潜伏膜蛋白1基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞中的表达

目的：构建真核细胞中表达潜伏膜蛋白1（LMP1）基因的增强荧光表达载体,观察其在鼻咽癌细胞中的表达。方法：从鼻咽癌C15细胞中获取编码LMP1的cDNA片段,经双酶切亚克隆到pEGFP-C1质粒载体,构建pEGFP-C1-LMP1真核表达载体。重组质粒经双酶切和测序鉴定,利用脂质体介导的方法将pEGFP-C1-LMP1体外瞬时转染鼻咽癌CNE2细胞,激光共聚焦显微镜观察LMP1的表达及其细胞内定位。结果：重组载体经SalⅠ和BglⅡ双酶切后,行琼脂糖凝胶电泳,可见1条与理论预测值一致的目的条带。DNA序列鉴定证实插入片段与GenBank提供的序列一致。将pEGFP-C1-LMP1瞬时转染鼻咽癌细胞株CNE2后,LMP1基因表达产物定位于细胞膜和细胞质中。结论：成功构建LMP1真核表达载体,并可在鼻咽癌CNE2细胞株中表达。     

建立慢病毒介导的miR-145稳定过表达的鼻咽癌细胞株

目的 构建过表达miR-145的慢病毒载体,建立稳定过表达miR-145的鼻咽癌细胞株.方法 构建慢病毒表达质粒pLVTHM/miR-145;293FT细胞进行慢病毒包装,生产的慢病毒感染鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2,经流式细胞仪筛选后,建立稳定表达miR-145的鼻咽癌细胞株;最后应用荧光定量PCR检测病毒感染后鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2中miR-145的表达水平.结果 荧光定量PCR结果和测序验证pLVTHM/miR-145重组质粒构建成功;包装生产的慢病毒感染鼻咽癌细胞CNE1和CNE2后,与阴性对照组比较,其表达水平分别升高4000倍和4500倍.结论 成功构建了pLVTHM/miR-145慢病毒重组质粒,建立稳定表达miR-145的鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2,为研究miR-145在鼻咽癌发生发展过程中的基因调控和相应的作用机制提供了有用的细胞模型.     

表皮生长因子受体对鼻咽癌放疗后细胞增殖的影响

目的:观察表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)对射线照射后的鼻咽癌细胞的增殖的影响。方法:用shRNA-EGFR转染人鼻咽癌细胞系CNE1,应用X射线照射转染EGFRSiRNA前后的细胞,MTT实验比较转染干扰质粒前后照射后细胞增殖变化。结果:shRNA-EGFR成功转染CNE1细胞。CNE1细胞干扰后照射较干扰前照射增殖减低。结论:通过抑制鼻咽癌细胞EGFR的表达,可以抑制鼻咽癌放疗后的增殖。     

可视化鼻咽癌细胞模型CNE2-EGFP的建立

目的利用pEGFP-N1质粒转染鼻咽癌细胞株,建立稳定表达绿色荧光蛋白的鼻咽癌细胞株CNE2-EGFP,为整体鼻咽癌可视化研究提供良好的试验材料。方法利用脂质体转染法,将pEGFP-N1质粒转染鼻咽癌细胞株,通过G418抗性筛选、亚克隆扩增获得GFP稳定表达的人鼻咽癌细胞株CNE2-EGFP。结果成功获得多个稳定表达GFP的人鼻咽癌细胞CNE2-EGFP细胞株,比较CNE2和CNE2-EGFP发现,两者生长曲线、细胞周期分布、裸鼠成瘤能力等均无显著性差异。结论建立了非G418依赖、稳定表达GFP且保持母株细胞特性的人鼻咽癌细胞株CNE2-EGFP,为鼻咽癌整体可视化研究打下了坚实的基础。     

miRNA-135b 对鼻咽癌细胞侵袭 和转移的促进作用

目的 研究miRNA-135b 对鼻咽癌CNE1 细胞系侵袭和转移的影响和作用机制。方法 用逆转录聚 合酶链反应（RT-PCR）检测miRNA-135b 在鼻咽癌CNE1 细胞系中的表达,分别在鼻咽癌CNE1 细胞系中 过表达和下调miRNA-135b,通过微孔滤膜培养小室及双室联合培养系统（Transwell TM）检测肿瘤细胞迁移和 侵袭能力,采用Western blotting 检测大型肿瘤抑制因子同源蛋白2（LATS2）的表达。结果 miRNA-135b 在 鼻咽癌CNE1 细胞系中高表达,通过增强miRNA-135b 表达,鼻咽癌CNE1 细胞的侵袭和转移能力有所提升; 通过靶向miRNA-135b 干扰载体,下调miRNA-135b 表达,鼻咽癌CNE1 细胞的侵袭和转移能力有所下降。 增强miRNA-135b 表达,LATS2 活性和表达下降,而下调miRNA-135b 表达,LATS2 活性和表达上升。结 论 miRNA-135b 过表达会提升鼻咽癌CNE1 细胞的侵袭和转移能力,下调miRNA-135b 表达可有效抑制鼻 咽癌细胞增殖,促进细胞凋亡。miRNA-135b 的表达可能通过影响LATS2 活性影响鼻咽癌细胞的生长。     

