去唾液酸糖蛋白受体与慢性肝病自身免疫

去唾液酸糖蛋白受体 (AsialoglycoproteinReceptor,ASGPR)是肝细胞的一种重要且高效的内吞受体 ,主要分布于肝小叶门静脉周围肝细胞的窦面膜上 ,又名肝凝集素 (liverlectin)。近年来研究发现该受体除了在肝脏基因定向转移、靶向药物治疗当中具有较高的应用价值之外 ,还相继在自身免疫性肝炎(AIH)、原发性胆汁性肝硬化 (PBC)、病毒性肝炎等慢性肝病患者血清中检测到其相应的自身抗体 ,从这些患者外周血、肝活检组织分离到ASGPR特异性的T淋巴细胞。由于ASGPR的肝脏特异性与其在肝脏的特殊分布位置和某些慢性肝病的组织病理学特征极…     

去唾液酸糖蛋白受体特异性单链抗体的优化表达及亲和常数的测定

目的:表达及纯化抗去唾液酸糖蛋白受体(ASG-PR)的单链抗体的可溶性,并测定其亲和常数。方法:用噬菌体C1克隆感染E.coliHB2151,挑取单个菌落接种于2×TY培养基中,于37℃震荡培养过夜。将培养物作1∶100稀释并转种后,用终浓度为0.25、0.5、1.0mmol/L的IPTG,分别在37℃、25℃和20℃下诱导表达过夜。取其培养上清,用饱和硫酸铵沉淀后,以120g/LSDS-PAGE分析。另外,将饱和硫酸铵沉淀物用30mLPBS重新溶解、透析除盐后,用Ni2 螯合柱进行纯化,再以120g/LSDS-PAGE鉴定纯化scFvC1的纯度。用非竞争酶免疫法测定scFv的亲和常数。结果:用0.5mmol/LIPTG在25℃诱导过夜,表达的scFvC1的量较多,其相对分子质量(Mr)约为28000,以可溶性的形式存在于培养基中。通过Ni2 亲和柱纯化后scFvC1的纯度在95%以上,产量约为0.8mg/L。scFv的亲和常数为(2.31±0.36)×10-7mol/L。结论:以筛选的C1噬菌体感染E.coliHB2151后可表达低亲和力的可溶性scFv,对肝癌的基因治疗具有潜在的应用价值。     

中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体H1和H2亚基糖基识别域的原核表达及复性

目的对中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)H1和H2亚基糖基识别域(CRD)的克隆、表达、纯化及复性。方法用RTPCR从中国旱獭肝组织中扩增ASGPRCRDH1和CRDH2cDNA,分别将其克隆到原核表达载体pRSETB上,在埃希菌BL21(DE3)pLysS内诱导表达含6个组氨酸标签的融合蛋白。融合蛋白经Ni2 螯合柱亲和纯化后,在体外行透析复性。结果ASGPRCRDH1和CRDH2经原核表达后得到分子量约为22ku和15ku的目的蛋白,以包涵体形式存在。经Ni2 螯合柱亲和纯化后获得纯度大于95%的融合蛋白。利用仅识别天然构像的单克隆抗体对复性后产物进行检测,证明复性成功。结论成功地表达了具有活性的ASGPRCRDH1和CRDH2的融合蛋白,在肝脏疾病的靶向治疗研究中具有潜在的应用价值。     

肝脏去唾液酸糖蛋白受体特异性RNA适配子的SELEX筛选与鉴定

目的 获得能够特异性高亲和力结合肝脏特异性去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor, ASGPR)的RNA适配子,为开发诊断和治疗肝脏疾病的靶向性试剂和药物奠定基础.方法 合成一个长度为115 nt含有25个随机序列的单链DNA随机文库,通过体外转录构建出单链RNA适配子随机文库,以肝脏ASGPR大亚基为靶蛋白,采用SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)技术筛选具有高亲和力的ASGPR特异性RNA适配子;通过膜结合测定实验、凝胶阻滞实验鉴定筛选适配子对靶蛋白的特异性和亲和力.结果 经过12轮筛选获得了具有高亲和力的肝脏ASGPR特异性RNA适配子.结论 成功地筛选出了具有高亲和力的肝脏ASGPR特异性RNA适配子库.     

