腺病毒介导人p53抑癌基因对肝癌细胞系HepG2生物学行为的影响

研究腺病毒介导入野生型Ｐ５３抑制肝癌细胞系ＨｅｐＧ２生物学行为的影响。构建含人野生型Ｐ５３抑癌基因的生组腺病组载体，导入肝癌细胞系ＨｅｐＧ２后，分别用光镜，电镜ＴＵＮＥＬ法检测细胞凋亡发生和在裸鼠体内的成瘤性改变。     

P53蛋白对人瘢痕疙瘩成纤维细胞端粒酶活性的影响

目的:探讨P53蛋白(P53 protein)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(Keloid fibroblast／KFB)端粒酶活性的影响;明确在人瘢痕疙瘩成纤维细胞中P53蛋白与端粒酶活性之间的相互关系。方法:采用腺病毒介导法将野生型P53基因(Ad-P53)转染至人瘢痕疙瘩成纤维细胞中;将来源于瘢痕疙瘩组织的成纤维细胞随机分成二组。实验组转染野生型P53基因至成纤维细胞中。非转染组的成纤维细胞未进行野生型P53基因转染。用间接免疫荧光法检测成纤维细胞中P53蛋白的表达;TRAP-ELISA法检测成纤维细胞中端粒酶活性。结果:转染组细胞中P53蛋白表达明显高于非转染组细胞;而端粒酶活性明显低于非转染组细胞(P<0．01)。结论:P53蛋白能够抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞端粒酶活性。     

Ad—HGF转染对HepG2细胞的生长抑制作用

目的：探讨Ad—HGF转染对HepG2生长抑制作用的影响。方法：用Ad—HGF转染HepG2细胞，检测HGF蛋白表达及对细胞凋亡的影响；并用裸鼠致瘤试验体内观察Ad—HGF对HepG2细胞致癌的影响。结果：转染后24hHGF即有表达，48h达高峰。并观察到Ad—HGF可促进HepG2凋亡，体内Ad—HGF可抑制HepG2细胞生长成瘤。结论：Ad—HGF在体外可抑制HepG2细胞增殖、促进其凋亡，体内抑制其致癌作用。     

丁酸钠对肝癌Hep G_2细胞株Bcl-2表达的影响

目的：研究丁酸钠（NaB）引起HepG2细胞凋亡的作用及其分子机制。方法：用不同浓度丁酸钠处理HepG2细胞后，用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测Bcl-2mRNA的表达丰度；Hochest3342核染色后观察HepG2细胞核凋亡形态的变化；原位切口末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡。结果：丁酸钠在mRNA水平明显抑制Bcl-2基因的转录；荧光显微镜下可见丁酸钠处理后细胞核出现高度凝聚、边缘化，并可见凋亡小体出现；TUNEL法证明出现细胞凋亡。结论：丁酸钠通过下调Bcl-2的转录和表达，诱导肝癌HepG2细胞的凋亡。     

抑制MAPK介导bcl-2抗低剂量电离辐射诱发白血病细胞凋亡

目的:利用髓性白血病细胞HL60细胞,研究低剂量电离辐射(1Gy)对MAPK(丝裂原激活的蛋白激酶)和JNK(c-JUN末端激酶)活性的影响,确定MAPK介导与细胞辐射敏感性以及bcl-2表达与细胞存活的关系。方法:在辐照前和辐照中用MEK1/2(MAPK激酶)的抑制剂PD98059处理转化的HL60/pCEP4(对照质粒)和HL60/bcl-2细胞,1Gyγ射线照射后测定MAPK、JNK、Cdc2激酶活性,流式细胞仪测定细胞周期,以细胞凋亡和细胞集落形成能力作为辐射敏感性指标。结果:1低剂量电离辐射后20min,HL60/pCEP4和HL60/bcl-细胞MAPK活性升高至峰值,而JNK激酶活性无显…     