慢病毒介导的ebv-miR-BART7稳定过表达鼻咽癌细胞株CNE1的建立

目的构建ebv-miR-BART7慢病毒表达载体,建立其稳定表达的鼻咽癌细胞株CNE1-pLVTHM/BART7。方法构建慢病毒表达质粒pLVTHM/BART7。用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染CNE1细胞。经流式细胞仪筛选后,建立稳定表达ebv-miR-BART7鼻咽癌细胞株。最后用荧光定量PCR检测其表达水平。结果 PCR和测序验证pLVTHM/BART7重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染CNE1细胞后,与阴性对照组和未感染组相比,其表达水平明显升高。结论成功构建了pLVTHM/BART7慢病毒重组质粒,建立了稳定表达ebv-miR-BART7的鼻咽癌细胞株CNE1-pLVTHM/BART7,为研究ebv-miR-BART7在鼻咽癌发生发展过程中的基因调控和相应的作用机制提供了有用的细胞模型。     

过表达DLL3促进人胃癌细胞的增殖

目的构建人全长DLL3的真核表达质粒,并分析上调和下调DLL3对人胃癌细胞增殖的影响。方法采用PCR扩增人全 长DLL3 基因并克隆至真核表达载体pCMV-Tag4中,通过酶切及测序鉴定后,瞬时转染HEK293T细胞,并以转染pCMV-Tag4 质粒和无转染HEK293T细胞分别为阴性对照和空白对照,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western blot鉴定人全长DLL3基因 的表达;进一步通过qRT-PCR和Western blot检测人DLL3在人正常口腔上皮细胞GES-1和AGS等3株胃癌细胞中的表达差异; 当人DLL3/pCMV-Tag4 瞬时转染3 株胃癌细胞后,利用MTT检测DLL3 过表达后胃癌细胞的增殖;同时,特异性人DLL3 siRNA 转染人胃癌细胞MGC803 和MKN45,利用MTT检测DLL3 下调后胃癌细胞的增殖。结果成功构建了人全长DLL3/ pCMV-Tag4重组质粒,转染HEK293T细胞24 h后,qRT-PCR和Western blot表明DLL3在mRNA和蛋白水平上的表达显著高于对 照组;MTT细胞增殖实验显示：过表达DLL3促进胃癌细胞的增殖,下调DLL3后抑制胃癌细胞的增殖。结论成功构建了人全长 DLL3/pCMV-Tag4 真核表达质粒并在HEK293T细胞中获得表达,过表达DLL3促进胃癌细胞的增殖,下调DLL3抑制胃癌细胞的 增殖,本研究为以DLL3为新靶点对胃癌进行靶向治疗提供新思路。     

S100A4真核表达载体构建及对鼻咽癌细胞侵袭转移的影响

目的  构建S100A4稳定高表达的鼻咽癌细胞株,研究S100A4与鼻咽癌侵袭转移关系。方法  PCR方法扩增S100A4片段,将产物插入pCMV载体,将重组质粒及其空白质粒分别转染到鼻咽癌细胞CNE2;MTT法绘制细胞生长曲线,Western blot检测S100A4、E-cadherin、Fibronectin、基质金属蛋白酶2（MMP2）、基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达;Transwell实验检测细胞侵袭转移能力变化。结果  成功构建了S100A4稳定高表达的重组细胞株;细胞生长曲线表明S100A4稳定高表达的重组细胞株生长较快;S100A4稳定高表达的重组细胞株中E-cadherin、Fibronectin低表达而MMP2、MMP9高表达;Transwell实验发现S100A4稳定高表达的重组细胞株的侵袭细胞计数明显高于空白载体转染组和未转染组（P >0.01）。结论  S100A4能调控鼻咽癌上皮-间质转化（EMT）过程,并上调MMP2、MMP9表达而促进鼻咽癌细胞侵袭和转移。

     

慢病毒介导的siRNA靶向干扰EIF4G1鼻咽癌稳定细胞株的建立

目的 检测人真核翻译起始因子4G1(EIF4G1)基因在8株鼻咽癌细胞中的差异表达,寻找最高表达的细胞株.构建EIF4G1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,建立稳定干扰EIF4G1表达的鼻咽癌细胞株,测定干扰效率.方法 应用荧光定量PCR检测EIF4G1 mRNA在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1表达水平.构建重组靶向EIF4G1 shRNA慢病毒表达质粒pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA.用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染5-8F细胞.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的5-8F鼻咽癌细胞株.最后荧光定量PCR检测干扰效率.结果 在8个鼻咽癌细胞株中,EIF4G1显示在5-8F细胞株中表达最高.PCR和测序验证pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未十扰组相比可明显抑制EIF4G1 mRNA水平EIF4G1表达.结论 成功构建TpLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰EIF4G1表达的siRNA5-8F鼻咽癌细胞株.     

