新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的纯化方法研究

目的 探讨新生大鼠嗅球嗅鞘细胞（OECs）的体外培养和纯化方法，为研究脊髓损伤后神经再生获得丰富OECs来源奠定基础。方法 用原代培养的方法分离、培养新生大鼠嗅球OECs，比较p75抗体吸附、阿糖胞苷抑制、差速贴壁三种方法的纯化效果，根据GFAP免疫细胞化学染色结果统计所得OECs的纯度，同时在相差显微镜下对不同培养时期的OECs的形态进行观察。结果 体外培养的新生大鼠嗅球OECs主要为双极或三级细胞，其突起细长。未经纯化的OECs则成纤维细胞生长迅速而占优势，三种纯化方法均能使接种14d后的OECs纯度均值大于75％。p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法的纯化率均值略高于差速贴壁法。结论 新生大鼠嗅球OECS的原代培养中细胞纯化是必要的；在脊髓损伤再生研究中，较之p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法，差速贴壁法是一种简单、经济、实用的OECs纯化方法。     

成年大鼠嗅鞘细胞的原代培养与鉴定

目的 探索一种简便、经济实用的获得成年大鼠嗅鞘细胞的方法.方法 无菌条件下取2.5月龄的SD大鼠嗅球最外二层,经分散后将细胞种植于含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基中.采用差速贴壁和阿糖胞苷抑制相结合的方法培养.定期进行形态学观察并摄片.在培养第14 d行胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和神经生长因子受体(NGFRp75)的免疫细胞化学染色鉴定,并计算嗅鞘细胞的纯度.结果 培养的嗅鞘细胞呈双极、多突起形、扁圆形三种,其中扁圆形较少,嗅鞘细胞的纯度在90%以上.结论 差速贴壁和阿糖胞苷化学抑制相结合进行成年大鼠嗅鞘细胞原代培养是一种简便经济实用的方法,可获得高纯度的嗅鞘细胞.     

不同纯化方法体外培养人胚嗅球嗅鞘细胞

目的 采用不同纯化方法原代培养人胚嗅球嗅鞘细胞(OECs),探讨简单实用可获得高纯度人胚嗅球OECs的体外培养方法.方法 以差速贴壁法为基础结合阿糖胞苷法、无血清饥饿法和问断神经营养因子3(NT3)法纯化培养人胚嗅球OECs.观察不同纯化方法下OECs生长变化,采用免疫细胞化学染色进行纯度鉴定.结果 体外培养的人胚嗅球OECs为双极、三极细胞.细胞突起细长,并可形成细胞突起网络.差速贴壁法培养3～6 d时纯度约为88%,以后成纤维细胞增殖,OECs纯度迅速下降.无血清饥饿法培养3～6 d时OECs纯度约为90%,但细胞状态差.间断NT3法培养3～9 d时OECs纯度约为95%,且细胞状态良好.经统计学处理,第6 d后差速贴壁 间断应用NT2法优于其他方法,细胞纯度的差异有统计学意义(P<0.05).结论 差速贴壁结合同断NT3法可获得高纯度状态良好的OECs,是一种简单实用的OECs纯化培养方法 .     

大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的分裂增殖和免疫细胞化学特性

目的:体外培养大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞(olfactoryensheathingcells,OECs),观察其形态、分裂增殖和免疫细胞化学特性,探索自体嗅黏膜嗅鞘细胞作为OECs来源的可能性。方法:采用差时贴壁的方法分离培养成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞,相差显微镜下观察细胞形态和分裂增殖;用免疫组化方法观察GFAP、NGFRp75、S鄄100、NGF、BDNF、NT鄄3的表达。结果:培养的细胞根据形态来分,可分为双极、多极和偏平状;细胞分裂时先回缩成球形,分裂成两个子球,再伸出突起,变成梭形或多极形。GFAP、NGFRp75、S鄄100、BDNF和NT鄄3表达阳性。结论:在含血清培养基上,大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞能正常分裂增殖和分泌神经营养因子。     