HCMV的IE2介导野生型p53基因促凋亡作用的研究

选择野生型P53缺失型的Jurkat细胞系，首先将wt-p53-pLXSN稳定转染入Jurkat细胞（Jurkat-wt-p53),再分别或联合转染TE1，TE2基因，并利用流式细胞仪分析。结果显示，转染了IE2基因的Jurkat-wt-p53细胞在瞬时转染24h后出现光镜下可见的细胞凋亡改变，此时取样进行流式细胞仪测定细胞周期分布状况，可见转染了IE2基因的Jurkat-wt-p53细胞周期分布较其他各组发生了明显的 变化，G1期和S期细胞分布减少，而G2期细胞增多，细胞阻滞于G2／M期，并且出现了细胞凋亡亚二倍体峰,引起细胞凋亡。研究表明，在Jurkat 细胞中HCMV的IE2基因可介导野生型P53基因的促凋亡作用。     

重组腺病毒介导多重基因对喉癌的治疗研究

目的　探讨携带p5 3、B7 1和GM CSF基因的重组腺病毒 (BB 1 0 2 )对荷瘤裸鼠体内人喉癌细胞的基因治疗效果。方法　建立喉癌裸鼠模型 ,瘤内注射BB 1 0 2、Ad GFP和PBS ,观察肿瘤生长情况 ,并对肿瘤组织进行病理学和免疫组化检查。结果　经多因素析因方差分析 ,实验组与对照组肿瘤重量和瘤体积差异有统计学意义 (P <0 0 5 )。经治疗后 ,实验组肿瘤中未发现突变型 p5 3的表达 ,Ki6 7阳性表达率极低 ;光镜和透射电镜下可见肿瘤细胞凋亡。结论　BB 1 0 2可在喉癌细胞中有效表达 ,抑制其生长 ,诱导其凋亡 ,在喉癌基因治疗中具有较好的应用前景 ,可望发展成临床上的一种抗癌剂     

VEGFP-CDglyTK系统诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的 探讨腺病毒介导血管内皮生长因子(VEGF)启动子驱动的CD/TK双自杀基因体系(Ad-VEGFP-CDglyTK)对肝癌细胞HepG2的体外杀伤作用.方法 用重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK体外感染表达VEGF的HepG2细胞,荧光显微镜观察其感染效率,然后给予前药更昔洛韦(GCV)和5-氟胞嘧啶(5-FC),在光镜、透射电镜下观察,用流式细胞术等方法 观察细胞凋亡、细胞周期及细胞内DNA含量的变化.结果 腺病毒对HepG2细胞的感染率随病毒滴度的增高而递增.在感染复数为100时,前药GCV和5-FC在一定范围(GCV 5-FC分别为:1mg/L 20mg/L,10mg/L 40mg/L,100mg/L 60mg/L)内呈剂量依赖性地诱导HepG2细胞凋亡;中浓度下(GCV:10mg/L,5-FC:40mg/L)作用细胞72h,透射电镜下可见HepG2细胞发生典型凋亡改变:空泡形成,染色质浓缩、沿核膜排列,甚至出现核碎裂现象.流式细胞仪测定见用药组出现典型的凋亡峰;随着药物浓度的增加,凋亡细胞所占的比例逐渐增加,实验组凋亡细胞数与对照组比较有显著性差异(P＜0.01);细胞周期分析显示前药能明显抑制HepG2/CD-TK细胞的增殖,主要作用在细胞G2-M期.结论 VEGF启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达VEGF的HepG2细胞,其机制与诱导细胞凋亡有关.     