EB病毒潜伏膜蛋白LMP2A对人鼻咽癌细胞增殖与迁移特性的影响

目的:制备重组慢病毒载体pLMP2A,并检测其在人鼻咽癌细胞CNE1的表达情况及潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)对人鼻咽癌细胞CNE1增殖?迁移?侵袭的影响?方法:利用DNA重组技术将EB病毒编码的LMP2A基因克隆到慢病毒表达载体plv-GFP中,通过酶切?测序验证,将重组慢病毒载体pLMP2A与包装质粒pdelta-8.91?pVSVG共转染人胚肾上皮细胞株293T,包装重组慢病毒LV-LMP2A,并感染人鼻咽癌细胞CNE1,经单克隆筛选后,用RT-PCR?免疫荧光和Western blot检测LMP2A在人鼻咽癌细胞CNE1的表达,CCK8法检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1增殖的影响,划痕实验?Transwell侵袭实验检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1迁移和侵袭的影响?结果:酶切及测序结果表明,成功制备了重组慢病毒载体pLMP2A;RT-PCR?Western blot?免疫荧光结果显示筛选出的细胞克隆能高表达EBV-LMP2A,CCK8结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1增殖,划痕实验结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1迁移,Transwell侵袭实验结果显示LMP2A能提高人鼻咽癌细胞CNE1侵袭能力?结论:成功制备了慢病毒载体pLMP2A,包装的慢病毒能够成功感染人鼻咽癌细胞系CNE1,使LMP2A基因得以高表达,并发现LMP2A能够促进人鼻咽癌细胞株CNE1增殖?迁移?侵袭,为进一步探讨EB病毒在鼻咽癌中的发病机制及基因治疗奠定了基础?     

SAA 对鼻咽癌 CNE2细胞生物学行为的影响

目的：观察血清淀粉样蛋白 A（SAA）的超表达和抑制表达对鼻咽癌 CNE2细胞生物学行为的影响。方法体外培养 SAA 高表达的 pcDNA3．1（＋）-SAA-CNE2细胞系和干扰 SAA 表达的 pGPU6／GFP／Neo-SAA-CNE2细胞系,两种细胞由课题组前期重组的 SAA 高表达 pcDNA3．1（＋）-SAA 质粒及抑制 SAA 表达的 pGPU6／GFP／Neo-SAA 质粒分别转染构建。流式细胞仪分析以上两种细胞的细胞周期。平皿克隆实验检测细胞的增殖状况。结果流式细胞仪检测细胞周期显示 SAA 表达的增多可促进 CNE2细胞分裂。平皿克隆实验显示 SAA 可使 CEN2细胞的增殖能力增强。结论 SAA 具有促进人鼻咽癌 CNE2细胞增殖和体外迁移浸润的作用。     

α干扰素诱导人鼻咽癌细胞凋亡及其机制探讨

目的:观察α干扰素对鼻咽癌细胞株CNE2的体外生长抑制和诱导凋亡作用,为其在抗肿瘤治疗方面的应用提供理论依据.方法:α干扰素治疗组和未治疗组分别采用免疫印记检测磷酸化AKT和caspase-3蛋白水平、XTT检测癌细胞生长和流式细胞术分析癌细胞凋亡.结果:a干扰素与CNE2细胞株共同培养48 h后,磷酸化AKT蛋白水平明显低于CNE2细胞组,而caspase-3蛋白水平明显高于CNE2组;XTT试验显示a干扰素明显抑制CNE2细胞系的的生长,这种抑制作用呈现时间和浓度依赖性;AnnexinV/PI双染流式细胞检测α干扰素与CNE2细胞系共育48 h后细胞的早期凋亡率23.42％,而对照组的早期凋亡率仅为4.5 ％(P＜0.05).结论:α干扰素诱导鼻咽癌细胞凋亡,从而抑制其体外生长增殖,具有抗肿瘤作用.     

