婴儿双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统对裸鼠肾细胞癌肿瘤细胞凋亡及NF-κB活性的影响

目的：证实婴儿双歧杆菌（bifidobacterium infantis,BI）介导单纯疱疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus thymidine ki－nase,HSV-TK）/丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV）自杀基因系统对裸鼠肾癌的治疗作用,检测其诱导裸鼠肾癌组织细胞凋亡的作用及对核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）信号通路的影响。方法：引瘤后原代细胞培养注射细胞悬液法建立裸鼠皮下荷瘤肾癌模型,并随机分为BI-pGEX-TK/GCV组（重组质粒组）、BI-pGEX-5X-1/GCV组（空质粒组）、BI/GCV组（空ＢＩ组）和生理盐水/GCV对照组（生理盐水组）。分别经尾静脉注射BI-pGEX-TK、BI-pGEX-5X-1、BI和生理盐水,联合腹腔注射GCV,4周后,称取裸鼠质量及肿瘤质量。TUNEL法检测各组肿瘤细胞凋亡情况,qRT-PCR、Western blot检测各组肿瘤组织Rel A、Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平。结果：（1）重组质粒组荷瘤裸鼠体质量明显高于其余3组（P=0.006）,肿瘤组织质量明显降低（P=0.003）。（2）TUNEL法检测发现各组均有不同程度的肿瘤细胞凋亡,以重组质粒组最为明显（P=0.000）。（3）与空质粒组、空BI组及生理盐水组比较,重组质粒组Rel A蛋白表达明显下调（P=0.000）,Caspase-3蛋白表达明显上调（P=0.000）。结论：BI介导HSV-TK/GCV自杀基因系统对荷瘤裸鼠肾癌有明显的抑制作用,可能通过影响NF-κB信号通路的活性,诱导荷瘤裸鼠肾癌肿瘤细胞的凋亡,发挥抑癌作用。     

双歧杆菌对实验性大肠癌细胞凋亡的影响

我们以大肠癌裸鼠移植瘤为动物模型,用原位末端标记法、免疫组化法以及电镜检测了移植瘤的凋亡细胞以及ｂｃ１２、ｂａｘ基因的表达水平,旨在探讨双歧杆菌的抑瘤机理。一、材料和方法１．实验动物：ＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）小鼠,６～８周龄,雄性,体重约１８～２...     

双歧杆菌对大肠癌细胞凋亡的影响

目的探讨双歧杆菌的体外抗肿瘤作用及其对肿瘤细胞凋亡的影响。方法将双歧杆菌体外直接作用于大肠癌LoVo细胞,以MTT法检测双歧杆菌对肿瘤细胞的杀伤作用;用流式细胞仪检测双歧杆菌对肿瘤细胞凋亡的影响。结果双歧杆菌在体外对大肠癌LoVo细胞具有显著的杀伤作用,且浓度越大、作用时间越长,其抑制作用越强,具有浓度和时间依赖性,且双歧杆菌能诱导肿瘤细胞凋亡。结论双歧杆菌对大肠癌LoVo细胞具有生长抑制作用,其机制可能是通过诱导细胞凋亡达到抑制肿瘤生长的作用。     

婴儿双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统对大鼠膀胱癌组织细胞凋亡及Fas/FasL表达的影响

