pIRES2－MLAA34－EGFP穿梭载体的构建及表达

目的：构建pIRES2－MLAA34－EGFP重组质粒,并对其进行原核诱导表达。方法用RT－PCR的方法从U937细胞中提取 MLAA－34基因,利用酶切 T4连接等分子生物学技术将 MLAA－34目的基因克隆至pIRES2－EGFP表达载体中,经PCR 酶切等技术对构建的重组表达载体pIRES2－MLAA34－EGFP进行鉴定后,转化大肠杆菌BL21并进行诱导表达。结果扩增出MLAA－34全长基因1014 bp,构建了pIRES2－MLAA34－EG－FP重组质粒,经PCR和双酶切鉴定,与预期大小一致。重组质粒在大肠杆菌中经IPTG诱导和SDS－PAGE检测,所表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。结论成功构建了pIRES2－MLAA34－EGFP重组质粒,并使其在大肠杆菌中高效表达。     

血吸虫Sj26膜锚定表达DNA疫苗的构建、表达及其免疫原性

目的构建含日本血吸虫相对分子质量为26000的抗原（Sj26GST）基因的膜锚定表达DNA疫苗，观察其免疫BALB／c小鼠后的免疫应答效应。方法用RT—PCR法，以血吸虫成虫RNA为模板，扩增获得Sj26的全长基因。利用重组PCR技术，在Sj26基因的5’端加上编码IL-2的信号肽核苷酸序列，3’端加上编码胎盘碱性磷酸酶的膜锚定序列，然后将其克隆入pIRES载体中，构建一个膜锚定型真核表达质粒pIRES-Sj26。将重组质粒转染HeLa细胞，通过RT—PCR及间接免疫荧光技术检测目的基因的表达。用构建的pIRES-Sj26疫苗肌肉注射免疫BALB／c小鼠后，以ELISA试剂盒检测小鼠血清中的总IgG抗体浓度，脾细胞培养法检测脾淋巴细胞培养上清的干扰素γ（INF-γ）含量，淋巴细胞刺激指数（SI）反映淋巴细胞增殖能力，流式细胞术检测脾细胞CD4／CD8亚群。结果经过酶切鉴定、PCR及测序证实重组质粒pIRES-Sj26构建成功，经转染HeLa细胞及免疫荧光检测证明质粒pIRES-Sj26能在体外进行表达。免疫小鼠后检测结果表明pIRES-Sj26组的血清总IgG抗体浓度、INF-γ的含量明显高于空白对照组和空载体组（均P〈0．01）；其脾SI高于空白对照组和空载体组（P〈0．05）；CD8^＋细胞百分比高于空白对照组和空载体组（均P％0．05），CD4^＋细胞百分比没有显著变化（P〉0．05）。结论成功构建日本血吸虫膜锚定表达DNA疫苗pIRES-Sj26，表达的Sj26蛋白大部分锚定在细胞膜上。pIRES—Sj26疫苗能增强BALB／c小鼠的免疫应答反应。     

编码hsp60和IL-2的幽门螺杆菌减毒沙门菌核酸疫苗

目的:构建含幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)hsp60基因和细胞因子IL-2的核酸疫苗,体外转染COS-7细胞,并鉴定其表达蛋白的免疫原性,体内检测其免疫保护作用.方法:以H. pylori菌株基因组DNA为模板,PCR扩增hsp60基因,从pCIneo-IL-2扩增小鼠IL-2基因,检测hsp60及IL-2的核苷酸序列;通过酶切、连接反应把hsp60和IL-2同时克隆入pIRES;通过脂质体法将pIRES-hsp60-IL-2转染COS-7细胞,SDS-PAGE及Western 印迹法检测表达蛋白的免疫性.重组载体转化入LB5000,抽提质粒,再转化入SL7207,反复传代,鉴定重组核酸疫苗菌的稳定性.以该疫苗菌接种小鼠,4周后H. pylori攻击,再4周后鉴定感染状况.结果:成功扩增出长约1 640 bp的hsp60基因和510 bp的IL-2,测序结果表明扩增出的hsp60基因与H. pylori hsp60序列一致,IL-2序列和小鼠的IL-2序列一致.PCR和酶切鉴定结果证实hsp60和IL-2基因克隆入载体pIRES,成功构建了含hsp60基因和IL-2基因的幽门螺杆菌核酸疫苗pIRES-hsp60-IL-2,并且Western 印迹法检测到相对分子质量为60 000 hsp60蛋白和14 000的IL-2蛋白条带.体内实验显示pIRES-hsp60-IL-2及pIRES-hsp60疫苗接种组分别有79.9%、62.5%小鼠获免疫保护.结论:成功构建了编码hsp60和IL-2基因幽门螺杆菌减毒沙门核酸疫苗,体外实验验证了其免疫原性,体内实验证实其具有免疫保护性.     

