观察聚集体的形态 ,受损伤程度和白蛋白分泌功能 ,氨转化功能。结果　一次培养肝细胞数可达 2× 10 10 ～ 5× 10 10 个 ,聚集体肝细胞结构完整 ,相互之间形成胆管样结构等肝组织特异结构 ,保持良好生物活性。结论　聚集培养技术将细胞接种浓度提高 5倍 ,一次可制备足够数量的肝细胞 ,较好地满足构建杂合型人工肝时对生物材料的要求     

羊软骨细胞在生物反应器中的培养和扩增

[目的]探索在旋转生物反应器内，应用微载体技术快速扩增分化良好的羊软骨细胞的方法。[方法]将培养的羊软骨细胞应用Cytodex-3微载体在旋转生物反应器（RCSS）内，进行动态培养，应用倒置显微镜对微载体表面的软骨细胞进行动态观察，并对收获的软骨细胞进行Ⅰ、Ⅱ型胶原的细胞免疫化学染色分析。[结果]关节软骨细胞于1d内贴附于Cytodex-3微载体表面，细胞初期为圆球形、半球形凸起，逐渐向周围伸展，随时间的延长，贴附于微载体的细胞逐渐增多，到培养后期，细胞密度可达最初接种的15～17倍，在微载体上收获的软骨细胞经Ⅰ型胶原的免疫细胞化学染色呈阴性，Ⅱ型胶原染色则呈强阳性。[结论]利用微载体细胞培养技术可简便快速地在体外扩增羊软骨细胞，可为构建组织工程化人工软骨提供大量活性、分化良好的软骨细胞。     

微载体培养人肝细胞系作为人工肝生物材料的研究

目的 为提高人肝细胞系的培养效率和细胞获取数量。方法 本研究采用微载体细胞培养技术进行了人肝细胞系CL-1的高密度培养，动态观察细胞生长，检测肝细胞特异性功能变化。结果 CL-1在微载体Cytodex-3上生长良好，于培养的第7天达到高峰，细胞数量为2.13×10^8／100ml，白蛋白合成量71．23μg／100ml．尿素合成量23．32mg／100ml，安定转化量619．7μg／100ml，与CL-1普通培养结果比较，细胞产量是普通培养的49．3倍．而白蛋白合成量、尿素合成量及安定转化量则分别是普通培养的39．8倍、41．6倍和33．3倍。结论 微载体培养CL-1可提高培养效率和细胞数量．且具有较好的功能，微载体高密度培养CL-1可作为组合型人工肝的生物材料。     

亚低温离体大鼠肝细胞悬浮培养后的功能

目的 观察亚低温条件下离体大鼠肝细胞悬浮培养后的完整性和功能。方法 离体肝细胞悬浮于添加有葡萄糖和牛血清白蛋白（BSA）的碳酸氢盐缓冲介质内30℃下孵育48h，期间及其后测定细胞的完整性和功能指标。结果 30℃条件下离体0、24及48h内白蛋白合成及Ⅰ相药物生物转化能力差异无统计学意义（P〉0．05），流式细胞仪活细胞计数和台盼蓝清除率显示细胞完整性差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 肝细胞混悬液内的离体肝细胞在亚低温条件下能够保持较高活力，为制备应用于生物人工肝的离体肝细胞混悬液提供了可行性。     

人脂肪干细胞结合微载体在生物反应器中向软骨细胞分化

[目的]探索在旋转生物反应器内,应用微载体技术快速扩增并向软骨分化人脂肪干细胞。[方法]将人脂肪干细胞结合Cytodex3微载体在旋转的生物反应器(RCSS)内进行动态培养,应用倒置显微镜和扫描电镜对微载体表面的脂肪干细胞进行动态观察,并对收获的脂肪干细胞进行Safran in-O、tolu id ine b lue染色等组织化学染色及Ⅱ型胶原的免疫化学染色分析。[结果]脂肪干细胞于24 h内贴附于Cytodex3微载体表面,细胞形态为短梭形,随时间的延长,贴附于微载体的细胞逐渐增多,到培养后期,细胞密度可达最初接种的19倍左右,在微载体上收获的细胞进行番红花O、阿利新蓝染色呈阳性,Ⅱ型胶原染色阳性,均强于对照组。[结论]利用微载体细胞培养技术可简便快速地在体外扩增脂肪干细胞,并成功实现向软骨细胞分化。     