目的 评价婴儿双歧杆菌(BI)介导单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因治疗系统对SD大鼠膀胱癌的治疗效果,探讨其诱导大鼠膀胱癌组织细胞的凋亡及对大鼠膀胱癌组织Fas/FasL mRNA和蛋白表达的影响.方法 N甲基亚硝基脲(MNU)膀胱灌注法诱导建立大鼠膀胱肿瘤模型,并随机分为生理盐水/GCV对照组(生理盐水组)、BI-pGEX-5X-1/GCV组(空质粒组)和BI-pGEX-TK/GCV治疗组(重组质粒组).分别将生理盐水、BI-pGEX-5X-1、BI-pGEX-TK经尾静脉注射到各组荷瘤大鼠体内,联合腹腔注射GCV,治疗4周后,称取各组膀胱癌组织质量.TUNEL法检测各组肿瘤组织凋亡,RT-PCR、蛋白质印迹法(Western blot)检测各组肿瘤组织Fas/FasL mRNA及蛋白表达水平.结果 与空质粒组及生理盐水组比较,重组质粒组荷瘤大鼠膀胱质量明显降低(P＜0.01);TUNEL法检测发现各组均出现不同程度的肿瘤细胞凋亡,与空质粒组及生理盐水组比较,重组质粒组凋亡最为显著(P＜0.01);与空质粒组及生理盐水组比较,重组质粒组的荷瘤大鼠膀胱癌肿瘤组织细胞Fas/FasL mRNA及其蛋白表达明显上调(P＜0.05).结论 双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统对大鼠膀胱肿瘤生长有明显抑制作用,可能通过激活Fas/FasL凋亡途径,诱导大鼠膀胱肿瘤细胞的凋亡,从而发挥抑瘤作用     

婴儿双歧杆菌介导HSV-TK/GCV对前列腺癌PC-3细胞裸鼠移植瘤细胞凋亡的影响

目的：研究婴儿双歧杆菌（bifidobacterium infantis,BI）介导单纯疱疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus thymidine ki－nase,HSV-TK）/丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV）自杀基因系统对PC-3细胞裸鼠移植瘤细胞凋亡的影响。方法：采用前列腺癌PC-3细胞悬液皮下注射法建立裸鼠前列腺癌模型,并随机分为4组,每组各12例,分别经尾静脉注射BI-pGEX-TK（重组质粒组）、BI-pGEX-5X-1（空质粒组）、BI（空婴儿双歧杆菌组）和生理盐水（生理盐水组）,联合腹腔注射GCV,4周后,称取裸鼠质量及肿瘤质量。TUNEL法检测各组肿瘤细胞凋亡情况,real-time PCR、Western blot分别检测各组肿瘤组织中Fas、FAP-1、casepase3和casepase8的mRNA 及蛋白表达水平。结果：重组质粒组荷瘤裸鼠体质量明显高于其余3组（F=12.952,P=0.000）,肿瘤组织质量明显降低（F=7.795,P=0.000）;重组质粒组凋亡指数明显高于其他3组（F=45.895,P=0.000）;重组质粒组Fas mRNA（F=70.077,P=0.000）、casepase3 mRNA（F=70.611,P=0.000）和casepase8 mRNA（F=73.781,P=0.000）的表达明显上调,FAP-1 mRNA（F=46.880,P=0.000）的表达明显下调。重组质粒组Fas蛋白（F=664.116,P=0.000）、casepase3蛋白（F=203.090,P=0.000）和casepase8蛋白（F=654.354,P=0.000）的表达明显上调,FAP-1蛋白（F=318.989,P=0.000）的表达明显下调。结论：婴儿双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因系统可能通过影响Fas介导凋亡信号通路,诱导荷瘤裸鼠前列腺癌细胞的凋亡,发挥抑癌作用。     

双歧杆菌粘附素对脂多糖和H2O2调节肠上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究双歧杆菌分泌型粘附素对脂多糖(LPS)和H2O2体外调节肠上皮细胞增殖和凋亡的影响。方法 用^3H-TdR掺入法、流式细胞仪和荧光染色等方法观察肠上皮细胞增殖和凋亡的情况。结果 100μg／L LPS对细胞增殖和凋亡均有促进作用，200μmol/L H2O2可抑制肠上皮细胞增殖，促进凋亡。丫啶橙荧光染色见细胞核染色质致密浓染或裂解成碎片。预先经双歧杆菌分泌型粘附素处理后，LPS组细胞增殖和凋亡率均显著下降，H2O2组细胞凋亡明显减少。结论 在体外，双歧杆菌分泌型粘附素能抑制LPS和H2O2对肠上皮细胞的损害作用，维持肠上皮细胞增殖与凋亡的平衡。     

