TCR Vβ8/pcDNA3.1重组质粒的构建

目的：构建重组质粒TCRVβ8／pcDNA3．1。方法：从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取mRNA，经RT－PCR法获取TCRVβ基因；将表达质粒pcDNA3．1和TCRβ基因行BamHI和HindⅢ双酶切、低熔点胶纯化、连接酶切产物、转化DH5a感受态细菌、筛选菌落和测序鉴定。结果：电泳获得523bp的TCRVβ8预期条带，测序证实为正确的TCRVβ目的基因序列。结论：测是构建TCRVβ8／pcDNA3．1重组质粒的重要步骤。     

pcDNA3.1-HMOX1重组质粒载体的构建与鉴定

目的：构建pcDNA3．1－HMOX1重组质粒载体。方法使用基因合成法合成HMOX1基因,在其N端添加Kozak序列及His标签序列,将扩增后的目的基因双酶切连接至pcDNA3．1载体的BamHⅠ和 NotⅠ之间。转化DH5α大肠杆菌后,挑取阳性克隆子进行质粒抽提电泳及测序鉴定。结果 pCDNA3．1－HMOX1重组质粒经酶切电泳及DNA测序证实,目的基因HMOX1的序列完全正确,重组质粒载体构建成功。结论成功构建pCDNA3．1－HMOX1融合基因并在DH5α大肠杆菌内表达,为进一步探讨HMOX1的生物学功能奠定了基础。     

C-sis基因对大鼠暴发性肝衰竭的抑制作用

目的 探讨C-sis基因对暴发性肝衰竭(FHF)的影响.方法 将重组质粒pcDNA3.1/C-sis注射入鼠尾静脉导入大鼠肝脏,48 h后用内毒素(LPS)联合D-半乳糖胺(D-GalN)处理大鼠建立FHF模型;实验分组:正常对照组,FHF+林格氏液注射组,FHF+空载质粒组,FHF+C-sis质粒组;利用荧光定量PCR和Western blot检测C-sis 的表达;计算实验大鼠的死亡率;利用TUNEL来检测细胞凋亡;检测实验大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量.结果 荧光定量PCR和Western blot结果显示,与正常对照组和FHF+空载质粒组比较,FHF+C-sis质粒组的C-sis mRNA和蛋白表达量明显增加(P均<0.01).在24 h观察期内,正常对照组大鼠均存活,在FHF+林格氏液注射组和FHF+空载质粒组24 h内分别有70.00%和80.00%的大鼠死亡;而FHF+C-sis质粒组在24 h的观察期内死亡率仅20.00%.TUNEL检测结果显示,与空白对照组相比,FHF+林格氏液注射组肝脏组织中细胞凋亡增多(P<0.01);与FHF+空载质粒组相比,FHF+C-sis质粒组肝脏组织中细胞凋亡减少(P<0.01).与正常对照组比较,FHF+林格氏液注射组的ALT(P<0.01)和AST(P<0.05)含量升高;与FHF+空载质粒组比较,FHF+C-sis质粒组的ALT(P<0.01)和AST(P<0.05)含量降低.结论 C-sis基因能抑制LPS联合D-GalN诱导的大鼠FHF.     

pcDNA3.1-preS1-GFP重组质粒构建及其小鼠精子表达

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与乙型肝炎病毒（HBV）preS1基因的重组真核表达载体并观察其在小鼠精子内的表达。方法采用PCR方法 ,以HBV全基因组质粒为模板扩增HBVpreS1基因片段,利用DNA重组技术将其定向插入到含有GFP的真核表达载体pcDNA3.1-GFP,经酶切及测序鉴定后,用脂质体介导法转染小鼠精子,在荧光显微镜下观察并应用PCR技术检测HBVpreS1基因的存在与表达情况。结果成功构建了pcDNA3.1-preS1-GFP真核表达载体,将其转染小鼠精子后,在荧光显微镜下观察到转染精子头部有绿色荧光,PCR扩增得到位于HBVpreS1基因区域内长约589bp的片段。结论重组质粒pcDNA3.1-preS1-GFP的成功建立及其在小鼠精子内的表达,为建立新的HBVDNA垂直传递的小鼠模型奠定了实验基础。     