小檗碱对肝癌细胞活性与增殖能力的影响及其机制

目的 探讨小檗碱(BBR)对肝癌细胞的活性与增殖能力的影响及其机制。方法 取正常人肝细胞MIHA和人肝癌细胞Hep3B、HepG2，设置对照组与0、12.5、25、50μmol/L BBR组，采用CCK-8实验、克隆形成实验探究无糖环境下BBR对MIHA、Hep3B、HepG2细胞活性及克隆形成的影响；SYTOX荧光染色检测细胞死亡情况；流式细胞术检测BBR孵育后肝癌细胞活性氧(ROS)水平的变化；Western blotting检测BBR孵育后Nrf2及其相关蛋白的变化；将蛋白酶体抑制剂MG132及蛋白合成抑制剂环己酰胺(CHX)与BBR共同孵育，研究其对Nrf2蛋白的影响；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BBR孵育后Hep3B细胞的Nrf2及HO-1在基因水平的变化；于裸鼠皮下注射Hep3B细胞，构建裸鼠成瘤模型，在BBR组及对照组裸鼠腹腔分别注射BBR或等量生理盐水，观察BBR在体内对肿瘤生长的影响。HE及免疫组化染色研究在体内环境BBR对Nrf2及相关蛋白的影响。结果 无糖环境下BBR孵育后，肝癌细胞Hep3B、HepG2的活性逐渐下降(P<0.05)，正常肝细胞...     

美味猕猴桃根乙酸乙酯提取物部分对肝癌HepG2细胞增殖影响及机制研究

目的探讨美味猕猴桃根乙酸乙酯提取物部分(EE-ADP)对肝癌HepG2细胞增殖的影响及其机制。方法四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测EE-ADP对肝癌HepG2细胞增殖的作用; Hochest33258染色及流式细胞技术检测其凋亡作用;蛋白免疫印迹法检测EE-ADP对抗原呈递细胞(APC)蛋白及β连环蛋白(β-catenin)的影响及可能影响细胞增殖的机制。结果 MTT染色法提示,不同浓度的EE-ADP干预肝癌HepG2细胞能一定程度上抑制肝癌细胞的增殖,且存在时间-浓度依赖性。40μg/ml组的凋亡率为17. 70%,与完全培养基组的4. 80%比较,差异无统计学意义(P> 0. 05)。60μg/ml组及80μg/ml组凋亡率分别为50. 75%、64. 30%,与完全培养基组比较,差异均有统计学意义(P <0. 05)。蛋白免疫印迹法结果显示,随着加药浓度的增加,APC基因蛋白表达量增加,β-catenin基因表达量减少。结论 EE-ADP可以抑制肝癌HepG2细胞的增值,其机制可能为降低β-catenin而上调APC的表达,阻断Wnt/β-catenin信号通路。     

环氧合酶2基因沉默诱导人肝癌细胞凋亡的作用观察

目的 观察作用于环氧合酶2(COX-2)mRNA的发卡状COX-2(COX-2 shRNA)真核表达质粒对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计靶向COX-2基因的RNA干扰序列,构建COX-2 shRNA表达载体,用阳离子脂质体Lipofectamine 2000转染体外培养的HepG2细胞.半定量RT-PCR检测COX-2 mRNA表达水平的变化,筛选有效抑制COX-2基因表达的序列.采用CCK-8细胞计数法检测COX-2 shRNA对细胞增殖的影响,流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期,Western blotting检测细胞内COX-2和Bcl-2蛋白表达水平.结果 测序结果显示成功构建了2个表达COX-2shRNA的质粒载体,转染HepG2细胞后COX-2 mRNA表达下降至阴性对照组的41.66％和77.79％.选择沉默效率较佳者转染细胞并经G418筛选,获得稳定表达COX-2 shRNA的细胞,胞内COX-2 mRNA表达水平下降了75.30％,细胞增殖活性下降了 29.33％.在稳定表达COX-2 shRNA、错义序列以及未转染的细胞中,细胞凋亡率分别为17.83％、4.63％和4.47％,G0/G1期细胞比例分别为73.93％、61.2％和57.630％,而S期细胞比例分别为13.43％、26.03％和26.90％.Westernblotting检测显示,表达COX-2 shRNA的HepG2细胞内COX-2蛋白水平下降至表达错义序列组的31.25％(P＜0.01),Bcl-2蛋白水平下降至表达错义序列组的54.93％(P＜0.01),而转染错义质粒组与未转染组之间比较差异无统计学意义.结论 构建的真核表达载体pSilencer 2.1-U6-COX-2 shRNA能有效沉默人肝癌HepG2细胞内COX-2基因的表达,并具有抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和细胞周期阻滞、降低胞内抗凋亡蛋白(H)Bcl-2水平的作用.     