螺旋藻对双歧杆菌体外生长的促进作用

①目的 观察螺旋藻对双歧杆菌体外生长的促进作用。②方法 在营养贫瘠的培养液中添加不同剂量的螺旋藻，用活菌计数的方法测定不同种双歧杆菌在其中的生长量。③结果 螺旋藻对双歧杆菌的生长有明显的促进作用，但是存在着浓度依赖性和种间差异。④结论 螺旋藻可应用于微生态治疗，也可作为双歧杆菌培养液的营养成分。     

CTP-NPRL2融合蛋白对肾癌原代细胞迁移侵袭能力的抑制及机制研究

目的 将原核表达的氮酶调节因子2(nitrogen permease regulator 2-like,NPRL2)融合蛋白通过胞浆转导肽(cytoplasmic transduction peptide,CTP)转入肾癌原代细胞内,观察其对肾癌原代细胞迁移侵袭的影响,并分析与肾癌上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的关系.方法 胶原酶消化法培养肾癌原代细胞;构建原核表达质粒pET15b-CTP-NPRL2和pET15b-NPRL2,表达融合蛋白CTP-NPRL2和NPRL2,并通过Western blot鉴定目的蛋白的表达.将培养成功的原代细胞分为BLANK组、NPRL2组和CTP-NPRL2组.免疫荧光检测目的蛋白的细胞定位;Transwell迁移侵袭实验检测导入NPRL2蛋白后,对肾癌细胞迁移侵袭能力的影响;Real-time PCR检测Raptor、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纤粘蛋白(Fibronectin) mRNA表达水平;Western blot检测Raptor、E-cadherin、Vimentin、Fibronectin蛋白表达水平.结果 成功培养出肾癌原代细胞并通过鉴定;测序结果及Western blot检测结果显示质粒构建成功并表达出目的蛋白;免疫荧光检测结果显示CTP-NPRL2融合蛋白可以穿过胞膜并定位于胞浆;迁移和侵袭实验显示CTP-NPRL2组肾癌细胞迁移侵袭能力明显下降(P＜0.05);Real-time PCR和Western blot检测结果显示CTP-NPRL2组Raptor、Vimentin与Fibronectin的mRNA、蛋白表达水平与NPRL2组和BLANK组相比明显降低(P＜0.05),而E-cadherin的mRNA、蛋白表达水平与NPRL2组与BLANK组相比明显升高(P＜0.05).结论 NPRL2可能通过与Raptor相互作用影响mTORC1的活性,进而调节EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin、Fibronectin的表达量,影响肾癌细胞的迁移侵袭能力.     

双歧杆菌对2型糖尿病大鼠血浆酪酪肽和胰岛素抵抗的影响

目的观察双歧杆菌对2型糖尿病（T2DM）大鼠血浆酪酪肽（PYY）和胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）的影响。方法30只周龄为9周SD雄性大鼠链脲佐菌素（STZ）造模后,根据双歧杆菌灌胃剂量分成4组:正常对照组（N组）、糖尿病组（T2DM组）、高剂量组和低剂量组,双歧杆菌连续灌胃6周后,测所有大鼠空腹血糖（FBS）,处死后取血浆检测PYY、糖化血红蛋白（HbA1c）、空腹胰岛素（FINS）、血脂,计算HOMA-IR,比较4组大鼠上述指标的差异。结果高剂量组和低剂量组HbA1c、FBS、FINS、HOMA-IR和三酰甘油低于T2DM组（P < 0.01）,但高于N组（P < 0.05~P < 0.01）;高剂量组和低剂量组PYY高于T2DM组（P < 0.01）,但低于N组（P < 0.01）,高剂量组和低剂量组上述指标差异均无统计学意义（P>0.05）,PYY和HOMA-IR呈负相关（r=-0.783,P < 0.01）。结论双歧杆菌可以降低T2DM大鼠HbA1c、FBS、FINS、TG和HOMA-IR,升高PYY。     