TCR Vβ8+IL-2/pcDNA3.1亚克隆重组质粒的构建

目的：构建TCRVβ8＋IL－2／pcDNA3．1亚克隆重组质粒。方法：先将TCRVβ8克隆入克隆载体pUC19，分别酶切IL－2pUC19和TCRVβ／pUC19，将IL－2连接到TCRVβ8／pUC19重组质粒上，然后将TCRVβ8＋IL－2基因从TCRVβ8＋IL－2／pUC19重组质上酶切下，克隆入pcDNA3．1表达载体上。结果和结论：经测序正实成功地构建了TCRVβ8＋IL－2/pcDNA3．1亚克隆重组质粒。     

变形链球菌重组质粒pcDNA3-pacA/pcDNA3-pacP免疫定菌鼠的龋齿记分研究

目的　观察已构建的基因重组质粒 pc DNA3- pac A和 pc DNA3- pac P作为防龋疫苗的防龋效果。方法　分别将基因重组质粒 pc DNA3- pac A、pc DNA 3- pac P和 pc DNA3- pac A+pc DNA3- pac P联合使用作为基因疫苗注入免疫定菌鼠颌下腺区皮下 ,以 Keyes龋齿计分法评估免疫后定菌鼠磨牙的患龋情况。结果　重组质粒单独免疫组和联合免疫组大鼠的龋齿计分均明显低于阴性对照组和空白对照组 (P<0 .0 5 ) ;联合免疫组和 pc DNA3-pac A组的龋齿记分均明显低于 pc DNA3- pac P组 (P<0 .0 5 )。结论　重组基因质粒 pc DNA3- pac A和 pc DNA3- pac P均可有效的控制龋损的发生 ,降低龋坏程度 ,有望成为防龋基因疫苗。     

pcDNA3.1/ SjDLC 和pcDNA3.1/mIFN-γ重组质粒构建及表达

目的 构建日本血吸虫动力蛋白轻链DNA疫苗和小鼠干扰素真核表达质粒,研究其在HeLa细胞及动物体内的表达。方法设计特异性引物,PCR扩增获取动力蛋白轻链(SjDLC)与干扰素-γ(IFN-γ)基因,克隆于pcDNA3.1真核质粒,经双酶切及测序鉴定。将两种重组质粒分别转染至HeLa细胞,Western blot鉴定其表达。真核质粒经左腿股四头肌免疫小鼠,在末次免疫2周后,PCR法检测小鼠肌组织内SjDLC和IFN-γ基因,免疫组织化学法检测基因的表达,MTT法检测T细胞增殖水平。结果PCR和双酶切能检测到280 bp的SjDLC基因及480 bp的IFN-γ基因;Western blot显示在12 kDa和19 kDa处有阳性反应条带,与SjDLC和IFN-γ分子量大小一致,两种基因能在HeLa细胞中表达。PCR及免疫组化显示两种基因能在小鼠肌肉组织中存在和表达。MTT法显示两种质粒均能刺激T细胞增殖。结论成功构建pcDNA3.1/SjDLC和pcDNA 3.1/ mIFN-γ真核质粒,两种质粒能在HeLa细胞和动物体内表达。     

阿尔茨海默病pcDNA3.1/APP595/596质粒的构建研究

目的 构建人类阿尔茨海默病淀粉样前体蛋白(APP)真核表达质粒,为深入研究该病发病机制提供基础.方法 从原始质粒克隆模板中,利用PCR方法扩增目的 基因APP695 cDNA,将目的 基因和目的 裁体pcDNA3.1 分别酶切;纯化酶切产物后定向连接,并将其转化细菌感受态细胞,对生长出的克隆行PCR鉴定,PCR鉴定为阳性的克隆送测序并行比对分析.结果 应用DNAStar软件对阳性克隆测序结果与GenBank中APP基因序列比对,证实原序列中的错义突变G已被突变回C,第4位点碱基定点突变完成.结论 成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1/APP595/596,为建立阿尔茨海默病转基因细胞模型奠定基础.     