Low-dose hyper-radiosensitivity in human hepatocellular HepG2 cells is associated with Cdc25C-mediated G2/M cell cycle checkpoint control

Purpose: Although the significance of cell cycle checkpoints in overcoming low-dose hyper-radiosensitivity (HRS) has been proposed, the underlying mechanism of HRS in human hepatocellular cells remains unclear. Therefore, the aim of this study was to characterize HRS inhuman hepatocellular HepG2 cells and to explore the molecular mechanism(s) mediating this response.

Materials and methods: HepG2 cells were exposed to various single doses of γ radiation (from 0?Gy to 4?Gy), and then were assayed at subsequent time-points. Survival curves were then generated using a linear-quadratic (LQ) equation and a modified induced repair model (MIRM). The percentage of cells in the G1, G2/M, and S phases of the cell cycle were also examined using propidium iodide (PI) staining and flow cytometry. Levels of total cell division cyclin 25C (Cdc25C) and phosphorylated Cdc25C were examined by Western blotting.

Results: Low-dose γ radiation (<0.3?Gy) induced HRS in HepG2 cells, while doses of 0.3, 0.5, and 2.0?Gy γ radiation significantly arrested HepG2 cells in the G2/M phase. While total Cdc25C levels remained unchanged after irradiation, levels of phosphorylated Cdc25C markedly increased 6, 16, and 24?h after treatment with 0.5 or 2.0?Gy radiation, and they peaked after 16?h. The latter observation is consistent with the G2/M arrest that was detected following irradiation.

Conclusions: These findings indicate that low-dose HRS in HepG2 cells may be associated with Cdc25C-mediated G2/M cell cycle checkpoint control.     

三氧化二砷对人肝癌细胞凋亡及Bcl-2、caspase-3蛋白表达的影响

目的研究三氧化二砷（arsenic trioxide,As2O3）诱导HepG2细胞凋亡及其机制。方法采用MTT法、形态学观察及流式细胞术方法检测As2O3对HepG2细胞的生长抑制、凋亡作用的影响,用Western blot检测As2O3处理后HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2和caspase-3的表达。结果As2O3对HepG2细胞有明显的抑制增殖作用,且呈浓度和时间依赖性,细胞呈典型的凋亡形态学改变,As2O3呈时间依赖性诱导HepG2细胞凋亡。As2O3处理不同时间后,Bcl-2蛋白表达水平下调,caspase-3蛋白表达水平升高。结论As2O3具有诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的作用,其机制可能与其下调Bcl-2蛋白的表达,促进caspase-3活化有关。     