FoxM1通过Wnt/β-catenin信号通路对鼻咽癌细胞5-8F增殖、迁移的影响

目的 探讨FoxM1对鼻咽癌细胞5-8F恶性生物学行为的影响及其可能机制.方法 将化学合成的靶向FoxM1的siRNA转染鼻咽癌细胞5-8F(FoxM1-siRNA组),并设立空白对照组、阴性对照组,采用RT-PCR及Western blot检测FoxM1表达变化.采用MTT法、FCM法、Transwell法分别检测下调FoxM1表达对细胞增殖、周期、凋亡、迁移的影响.Western blot检测下调FoxM1表达后β-catenin、C-Myc、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达变化.结果 转染FoxM1-siRNA的5-8F细胞FoxM1 mRNA和蛋白表达水平降低(P＜0.05).下调FoxM1表达可抑制5-8F细胞增殖(P＜0.05),FoxM1-siRNA组的凋亡率为(22.68±0.67)％,较阴性对照组[(1 1.74±1.36)％]和空白对照组[(10.94±1.52)％]显著增加(P＜0.05),细胞周期阻滞于G0/G1期.FoxM1-siRNA组细胞穿膜数(100.00±10.97)明显低于阴性对照组(246.00±6.66)和空白对照组(233.70±12.41),细胞迁移能力降低(P＜0.05).下调FoxM1的表达可抑制β-catenin细胞核表达,抑制C-Myc、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9总蛋白表达(P＜0.001).结论 FoxM1表达下调抑制鼻咽癌细胞5-8F的增殖,诱导细胞凋亡,降低细胞迁移能力,使细胞周期阻滞于G0/G1期.其机制可能是通过抑制Wnt通路关键蛋白β-catenin细胞核表达从而抑制Wnt 通路活性实现的.     

RNAi沉默Survivin基因抑制人鼻咽癌细胞生长

目的观察RNA干扰沉默Survivin基因对人鼻咽癌CNE2细胞在体内外生长的抑制作用。方法将Survivin特异性shRNA表达载体pGenesil-1-survivin经Lipofectamine。”2000介导转染人鼻咽癌CNE2细胞,经G418筛选获得稳定转染的CNE2细胞,荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞转染效率;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Westernblot分别检测Survivin基因mRNA和蛋白表达水平;噻唑蓝（MTF）法检测细胞增殖能力的变化。以稳定转染细胞建立裸鼠荷瘤模型,观测瘤体积的变化,绘制移植瘤生长曲线。结果流式细胞仪检测pGenesil-1-survivin细胞转染百分率为（87．13±2．21）％;RT．PCR和Westernblot结果显示,pGenesil-1-survivin组对人鼻咽癌CNE2细胞SurvivinmRNA和蛋白的抑制率分别为64．55％和51．24％,均较随机序列构建载体的阴性对照（pGenesil-1-NC）组和空白对照组明显下调（均P〈0．05）;MTT结果显示,pGenesil-1-survivin组细胞增殖能力明显较pGenesil-1-NC组和空白对照组降低（均P〈0．05）;体内实验表明,pGenesil-1-survivin组较pGenesil-1-NC组和空白对照组能有效抑制BALB／C裸鼠人鼻咽癌的生长（均P〈0．05）。结论沉默Survivin基因可以有效抑制人鼻咽癌CNE2细胞在体内外的增殖,Survivin基因有望成为鼻咽癌基因治疗的有效靶点。     

AZD9291通过抑制PI3K-AKT-mTOR通路抑制鼻咽癌细胞的增殖和迁移

目的 探讨AZD9291对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响。方法 体外培养鼻咽癌HNE1和CNE2Z细胞,在HNE1细胞加入浓度分别为0、0.5、1、2、4、8 μmol/L 的AZD9291,CNE2Z细胞加入分别为0、1、2、4、8、16 μmol/L的AZD9291。采用CCK8法检测细胞存活率;集落克隆实验检测AZD9291对细胞的增殖抑制作用;细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞修复和迁移能力;Western blot法检测EGFR相关信号通路蛋白及迁移相关蛋白的表达。结果 CCK8和集落克隆实验结果显示AZD9291可显著抑制HNE1和CNE2Z细胞增殖（P<0.01）;细胞划痕实验和Transwell实验结果显示AZD9291抑制HNE1和CNE2Z细胞迁移能力（P<0.01）;Western blot结果显示,随着浓度增加,AZD9291可通过调控EGFR下游PI3K-AKT-mTOR信号通路磷酸化蛋白的下调（P<0.01）,抑制HNE1和CNE2Z细胞迁移（P<0.01）。结论 AZD9291可通过抑制EGFR/PI3K/AKT/mTOR信号通路,抑制鼻咽癌HNE1和CNE2Z细胞的增殖并降低其修复和迁移能力,为后续AZD9291尝试用于鼻咽癌的治疗提供依据。