双歧杆菌的免疫及抗肿瘤机制实验研究

[目的]比较双歧杆菌及其发酵液的免疫及抗肿瘤作用,探讨其抑瘤作用和相关机制。[方法]观察两种肿瘤细胞荷瘤小鼠的生存期。右腋下荷瘤后,进行病理切片观察。MTT法计算给予不同方法后的抑瘤率,并计算淋巴细胞转化率。流式细胞仪和TUNEL技术检测凋亡情况。制备电镜标本,观察其超微结构。[结果]双歧杆菌能够延长荷瘤小鼠的生存期,病理切片可见大量炎性细胞浸润。流式细胞仪检测发现,死菌液、活菌液作用后肿瘤细胞凋亡率分别(11.36±3.20)%和(8.08±2.00)%为均高于对照组(1.80±0.50)%(P<0.01),TUNEL技术检测,对照组髓过氧化物酶(MPO)染色阳性率(0.8±0.3)%显著低于活菌液组(1.2±0.4)%(P<0.05)。[结论]双歧杆菌死菌液、活菌液在体内外均有较好的抑瘤作用,发酵液并未显示出抑瘤作用,说明双歧杆菌的抗肿瘤作用主要来源于菌体的作用。     

放射线治疗对小鼠肾癌肿瘤坏死因子-α表达的影响

目的:观察放射治疗对BALB/c小鼠肾癌抑制作用及对TNF-α表达的影响.方法:用Renca肾癌细胞制作BALB/c小鼠皮下移植瘤模型,放疗组小鼠在种瘤第12～16天,连续 5d 进行肿瘤局部放射,第28天处死小鼠,取肿瘤组织测量,分析治疗效果.体外培养2×106Renca肾癌细胞,经20Gy X射线单次照射培养24h后,收获细胞.提取细胞和肿瘤组织蛋白,免疫印迹法检测治疗后肿瘤组织和细胞中TNF-α蛋白的表达水平.结果:放射治疗组有效抑制肾癌细胞在BALB/c小鼠体内生长,局部放疗明显增加了肿瘤组织内TNF-α表达水平,体外培养的Renca肾癌细胞经放射线处理后TNF-α表达明显上调.结论:放射线能够促进肿瘤细胞分泌TNF-α,并且与肿瘤局部产生的TNF-α表达上调密切相关.     

抑癌基因TIP30对肾癌细胞系786-0的生长抑制作用

目的：筛选含有外源性TIP30的人肾透明细胞腺癌细胞系786-0,探讨TIP30基因对786-0的生长抑制作用,寻找肾癌基因治疗的潜在靶点。方法：采用RT-PCR技术扩增TIP30基因,构建真核表达载体pcDNA3.1-TIP30,转染786-0细胞,利用RT-PCR及Western blotting检测稳定转染pcDNA3.1-TIP30载体、转染pcDNA3.1(+)空载体及未处理的786-0细胞中TIP30的表达,另通过MTT法检测转染后细胞增殖能力的变化,流式细胞仪测定细胞周期分布的变化。 结果：与未处理的和转染pcDNA3.1(+)的786-0细胞比较,转染pcDNA3.1-TIP30的786-0细胞中TIP30基因的mRNA和蛋白表达水平均明显增加(P<0.05);未处理与转染pcDNA3.1(+)的786-0细胞中TIP30的表达水平比较差异无显著性(P>0.05)。转染pcDNA3.1-TIP30的786-0细胞生长抑制率明显高于未处理的和转染pcDNA3.1(+)的786-0细胞(P<0.01)。流式仪检测细胞周期,与未处理的和转染pcDNA3.1(+)的786-0细胞比较,转染pcDNA3.1-TIP30的786-0细胞G₀-G₁期细胞比例显著增加,S和G₂-M期细胞比例降低(P<0.01)。结论: 786-0细胞能够稳定表达外源基因TIP30;提高肾癌细胞中TIP30蛋白的表达,可抑制肿瘤细胞的生长;TIP30是肾癌基因治疗的潜在靶点。     