过表达miR-29c靶向抑制AKT2增强肝癌HepG2细胞放射敏感性的实验研究

目的 探讨miR-29c靶向AKT2对肝癌细胞HepG2放射敏感性的影响。方法 RT-PCR检测人正常肝THLE-3细胞和肝癌HepG2细胞中miR-29c表达。给予不同剂量（0、2、4、6和8 Gy）的X射线照射后,RT-PCR检测HepG2细胞中miR-29c表达变化。经生物信息学预测并采用双荧光素酶报告基因实验和Western blot检测miR-29c与AKT2的靶向关系。采用脂质体2000将miR-29c mimic/AKT2基因重组质粒和miR-29c inhibitor/慢病毒载体AKT2 shRNA转染至HepG2细胞中,并给予不同剂量X射线照射后,克隆形成实验和MTT实验检测miR-29/AKT2对HepG2细胞存活率和细胞活力的影响。结果 与THLE-3细胞相比,HepG2细胞中miR-29c明显降低,差异有统计学意义（t=17.816,P<0.05）;HepG2经2、4、6和8 Gy X射线照射后,细胞存活率较THLE-3细胞显著降低（t=4.541、6.823、7.218、9.363,P<0.05）,HepG2细胞中miR-29c表达显著下降（t=5.599、9.262、10.470、10.873,P<0.05）。miR-29c过表达可降低HepG2细胞存活率和细胞活力（t_存活率=4.307、7.668、7.668、6.894,P<0.05;t_细胞活力=3.443、8.116、13.434,P<0.05）;反之,抑制miR-29c表达则升高HepG2细胞存活率和细胞活力（t=4.003、6.713、7.141,P<0.05;t_细胞活力=4.282、5.113,P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验表明,AKT2是miR-29c的靶基因,Western blot检测结果显示,miR-29c可负向调控AKT2蛋白表达。沉默AKT2后,HepG2细胞的存活分数及细胞存活率趋势与miR-29c过表达相一致;反之,AKT2过表达则与抑制miR-29c表达相一致。结论 miR-29c可通过靶向AKT2增加肝癌细胞HepG2放射敏感性。     

莪术油配伍椒目仁油对小鼠移植性肿瘤的抑制作用

目的观察不同剂量莪术油配伍椒目仁油对小鼠移植性肿瘤S180的抑瘤作用,以及对人源性肝癌细胞株HepG2和大肠癌细胞株SW480的体外抑瘤作用。方法 72只二级昆明小鼠采用肿瘤移植法建立小鼠荷瘤动物模型;椒莪软胶囊灌胃给药,剂量分别为0.3、0.6、1.2 ml/kg;氟尿嘧啶22.5 mg/kg作为阳性对照药腹腔注射给药;连续给药15 d,观察药物对肿瘤生长的抑制作用。对人源性肝癌细胞株HepG2和大肠癌细胞株SW480进行传代培养后,制备不同剂量(椒莪软胶囊0.015 625、0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml)含药血清、氟尿嘧啶阳性药血清和肿瘤移植模型不用药对照血清,作用于人源性肝癌细胞株HepG2和大肠癌细胞株SW480,四甲基偶氮唑蓝比色法观察血清对两种细胞的抑制作用。椒莪软胶囊0.0、6.25、12.5、25.0μg/ml给药15 h后,经流式细胞仪测定对人源性肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响。结果①椒莪软胶囊0.3、0.6、1.2 ml/kg肿瘤抑制率分别为19.73%、32.22%和46.68%。随着给药剂量的增加,坏死的肿瘤细胞所占比例也相应增加,生长活跃的肿瘤细胞逐渐减少。②抑制作用随剂量升高而作用增强,对人源性肝癌细胞株HepG2体外最低药物物浓度为0.062 5 mg/ml,对大肠癌细胞株SW480体外最低药物浓度为0.125 mg/ml。③椒莪软胶囊可明显促进人源性肝癌细胞株HepG2的细胞凋亡。结论椒莪软胶囊对小鼠移植性肿瘤有明显的抑制作用,对人源性肝癌细胞株HepG2和大肠癌细胞株SW480有明显的抑制作用。椒莪软胶囊在临床具有广阔的应用前景。     

IL-8通过整合素调控肝癌HepG2细胞迁移

目的：研究IL-8对肝癌细胞HepG2增殖、迁移的影响,探讨整合素α亚基在调控HepG2细胞迁移中的作用。方法以不同浓度（0～125 ng／ml）的IL-8刺激HepG2细胞,分别采用MTT法检测IL-8对肝癌细胞的增殖作用;细胞划痕损伤模型测定不同处理组在0、4、8、12和24 h各时间点对HepG2细胞水平迁移的影响;Transwell法检测刺激24 h后HepG2细胞纵向迁移能力;免疫荧光检测0、125 ng／ml IL-8刺激HepG2细胞8 h后细胞骨架的变化;Western印迹测定整合素α亚基的表达变化规律。结果与对照组相比,IL-8促进HepG2细胞增殖,但各浓度间无明显差异;细胞划痕损伤实验和Transwell实验均表明IL-8可促进HepG2细胞迁移,且具有浓度依赖性; IL-8诱导HepG2细胞骨架重排,使丝状伪足样凸起数目增多;Western印迹结果显示,IL-8上调整合素α亚基的表达,但各亚基具有浓度性差异。结论 IL-8可通过上调整合素α亚基的表达促进HepG2细胞迁移,各α亚基调控作用可能具有差异性。     