大鼠嗅球嗅鞘细胞的改良培养及耳蜗内植入的初步研究

目的 建立并改良大鼠嗅球嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)的取材、纯化、培养、鉴定及示踪方法,并初步探讨OECs耳蜗内植入的可行性.方法 采用改良法分离新生3 d的SD大鼠嗅球OECs,用差速贴壁加抗有丝分裂法行纯化培养,观察培养细胞的形态特点及生长情况,利用低亲和力神经生长因子受体NGFRp75行免疫组化鉴定并评估细胞纯度.将纯化培养7 d后的OECs与5-溴-2′-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2′-deoxyuridine,BrdU)共同孵育48 h,以免疫荧光法观察OECs的增殖活性;同法标记供移植用的OECs.在成年大鼠耳蜗底周钻微孔,注入OECs悬液,24 h后作耳蜗冰冻切片行免疫荧光染色,观察移植的OECs在蜗内存活与分布情况.结果 用改良技术体外培养的OECs增殖速度快,于第9天细胞数量最多,且逐渐表现出典型的形态学特征;绝大部分培养的OECs NGFRp75免疫组化呈阳性反应,细胞纯度最高达85%.OECs与BrdU共同孵育48 h后,约90%的培养细胞免疫荧光呈阳性反应.初步建立了内耳OECs移植方法;经耳蜗底周注入OECs后24 h,BrdU阳性细胞主要分布于耳蜗的外淋巴腔,部分细胞附着于鼓阶外侧壁.结论 采用改良的嗅球OECs分离培养法可以获得高纯度、增殖活性良好的OECs;OECs耳蜗内植入后短期内可存活,初步提示耳蜗内OECs移植基本可行,值得进一步研究.     

人胚嗅粘膜嗅鞘细胞的分离、培养和纯化

目的 采用经我们改良的差速贴壁法结合神经营养因子3(NT3)和低浓度血清的培养方法对人胚嗅粘膜嗅鞘细胞进行分离和原代纯化培养,探讨建立嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养的方法.方法 对差速贴壁后的人胚嗅粘膜嗅鞘细胞交替应用含10%胎牛血清和含2.5%胎牛血清、NT3的DMEM-F12培养基进行原代培养.观察嗅粘膜嗅鞘细胞的形态学变化.采用p75NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测.结果 人胚嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极,伴有细长的突起.p75NTR和GFAP染色均呈阳性反应,体外培养9 d时纯度可达83%.结论 差速贴壁法结合低浓度血清和NT3应用可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞.     

人胚嗅粘膜嗅鞘细胞的分禽、培养和纯化

目的采用经我们改良的差速贴壁法结合神经营养因子3（NT3）和低浓度血清的培养方法对人胚嗅粘膜嗅鞘细胞进行分离和原代纯化培养，探讨建立嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养的方法。方法对差速贴壁后的人胚嗅粘膜嗅鞘细胞交替应用含10％胎牛血清和含2．5％胎牛血清、NT3的DMEM—F12培养基进行原代培养。观察嗅粘膜嗅鞘细胞的形态学变化．采用p75^NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测。结果人胚嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极，伴有细长的突起。p75^NTR和GFAP染色均呈阳性反应，体外培养9d时纯度可达83％。结论差速贴壁法结合低浓度血清和NT3应用可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞。     

成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的分离、培养、鉴定与纯化

目的:探讨嗅黏膜中嗅鞘细胞的培养方法.方法:取成年大鼠嗅黏膜,采用差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞,并采用免疫荧光法进行鉴定与形态学观察.结果:通过差速贴壁法纯化,可获得纯度约为80%的嗅鞘细胞,并通过GFAP免疫荧光及P75和hoechst双重免疫荧光鉴定;相差显微镜下细胞形态以梭形、双极及三极细胞为主,有少量的多极细胞.结论:从成年大鼠嗅黏膜中成功分离培养出嗅鞘细胞,为从人鼻腔嗅黏膜中培养嗅鞘细胞提供重要的依据.     