Bcl-2及Bag-1基因产物在肾癌组织中的表达及意义

目的：讨论基因Bcl-2和Bag-1在肾癌组织中的表达及相互关系，了解肿瘤增殖与凋亡的特点。方法：采用免疫组化SABC法对41例肾癌与10例正常肾组织的石蜡标本切片对照，进行产物表达的统计研究，结果：Bcl-2在肾癌组织中阳性表达主为75．6％，与正常肾组织30．0％相比，有显著性差异（P＜0．05），但其表达与不同病理细胞类型，病理分级及临床分期无关（P＞0．05），Bag-1在肾癌组织中表达率为61．0％，正常肾组织10．0％，表达，Bag-1与肿瘤分级，分期及预后密切相关（P＜0．05），随肾癌恶性程度增加，其表这强度也增加，Bcl-2与Bag-1的表达正相关（r=0.438）。结论：肾癌组织中Bag-1表达可作为预后指标，Bcl-2可能参与肾组织由良性向恶性转化的过程，但与癌细胞恶性分化程度无关。     

放射治疗对小鼠肾癌移植瘤效应的观察

目的:观察放射治疗对BALB/c小鼠肾癌的抑瘤作用.方法:采用Annexin-Ⅴ-FITC/PI法检测不同剂量放疗后Renca细胞的凋亡率,建立BALB/c小鼠的肾癌细胞移植瘤放射治疗的模型.采用ELISA试剂盒检测小鼠脾淋巴细胞的细胞因子IL-2、IFN-γ分泌水平.结果:①在一定照射剂量范围内,Renca细胞的凋亡率随剂量的增加而升高.②放疗组小鼠移植瘤生长速度较对照组明显减慢.③放疗组小鼠脾细胞分泌IL-2及IFN-γ明显较肿瘤对照组升高.结论:放疗组小鼠肿瘤生长受到明显抑制,与放疗引发的Renca细胞凋亡和小鼠脾细胞分泌IL-2及IFN-γ能力增强有关.     

苦参碱抑制人肾癌细胞系GRC-1细胞株增殖和促凋亡的实验研究

目的观察苦参碱对体外人肾癌细胞系GRC-1细胞株增殖及细胞凋亡的影响,探讨苦参碱诱导GRC-1细胞株凋亡的作用机制。方法应用不同浓度的苦参碱分别作用于人肾癌细胞系GRC-1细胞株24、48、72、96h。采用MTT法观察苦参碱对GRC-1细胞株的细胞毒作用;透射电镜和流式细胞术观察、检测苦参碱诱导的细胞凋亡;免疫细胞化学技术检测苦参碱对GRC-1细胞株Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。结果不同浓度的苦参碱对GRC-1细胞株均有一定的增殖抑制作用,且呈量效和时效关系。苦参碱能明显诱导GRC-1细胞株凋亡。经苦参碱作用后,GRC-1细胞株Bcl-2蛋白表达明显减弱而Bax蛋白表达明显增强。结论苦参碱对体外人肾癌细胞系GRC-1细胞株有一定的增殖抑制作用,其机制可能与调节Bcl-2/Bax蛋白表达比值以诱导细胞凋亡相关。     