C-sis对缺氧导致心肌细胞凋亡的抑制作用

目的 探讨C-sis对缺氧诱导心肌细胞凋亡的作用。方法 制备原代小鼠心肌细胞;将心肌细胞分为空白组、缺氧组、缺氧及空载质粒转染组和缺氧及pcDNA3.1/C-sis转染组;将空载质粒及pcDNA3.1/C-sis分别转染缺氧及空载质粒转染组和缺氧及pcDNA3.1/C-sis转染组心肌细胞;对缺氧组、缺氧及空载质粒转染组和缺氧及pcDNA3.1/C-sis转染组心肌细胞进行缺氧处理;倒置显微镜观察各组心肌细胞的搏动频率、异常搏动次数;全自动生化分析仪测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,采用MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白、C-sis蛋白表达水平。结果 与空白组相比,缺氧组心肌细胞搏动频率明显变慢[(99±5)次·min^-1比(159±21)次·min^-1,P<0.01],异常搏动次数明显增多[(16.9±1.4)次·min^-1比(2.4±0.7)次·min^-1,P<0.01],细胞培养液中LDH含量明显升高[(88.27±13.14)U·L...     

PcDNA3.1/hTSHRa重组体的构建

目的:构建重组体pcDNA3.1/hTSHRa。方法:提取人正常甲状腺组织总RNA,逆转录后进行PCR,将纯化的扩增产物hTSHRa与表达载体pcDNA3.1TOPO连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法进行鉴定。结果:PCR扩增得到hTSHR膜外区N端753bp的基因片段hTSHRa。该片段与表达载体pcDNA3.1TOPO连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHRa片段插入序列和方向正确。结论:hTSHRa片段插入真核表达载体pcDNA3.1TOPO,插入序列和插入方向正确,可用于后续基因表达。     

人大肠癌线粒体DNA重组质粒的构建

目的了解大肠癌细胞株（SW480，LoVo，HT29）线粒体DNA的突变，克隆突变的大肠癌线粒体DNA（mtDNA）基因，构建pcDNA3．1（＋）-mtDNA真核表达重组体，并导入NIH3T3细胞，以探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系。方法提取大肠癌细胞株（SW480，LoVo，HT29）mtDNA，扩增D-LOOP区，产物用DNA自动测序法进行序列分析。利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3．1（＋），并用脂质体法导人NIH3T3细胞。结果检测出大肠癌细胞株SW480、LoVo、HT29细胞mtDNAD—LOOP分别有10、9、8个突变位点。成功克隆1119bp的mtDNAD—LOOP区至表达质粒pcDNA3．1（＋），并导入NIH3T3细胞中。结论线粒体DNAD-LOOP区是一个具有高度多态性和突变性的区域，在大肠癌细胞株中突变率较高。     

肾上腺髓质素真核表达质粒的构建及其在大鼠近端肾小管上皮细胞中的表达

目的构建大鼠肾上腺髓质素(ADM)真核表达质粒,观察其在大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)中的表达。方法提取大鼠肾上腺组织总RNA,RT-PCR扩增ADM全长cDNA;将扩增产物连接于pMT-18T载体,双酶切及测序鉴定重组质粒。用限制性内切酶BamHⅠ/EcoRⅠ分别对pMT-18T-ADM和真核表达质粒pcDNA3.1双酶切;将目的基因定向克隆到pcDNA3.1载体上;对重组质粒进行双酶切鉴定。将重组质粒通过脂质体介导转染NRK-52E,RT-PCR检测ADM表达。结果特异扩增出ADM片段,大小为585 bp;片段成功插入pcDNA3.1载体中。RT-PCR方法证明NRK-52E中存在ADM高表达。结论成功构建大鼠ADM真核表达质粒,并将其成功转染NRK-52E。     