肝去唾液酸糖蛋白受体显像:三维分段肝功能评估的前景

去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)是哺乳动物肝细胞表面的特异性受体,肝硬化和肝癌时ASGPR水平下降。利用99mTcGSA进行该受体的显像,能够得到HH15、LHL15、[R]0、R0等指标用于肝功能的评估;将这种功能性显像与单光子发射型计算机断层显像(SPECT)技术相结合,可以模拟肝脏切除的范围,并预测术后剩余肝脏的功能。此技术在国际上是一个新的课题,在国内尚无开展,用它来数字化的评估手术风险对患者手术方式的选择及预后具有重要影响。笔者结合正在进行的这方面部分研究,向读者作一介绍,以期在临床上发挥更好的作用。     

中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体糖基结合域的原核表达与多克隆抗体的制备

目的：构建中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）H1和H2亚基糖基识别域（CRD）的原核表达质粒，体外表达纯化后制备多克隆抗体。方法：RT-PCR扩增出中国旱獭肝组织中ASGPR CRDH1和CRDH2 cDNA，将其克隆至原核表达载体pRSET-B中，在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS内诱导表达。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，并采用酶联免疫吸附试验、Western blot及免疫组织化学检测抗体的灵敏度和特异性。结果：成功构建了中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体H1和H2亚基糖基识别域原核表达质粒pRSET-B.CRDH1和pRSET-B.CRDH2，目的蛋白可以高效表达，用其免疫BALB/c小鼠获得了高效价的特异性多克隆抗体。结论：首次成功表达了中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体H1和H2亚基糖基识别域多肽，且纯度高，免疫原性强，用其免疫小鼠获得的多克隆抗体特异性好、效价高，为在HBV感染模型-中国旱獭体内进行肝脏疾病的靶向治疗奠定了实验基础。     

去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位的表达、纯化及其单链抗体的筛选与鉴定

目的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)H1亚单位的重组、表达、纯化及其单链抗体的筛选与鉴定。方法将ASGPRH1亚单位糖识别区基因(CRDH1)定向克隆至原核表达载体pET-32c经IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫印迹技术(WB)检测;用纯化的CRDH1对人源噬菌体抗体库进行4轮固相筛选,阳性克隆用表达标记(Trx-His-stag)进行差异筛选。取阳性噬菌体C3感染宿主菌HB2151,37℃振荡培养过夜,终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE与Westernblot鉴定以及免疫组化鉴定纯化的单链抗体C3与肝细胞结合的特性。结果CRDH1/pET-32c在原核系统经诱导表达出相对分子质量(Mr)约35×103大小的融合蛋白,以包涵体的形式存在;通过Ni2+亲和柱纯化获得CRDH1融合蛋白;经4轮筛选和差异筛选后,有2株可分泌性表达与CRDH1特异性结合的单链抗体,DNA序列分析表明单链抗体重链基因和轻链基因分别属于人免疫球蛋白VH3家族和VKI家族。噬菌体C3经诱导表达出Mr约28×103大小的融合蛋白,可溶性分泌表达于培养基中;通过Ni2+亲和柱纯化获得单链抗体,ELISA、Westernblot表明单链抗体C3能较好结合rCRDH1,免疫组化显示该单链抗体可与肝癌细胞、肝细胞特异结合。结论成功表达ASGPR并筛选出其人源单链抗体。该单链抗体可与表达的rCRDH1以及肝细胞和肝癌细胞特异性结合,提示对肝脏疾病的靶向治疗有潜在的应用价值。     

去唾液酸糖蛋白受体的研究现状

去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR),也被称为肝细胞半乳糖/N-乙酰基葡糖胺受体,或者Ashwell-Morell受体[1]。它主要表达于肝窦状间隙的肝实质细胞表面,是第一个被发现的凝集素。由于它结合配体的钙离子依赖性,因此属于C型凝集素。ASGPR能够介导去唾液酸化的糖蛋白被肝细胞内吞降解[2]。目前已知的ASGPR的配体非常多,提示其在糖蛋白代谢、脂代谢、凋亡细胞降解、调节凝血、介导病毒进入细胞和自身免疫性炎症反应等多个生理环节均发挥着重要的作用[3]。     