乙型肝炎病毒基因组转染HepG2细胞的microRNA表达研究

目的 检测乙型肝炎病毒(HBV)全基因组转染对人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞中microRNA(miRNA)表达的影响,为进一步探讨肝细胞中HBV复制的分子生物学机制提供平台.方法 分别提取HepG2.2.15细胞(转染HBV全基因组的HepG2细胞,实验组)和其亲本HepG2细胞(对照组)的总RNA并分离miRNA,采用含509条探针的哺乳动物miRNA表达谱芯片对两组之间差异表达的miRNA进行分析.用SAM软件针对差异miRNA筛选的标准为在两组之间荧光强度差异4倍以上,差异miRNA的整体假阳性率为0.选择其中2个miRNA,应用实时荧光定量RT-PCR方法对芯片结果进行验证.结果 HepG2.2.15细胞与HepG2细胞间差异表达的miRNA共27个(占5.3%),其中7个表达上调,20个表达下调.miR-181d和miR-15a的实时荧光定量RT-PCR验证结果与芯片表达结果基本一致.结论 肝细胞中存在着与HBV复制相关的miRNA,这些上调和下调表达的miRNAs可能参与了HBV在肝细胞中的复制.     

持续低剂量率照射后HepG2细胞的ATM磷酸化

目的 探讨持续低剂量率照射下HepG2细胞共济失调毛细血管扩张症突变基因(ATM)磷酸化的变化规律。方法 应用间接免疫荧光、Western blot技术检测持续低剂量率(8.28 cGy/h)照射下HepG2细胞ATM磷酸化蛋白的表达;采用集落形成法观察持续低剂量率照射对HepG2细胞增殖活性的影响。 结果持续低剂量率照射30 min后,ATM即已发生磷酸化,持续照射6 h时,ATM磷酸化蛋白表达量最多,以后逐渐减弱。使用Wortmannin抑制ATM磷酸化后,降低了持续低剂量率照射下肝癌细胞的存活分数。结论在持续低剂量率照射中后期ATM磷酸化减弱,提示持续低剂量率照射具有增加HepG2细胞辐射敏感性的潜能。     

活血化瘀药物对肝癌细胞HepG2的抑制作用及机制

目的观察活血化瘀中药在体外实验条件下对人肝癌细胞HepG2细胞增殖、迁移的影响,对纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）表达的影响,探讨活血化瘀药物对人肝癌细胞HepG2细胞的抑制作用与分子机制。方法培养HepG2细胞,将中药黄芪、复方当归、复方丹参、川芎嗪分别加入体外培养的肝癌细胞株HepG2细胞,应用MTS法检测其对人肝癌细胞HepG2细胞增殖的影响;应用细胞迁移实验观察其对HepG2细胞迁移的影响;应用RT—PCR方法检测对HepG2细胞PAI-1mRNA表达的影响,ELISA法检测对PAI-1表达的影响。结果活血化瘀中药黄芪、当归、丹参、川芎嗪可不同程度地抑制HepG2细胞增殖与迁移,降低HepG2细胞PAI-1mRNA表达、抗原水平,以复方丹参、川芎嗪组作用更为明显。结论活血化瘀中药可有效抑制人肝癌细胞HepG2细胞增殖与迁移,同时抑制PAI-1表达,这可能是其具有抗肿瘤作用的分子机制之一。