嗅球成鞘细胞的培养纯化及与功能相关的形态学研究

目的 培养纯化嗅球成鞘细胞(Olfactory ensheathing cells，OECs)并对其进行免疫细胞化学研究，探讨其相关功能。方法 分离嗅球嗅神经纤维层获得嗅球成鞘细胞，采用免疫溶解法对培养的嗅球成鞘细胞进行纯化，并利用免疫细胞化学方法和电镜技术进行形态学观察。结果 通过纯化可以使培养的OECs纯度达95％以上，免疫细胞化学显示OECs表达P75NGFr、GAP43、N—CAM和GFAP；电镜结果显示OECs呈分叶状核，胞浆电子致密，胞膜有伪足样皱褶。结论 免疫溶解法可以较好的纯化OECs并保持其良好的生长状态，培养的OECs表达P75NGFr、GAP43、N-CAM可能与其促进轴突再生的功能相关。     

成年大鼠嗅球成鞘细胞的分离培养及形态学研究

目的：探讨大鼠嗅球成鞘细胞(olfactory ensheathing cells OECs)的分离培养方法并观察其形态。方法：采用差时贴壁和阿糖胞苷(Ara—c)抑制相结合的方法培养嗅鞘细胞,并在不同阶段进行观察和行NGFRp75和GFAP免疫组化染色鉴定。结果：成功培养出高纯度的嗅鞘细胞,胞体呈梭形、多突起形及油煎蛋形3种类型,突起细长编织成网状。结论：差时贴壁和Ara—c抑制相结合的纯化培养方法是一种简单而又有实效的嗅鞘细胞培养方法。     

鼻窦炎性嗅觉障碍的超微结构

探讨鼻窦炎引嗅觉障碍的发病机制。方法在鼻腔内窥镜下取嗅区粘膜进行超微结构观察。结果嗅粘膜上皮层嗅细胞和支持细胞均出现不同程度和不同性质的变性,坏死,脱落,部分嗅细胞嗅毛减少或缺失,细胞排列紊乱,细胞表面的连接异常,基细胞增生修复。     

嗅沟脑膜瘤的临床诊断和治疗

目的 分析溴沟脑膜瘤的临床诊断和治疗。方法 收集17例嗅沟脑膜瘤手术病例，并分析其临床表现和手术治疗结果。结果 嗅沟脑膜瘤大多以精神症状、视觉障碍和癫痫为首发症状，16例行SimpsonⅡ级切除，1例SirepsonⅢ级切除，预后良好，无复发。结论 重视以精神症状为首发症状的溴沟膜瘤的出现，及早诊断，显微技术的应用有利于提高疗效。     

胎儿嗅粘膜的形态学观察

目的 研究胎儿嗅粘膜的发育。方法 对９０例（１２～４０周）胎儿标本的鼻腔行组织切切片和ＨＥ染色，光镜观察嗅粘膜，嗅丝和筛孔内结构的发育及组织形态，结果 人胎儿鼻内嗅区的表面被覆高柱状嗅上皮，以上鼻甲的嗅区粘膜为明显。固有层内含丰富的Ｂｏｗｍａｎ腺和类似细胞状结构，该结构在软骨内可见集聚的嗅神经束（嗅丝）至出生时，筛板上含１２～１６个筛孔，孔内可见嗅丝及其神经外膜，神经鞘和伴行的血管，嗅神经在筛板处     

嗅神经母细胞瘤(附二例报告)

本文报告2例嗅神经母细胞瘤的典型病例并复习文献。肿瘤均原发于鼻腔,瘤组织由排列成条索、片团状的瘤细胞组成。电镜观察发现部分瘤细胞内有神经分泌颗粒样结构。本文临床和病理观察结果支持本瘤的嗅神经上皮起源说。     