脱唾液酸糖蛋白受体介导的vp3基因靶向性治疗肝癌的实验研究

目的利用肝细胞表面存在特异的脱唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR),探索ASGPR介导的vp3基因肝细胞靶向性治疗肝癌的方法。方法将携带vp3基因的质粒通过多聚左旋赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)与该受体的天然配体脱唾液酸粘蛋白(asialoorosomucoid,Asor)结合,获得Asor-PLL-vp3复合物;通过体外转染、放射性同位素标记检测和动物实验鉴定该复合物的肝细胞靶向性。结果 成功制备了较纯的可溶性的蛋白-核酸复合物;体内外实验结果表明Asor-PLL-vp3复合物具有良好的肝细胞靶向性。结论通过制备Asor-PLL-vp3复合物,利用ASGPR介导实现了vp3的肝细胞靶向性基因转移,证实了该复合物具有体内靶向性治疗肝癌的可行性。     

小鼠Ccr2基因真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的:构建小鼠Ccr2基因真核表达载体,转染RAW264.7,建立稳定转染Ccr2的RAW264.7细胞系。方法:应用RT-PCR从小鼠脾脏组织中扩增Ccr2mRNA全序列,插入真核表达载体pEGFP-N1中。用脂质体将重组质粒pEGFP-N1/Ccr2转染RAW264.7细胞,通过G418筛选建立Ccr2稳定转染的RAW264.7细胞系。经RT-PCR、Western blot检测、荧光显微镜和流式细胞仪FCM检测,了解Ccr2在RAW264.7细胞中的表达水平及细胞内定位。结果:成功构建了pEGFP-N1/Ccr2重组质粒,建立了稳定转染的RAW264.7细胞株。RT-PCR和Western blot检测证实,Ccr2基因在该细胞系中成功表达,荧光显微镜下观察到该基因定位于细胞膜上,FCM显示90%以上的细胞膜上均有CCR2的表达。结论:构建了Ccr2真核表达载体并建立了稳定转染的RAW264.7细胞株。为进一步研究MCP1/CCR2信号通路在结核杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用奠定了基础。     

NNMT真核表达载体的构建并转染SMMC7721肝癌细胞株

目的构建peDNA3．1（-）／NNMT（尼克酰胺-N-甲基化酶）真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法采用PCR法从PGEX4T-1／NNMT重组质粒中克隆得到NNMT cDNA全长序列,并将扩增的eDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（-）中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RT—PCR检测转染前后该细胞株NNMT基因的mRNA表达水平。结果真核表达载体构建成功．经RT-PCR检测,重组质粒转染株的NNMT基因mRNA表达水平高于对照组,证实NNMT基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论成功建立了人基因NNMT的稳定转染细胞株,为进一步研究NNMT的功能奠定了基础。     

grp78真核表达载体构建及其稳定转染HeLa细胞系建立

目的 构建人grp78基因真核表达载体,并建立稳定高表达grp78的人宫颈癌HeLa细胞系.方法 用RT-PCR方法从人宫颈癌HeLa细胞中扩增grp78基因编码区,将PCR产物克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)/grp78并测序鉴定.用构建成功的pcDNA3.1(+)/grp...     

稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系的建立及鉴定

目的 构建人c-jun氨基末端激酶3(c-jun N-terminal kinase3,JNK3)真核表达载体,并在人神经母细胞瘤细胞(SHSY5Y)中稳定表达以探讨JNK3对细胞凋亡的影响.方法 以pDBleu-JNK3为模板,PCR扩增人JNK3基因全长,目的 片段亚克隆至真核表达载体pEGFP-C3,酶切及测序鉴定.LipofectamineTM 2000转染SHSY5Y细胞,并通过G418选择性培养建立稳定表达JNK3的SHSY5Y细胞系.荧光显微镜下观察细胞中JNK3表达,RT-PCR、Western印迹检测JNK3表达.结果 成功构建了pEGFP-C3-JNK3真核表达载体,并建立了稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系,与对照组相比,其人JNK3基因表达明显升高.结论 稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系的建立,为进一步研究人JNK3的功能及其与细胞凋亡的关系提供了重要的细胞模型和实验基础.     