决明子乙醇提取物对大鼠急性肝损伤的保护作用

[目的]探讨决明子乙醇提取物对D-氨基半乳糖所致大鼠急性肝损伤的保护作用.[方法]灌胃给予给药组大鼠10,5 g/kg决明子乙醇提取物,阳性对照组大鼠给予0.2 g/kg联苯双酯,正常对照组及模型对照组大鼠给予等体积生理盐水,连续5 d.实验第4日给予模型对照组和给药组大鼠腹腔注射0.5 g/kg D-氨基半乳糖,给予正常对照组大鼠腹腔注射等体积生理盐水.24 h后摘眼球取血,剖取肝组织,制备肝线粒体悬浮液,分别测定血清ALT,AST,SOD,GSH-PX活性及MDA含量,测定肝线粒体SOD,GSH-PX活性及MDA含量.[结果]决明子乙醇提取物可显著抑制D-氨基半乳糖所致急性肝损伤大鼠血清中ALT,AST质量浓度的升高,并提高血清及肝线粒体SOD,GSH-PX活性,降低MDA含量.[结论]决明子乙醇提取物对D-氨基半乳糖所致大鼠急性肝损伤具有保护作用.     

IL-2/pUC19重组质粒的构建

目的：构建IL－2／pU19重组质粒。方法：从PHA刺激的Jurkat细胞中提取mRNA，经RT－PCR法获取IL－2基因；将克隆质粒pUC19和IL－2基因行BamHI和EcoRI双酶切、低熔点胶纯化、连接酶切产物、转化DH5a感受态细菌、筛选菌落和测序鉴定。结果：电泳获得预期的IL－2条带，测序证实为正确的IL－2序列。结论：应用克隆质粒pUC19可方便高效地构建IL－2／pUC19重组质粒。     

人白细胞介素10 cDNA重组质粒在细胞和大鼠体内的转染和表达

目的研究人白细胞介素10（hIL-10）cDNA重组质粒的转染和表达,为以后的基因治疗研究奠定基础。方法构建hIL-10 cDNA真核表达重组质粒pcDNA3-hIL-10后进行酶切和测序鉴定。以SA脂质体介导对照质粒pcDNA3及重组质粒pcDNA3-hIL-10转染COS7细胞和SD大鼠,用ELISA方法检测COS7细胞培养液及大鼠胰腺、肺和肝脏组织中hIL-10的含量。结果用pcDNA3-hIL-10质粒转染COS7细胞48 h后,在培养液中检测到hIL-10蛋白浓度为38 000 pg／mL,而对照组仅为55 pg／mL。hIL-10基因转染24 h后大鼠胰腺、肺和肝脏组织hIL-10的产生量达到峰值,以后逐渐下降,至96 h仍显著高于对照组（P〈0．05）,1周后降至正常水平。结论本研究构建的pcDNA3-hIL-10重组质粒可以在真核细胞及大鼠体内高效表达。     

Smad2/3/4真核表达质粒的构建及重组蛋白表达

目的:构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内表达。方法:以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Smad2/3/4全长编码基因,亚克隆至含有pcDNA3.1myc-HisA 标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293 中,提取细胞蛋白进行 Western blotting 检测。结果：Smad2/3/4 全长基因序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1myc-HisA中,酶切鉴定片段为1 401、1 275和1 656 bp。Western blotting检测到融合蛋白pcDNA3.1myc-HisA- Smad2/3/4的表达。结论:成功构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达。     

骨桥蛋白基因质粒的构建及慢病毒包装的实验研究

目的:构建骨桥蛋白(OPN)基因的重组质粒,并包装慢病毒。方法:从C57BL/6野生型小鼠肾脏组织提取总RNA,逆转录为cDNA经特定引物扩增出OPN基因片段,并大量扩增,利用基因重组技术该基因片段与慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro连接形成重组质粒,该重组质粒转染293T细胞进行慢病毒包装后测定滴度。结果:DNA测序证实提取的基因为OPN片段,慢病毒滴度达2.5×108 TU/ml。结论:成功包装了含有OPN基因片段的慢病毒,为进一步研究OPN对各种细胞的生物学功能的影响奠定了基础。