气腹对裸鼠腹腔恶性肿瘤细胞种植和生长的影响

目的 :探讨CO2 及N2 气腹对裸鼠腹腔恶性肿瘤细胞种植和生长的影响。 方法 :30只裸鼠分为 3组 ,即开腹组、CO2气腹组、N2 气腹组 ,每组 10只动物。术前 30min每只裸鼠腹腔注入 5× 10 5SHZ88细胞 ,术后 1h、4 8h取 3组裸鼠的前腹膜行透射电镜检查 ,术后 30d处死所有裸鼠 ,打开腹腔对比腹腔生长的肿瘤平均质量。 结果 :CO2 气腹组与N2 气腹组腹膜电镜下表现为间皮细胞变性、间皮细胞间连接断裂、基底膜裸露以及完整性破坏 ,开腹组腹膜的微观结构没有明显改变。术后30d开腹组腹腔生长的肿瘤平均质量为 (0 .736 8± 0 .1895 )g ,CO2 气腹组为 (1.786 1± 0 .0 399)g ,N2 气腹组为 (0 .82 6 0±0 .35 5 9) g ,其中CO2 气腹组腹腔生长的肿瘤平均质量与开腹组和N2 气腹组有显著性区别 (P <0 .0 1) ,开腹组与N2 气腹组腹腔生长的肿瘤的平均质量无显著性差别。 结论 :N2 气腹对裸鼠腹腔恶性肿瘤的生长无明显促进作用 ,CO2 气腹有明显促进作用 ,其主要原因可能在于CO2 气体本身。     

反义p21WAF1/CIP1基因转染对肾癌细胞凋亡抑制作用的影响

目的 探讨p21^WAF1/CIP1基因在顺铂诱导的GRC-1肾癌细胞凋亡过程中的作用。方法 使用脂质体转染方法将正义p21^WAF1/CIP1基因及反义p21^WAF1/CIP1基因基因分别导入GRC-1肾癌细胞系中，对所获转染细胞进行形态学观察和流式细胞仪检测。结果 在正义p21^WAF1/CIP1基因基因转染后GRC-1肾癌细胞中，顺铂诱导细胞凋亡的作用增强；在反义p21^WAF1/CIP1基因基因转染后GRC-1肾癌细胞中，顺铂诱导细胞凋亡的作用受到抑制。结论 在GRC-1肾癌细胞中，顺铂诱导的细胞凋亡至少部分是通过p21^WAF1/CIP1基因基因发挥作用。p21^WAF1/CIP1基因基因作为一个与细胞凋亡的相关基因可能参与肾癌细胞凋亡的调控。     

不同剂量环磷酰胺对裸鼠A549细胞移植瘤凋亡的影响

目的 探讨小剂量环磷酰胺对裸鼠肺腺癌移植瘤凋亡的影响.方法 建立裸鼠人肺腺癌移植瘤模型,不同剂量环磷酰胺干预,测定抑瘤效果和副作用,免疫组化检测NF-κB P65表达,电镜、TUNEL检测肿瘤细胞凋亡情况.结果 小剂量组经环磷酰胺处理后肿瘤体积与大剂量组和对照组相比明显减小;电镜下出现典型凋亡小体,凋亡指数明显增高(P＜0.05)而P65蛋白表达比对照组显著减少(P＜0.05).结论 小剂量环磷酰胺能抑制肺癌移植瘤增长,诱导肿瘤细胞凋亡,可能与下调NF-κB信号传导途径有关.     

促血管生成素-2抑制裸鼠种植瘤生长的研究

目的探讨促血管生成素-2（angiopoietin-2,Ang-2）转染入人宫颈癌Hela细胞后对裸鼠种植性肿瘤生长的抑制作用。方法建立Ang-2转染的Hela细胞株,实验动物随机分为：Ang-2组（A组,n=9）、Hela空白对照组（B组,n=9）、pcDNA3空白质粒对照组（C组,n=9）、Hank′s平衡盐溶液组（D组,n=8）4组,比较各组裸鼠成瘤时间和肿瘤体积。结果A组平均成瘤时间为（9.57±1.05）天,较B组〔（3.85±0.83）天〕和C组〔（4.14±0.90〕天〕明显推迟（P〈0.01）;A组肿瘤体积为（296.72±84.56）mm^3,明显小于B组〔（2 100.36±404.52 mm^3〕和C组〔（1 887.31±355.03）mm^3〕（P〈0.01）。D组无皮下肿瘤形成。结论转染Ang-2的人宫颈癌Hela细胞在裸鼠体内的致瘤力明显降低,肿瘤生长成瘤时间延迟,肿瘤的体积显著减小,表明Ang-2可显著抑制肿瘤生长。