一株人胰腺癌细胞系的建立及其特性

人胰腺癌是很难建系的癌细胞之一,特别是从原发瘤建立的细胞系。我们成功地从一个胰腺癌组织建立了一株人胰腺癌细胞系,命名为PC-3。PC-3细胞呈上皮样,贴壁生长,经过四年连续培养,细胞系稳定。通过免疫组化、电镜观察、染色体及DNA含量分析,细胞集落形成及裸鼠移植,生长因子对瘤细胞生长的影响和癌基因的表达证实PC-3细胞系为人胰腺癌细胞系。PC-3细胞系的建立进一步丰富了人胰腺癌细胞库,对深入了解人胰腺癌细胞生物学及分子生物学特性提供了有力的物质基础。     

构建稳定表达RFP及嘌呤霉素抗性的K562细胞株

目的 构建稳定表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)和嘌呤霉素(puromycin)抗性的K562-PM-RFP细胞株,便于慢性粒细胞性白血病研究中K562细胞的观察和筛选.方法 采用PCR法获得RFP片段,将其插入到慢病毒pGC-FU-3FLAG-IRES-Puromycin 载体...     

GFP／HBVX融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

脂多糖对人正常肝细胞株L02损伤的实验研究

目的探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对人正常肝细胞株L02的损伤作用及其机制。方法采用流式细胞术分别检测LPS诱导L02细胞凋亡和线粒体膜电位变化的作用,测定L02细胞膜上CD14、Toll样受体4(TLR4)、Toll样受体2(TLR2)的表达水平;采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量;生化法测定细胞培养上清液中丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨酸转氨酶(AST)及乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果10、20、40、80mg/L剂量的LPS作用于L02细胞后0、6、12、24和36h,细胞的凋亡率和线粒体膜电位无显著性差异(P>0.05),各组上清液中ALT、AST、LDH和TNF-α含量亦无明显变化(P>0.05),L02细胞膜上LPS受体CD14、TLR4、TLR2表达分别为(2.28±0.60)%,(1.04±0.80)%,(2.07±0.50)%。结论L02细胞膜上LPS受体CD14、TLR4、TLR2表达水平低,致使LPS不能直接引起L02细胞损伤。     

人类P100蛋白表达抑制稳定株的建立及其对HeLa细胞周期的影响

目的构建针对人类P100(hP100)基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)质粒,转染后筛选P100表达抑制的稳定细胞株并鉴定其表达情况;同时检测其对细胞周期的影响。方法设计针对hP100基因的siRNA序列,构建pGenesil-shRNA-hP100质粒(smallhairpinRNA,shRNA,小发夹RNA),经测序鉴定后转染入宫颈癌细胞HeLa;经G418筛选出稳定株;Western印迹检测稳定株之抑制率。流式细胞术检测hP100蛋白表达抑制对细胞周期的影响。结果成功构建了针对hP100的siRNA质粒,并用之筛选出hP100蛋白表达抑制的稳定株,瞬时转染及稳定株hP100表达明显降低。流式细胞术显示抑制hP100蛋白表达使G1期细胞比例增加,S期和G2/M期细胞比例降低。结论RNAi(RNA interference,RNA干扰)可持续稳定地抑制人类P100蛋白的表达,人类P100蛋白表达抑制对细胞周期有调节作用。     

稳定表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原CTLA-4的293T细胞株的建立

目的：构建稳定表达细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4, CTLA-4）的293T 细胞株。方法首先从人外周血获取 PBMC 加以 T 细胞活化; PCR 扩增 CTLA-4转录本,连接pUCm-T 质粒引入 HindⅢ和 EcoRⅠ双酶切位点后转入真核细胞表达质粒 pcDNA3．1;重组质粒 pcDNA3．1-CTLA-4经脂质体转染293T 细胞,以抗生素 G418筛选表达 CTLA-4的293T 细胞;定量 PCR、免疫荧光分别检测293T 细胞 CTLA-4表达与细胞定位。结果血样来源 T 细胞经活化后表达 CTLA-4转录本。 HindⅢ和EcoRⅠ双酶切证实重组质粒内 CTLA-4插入序列正确; RT-PCR 及免疫荧光检测证实293T 细胞能够稳定表达目的蛋白 CTLA-4,并定位于细胞膜表面。结论成功构建的 pcDNA3．1-CTLA-4重组真核表达载体,在293T 细胞膜表面实现了稳定表达,为进行相关生物学理论与应用研究打下基础。