肝细胞对肝窦内皮细胞生长的支持作用

目的 探讨肝细胞在大鼠肝窦内皮细胞(hepatic sinus endothelial cell,HSEC)生长过程中的作用,并建立一种新的HSEC原代培养方法.方法 Ⅳ型胶原酶分离肝细胞,运用Pereoll建立的梯度密度离心以及选择性贴壁纯化HSEC,舍肝细胞条件培养液(HC-CM)的RPMI-1640培养液培养HSEC.结果 平均每只大鼠可获取2.55×107个HSEC,平均活力98%,培养24 h后纯度约91%.HC-CM有效刺激HSEC生长,促进细胞内DNA合成.HSEC体外生长保持良好的形态,维持5～6 d,扫描电镜下可见典型的"窗孔"样结构.结论 本实验方法能提供高活力的HSEC,肝细胞条件培养液内舍有多种营养因子支持HSEC生长.     

Cytodex-3微载体高密度培养人肝细胞系CL-5

目的采用微载体进行高分化的人肝细胞系CL－5的高密度培养以作为生物人工肝的生物材料。方法进行CL－5的微载体均匀搅拌培养,于培养的1、3、5、7、9天进行细胞计数及培养上清人白蛋白浓度检测,并在显微镜下动态观察细胞生长情况。结果细胞密度于培养的第七天达最高峰为1.98×10~9／L,同时人白蛋白的分泌亦最高,为54.79μg。结论实验表明使用Cytodex-3微载体培养CL-5肝细胞系,可达到较高的密度,并且具有一定的分泌功能。     

Cytodex-3微载体培养人肝细胞系CL-1

采用微载体培养技术进行高分化人肝细胞系CL-1的高密度培养。使用的微载体浓度为5mg/ml,细胞接种浓度为2×10~5/ml,在100ml的Bellco搅拌培养瓶中以30γpm的转速进行持续搅拌培养,动态观察肝细胞的生长情况及白蛋白分泌功能变化,结果表明:CL-1细胞培养第三天后生长加快,于第七天达到高峰(2.13x10~6/ml),第九天时细胞密度有所下降(1.92×10~6/ml)。倒置显微镜下见培养第一天有50％的微载体附着肝细胞,第五天时80％以上的微载体长满肝细胞,第七天时微载体肝细胞间有“桥联”生长现象,电镜观察培养七天的肝细胞呈半球状紧密贴附于微载体上,细胞表面     

生物人工肝的研究进展

肝移植是治疗急慢性肝功能衰竭最有效的方法,但是,由于供肝缺乏,必需寻求终未性肝病替代疗法.其中主要方法之一是体外生物人工肝支持系统,简称生物人工肝(bioartificial liver, BAL),发展至今已有40多年.临床试验证明BAL能促进肝功能衰竭病人的恢复,或过渡到肝移植.生物反应器是BAL的核心部件,生物反应器设计的主要目的在于保持肝细胞活力和功能,且不妨碍肝细胞营养及代谢产物的交换,同时还能起到治疗作用.细胞材料是BAL治疗基础,维持细胞活率和功能对BAL功效有决定性作用.本文就生物人工肝装置在实验和临床试验中的研究进展作一综述.……     

膜截流分子量对新型生物人工肝支持系统内细胞材料影响的实验研究

目的 探索膜截流分子量对新型生物人工肝(bioartificial liver,BAL)支持系统内细胞材料功能的影响.方法 选用200×103和1200×103两种不同膜截流分子量的半透膜作为BAL隔离膜.正常比格犬接受新型BAL治疗6h,定时收集BAL系统中培养液.观察各组细胞活力及功能变化.结果 200×103组细胞活力保持在90％左右,明显高于1200×103组的22％.细胞功能检测显示,200×103组细胞白蛋白分泌水平及尿素合成分别为53.3 μg/106细胞和3.6 μg/106细胞,显著高于1200×103组的5.6 μg/106细胞和0.3 μg/106细胞.1200×103组反应器内免疫球蛋白分子浓度显著高于200×103组,免疫荧光试验进一步证实了上述结果.结论 降低BAL膜截流分子量可以有效减少免疫球蛋白分子的透过,从而维持BAL中细胞材料的功能.