大鼠嗅鞘细胞的纯化及活性检测

目的采用改良差速贴壁联合胰酶限时消化法纯化大鼠嗅鞘细胞,并检测嗅鞘细胞的生物活性。方法分离新生7d的SD大鼠嗅球嗅鞘细胞,分组后采用改良的6h和18h两次差速贴壁法联合不同时段（1、3和5min）胰酶消化法纯化培养,观察不同时段纯化的嗅鞘细胞的形态特点及生长情况;应用FITC标记的神经生长因子受体p75抗体（兔抗鼠NGFRp75抗体）检测嗅鞘细胞并评估细胞纯度;应用CCK-8法和酶联免疫吸附法分别检测嗅鞘细胞在纯化后3～15d的增殖活性和分泌脑源性神经营养因子的含量。结果随着细胞的生长,梭形的嗅鞘细胞逐渐增多;改良差速贴壁联合胰酶限时消化1min、3min、5min法所得嗅鞘细胞纯度分别为（57.52±2.13）%、（78.95±2.60）%、（49.01±0.74）%,3min组最明显,组间两两比较差异有统计学意义（P〈0.05）;改良差速贴壁法联合胰酶限时消化1min、3min、5min法所得嗅鞘细胞在纯化后7、9、11d时增殖的细胞数目和脑源性神经营养因子分泌量显示3min组最优,组间比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论改良差速贴壁（6h＋18h）联合胰酶限时消化3min的纯化方法能获得较高纯度的嗅鞘细胞。     

电针迎香穴对嗅觉障碍大鼠嗅球及嗅黏膜IGF-1、FGF-2的影响

目的:观察电针迎香穴通过三叉神经通路对嗅觉障碍大鼠嗅球及嗅黏膜胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)和成纤维生长因子-2(fibroblast growth factors-2,FGF-2)表达的影响,以阐明其治疗嗅觉功能障碍的作用机制。方法:取SD雄性大鼠40只,随机分为空白组,模型组,电针迎香穴组,电针迎香穴+眶下神经切断组,每组10只。除空白组外,其余各组均用灌注Triton X-100的方法建立嗅觉障碍,造模成功后进行电针干预,期间观察大鼠嗅觉行为学等指标,电针干预10 d,用免疫组织化学法测定嗅球及嗅黏膜组织中IGF-1和FGF-2的表达水平。结果:模型组嗅球及嗅黏膜中FGF-2或IGF-1表达减少、食物小球寻找时间增加(P0.05),而电针迎香穴干预可以显著提高FGF-2或IGF-1的表达水平并缩短食物小球寻找时间(P0.05),电针迎香穴+眶下神经切断则无显著干预效应。结论:电针干预可以减轻由Triton X-100诱导的大鼠嗅觉功能障碍症状,其机制可能与提高嗅觉神经元再生因子FGF-2或IGF-1的表达有关,且其干预效应的产生与三叉神经通路的完整性相关。     

嗅神经上皮瘤的临床病理分析

分析嗅神经上皮瘤（嗅神经母细胞瘤）的临床、病理特点,探讨免疫组化技术和电镜在嗅神经上皮瘤诊断中的应用价值。方法对１９例嗅神经上皮瘤进行了临床分析,光镜复查,免疫组化检测,４例做了透射电镜观察。结果嗅神经上皮瘤主要发生于中青年,起病缓慢,首发症状以单侧鼻塞和鼻出血为多见,病理形态为小圆细胞和短梭形细胞呈巢状及弥散分布,菊形团结构少见或缺如;免疫组化检测ＮＳＥ、Ｓｙｎ阳性,ＣＫ、Ｓ－１００等部分阳性,ＧＦＡＰ阴性;电镜超微结构２例在胞质内找到神经分泌颗粒,３例在胞质内发现中间丝、微丝和基膜,１例有细胞连接和神经突起。结论嗅神经上皮瘤这个名称较嗅神经母细胞瘤更确切,诊断除常规病理外,尚需借助于免疫组化检测,分化差的病例只能通过电镜或其他先进的手段来解决。     

嗅鞘细胞的研究进展

神经损伤与再生研究是当今神经科学领域的热点,在众多研究方法之中,细胞移植为一种理想的研究治疗手段.选择的移植材料是否理想,直接关系到神经再生及其功能恢复.近年来,对嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)的研究呈现出如火如荼的局面,对于神经损伤的修复及病变的治疗显示出了广阔的临床应用前景.研究发现,OECs终身具有神经再生功能,还能够释放多种神经营养因子,神经粘附分子等,被认为是髓鞘化能力最强的胶质细胞,它具有星型胶质细胞和雪旺细胞的特点,并迁徙于周围神经和中枢神经,具有促进损伤神经轴突再生的能力,还能帮助神经轴突穿越损伤的瘢痕区域到达损伤的靶细胞,帮助加速神经功能的恢复.本文就近些年OECs的研究进行了综述.