IL-2/IFN-γ融合蛋白质粒增强HBV DNA疫苗免疫原性的实验研究

目的 评价IL-2/IFN-y融合蛋白基因质粒(pFP)增强HBVDNA疫苗(pS2.S)免疫原性的佐剂作用.方法 构建IL-2/IFN-y融合蛋白和H.BV包膜中蛋白(PreS2 S)编码基因的重组真核表达质粒,根据pFP编码的目的基因序列分子模拟IL-2/IFN-y融合蛋白的空间结构,检测质粒体外转染细胞表达目的基因产物及其生物活性;体内实验采用提高质粒转染效率的在体电脉冲(EP)技术免疫健康BALB/c小鼠,分别以ELISAT及免疫酶联斑点(ELISPOT)方法检测小鼠血清抗HBs及脾脏HBsAg特异性分泌IFN-γ的淋巴细胞应答水平.结果 pFP能够以融合蛋白的形式正确表达IL-2和IFN-γ,其活性域保持相对独立,其分子模拟的结果得到了质粒体外细胞转染检定实验的证实.EP介导的HBV DNA免疫反应中,pS2.S pFP组血清抗-HBs[(51.2±50.5)mlU/mL,89%]及HBsAg特异性分泌IFN-γ的淋巴细胞应答[(207±103)IFN-rT细胞SFCs/3×105脾细胞,78吲水平和阳性率均显著高于pS2.S pcDNA3.1组[抗-HBs(14.8±7.6)mlU/mL,64%;IFN-γ T细胞(84±70)SFCs/3×105脾细胞,28%(P＜0.05).结论 实验结果提示Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ的融合蛋白基因表达质粒可提高HBV DNA疫苗的免疫效果,并促进初始T细胞向Th1方向分化.     

胶质瘤碱性蛋白iRNA激活的小鼠脾细胞中c-myc,IL-2和IFN-γ基因的表达

作者采用分子杂交技术观察了经胶质瘤碱性蛋白iRNA激活的小鼠脾淋巴细胞中c-myc,IL-2和IFN-γ基因mRNA水平的动态变化.结果表明,iRNA能在相应抗原存在下激活小鼠脾淋巴细胞表达c-myc,IL-2和IFN-γ基因;c-myc基因在细胞刺激后3-6 h表达最高.IL-2和IFN-γ基因在细胞刺激后12 h表达最高.     

Flk1胞外1-3区基因的克隆及核酸疫苗的构建

目的 :克隆并构建小鼠 Flk1胞外 1 - 3区核酸疫苗 ,并检验疫苗引起特异性免疫反应的能力。方法 :RT- PCR克隆 Flk1胞外 1 - 3区 ,构建核酸疫苗 pc DNA3.1 ( + ) -Flk1 Domain1 - 3,脂质体转染 COS7细胞 ,western- bolt检测表达 ;疫苗免疫小鼠 ;以小鼠血管内皮细胞为靶细胞 ,以免疫的小鼠脾细胞作为效应细胞 ,采用标准 4h51Cr释放法计算 CTL特异性杀伤率。结果 :扩增出 1 2 5 2 bp片段。疫苗 DNA自动测序证明所获基因片段序列阅读框架正确。Western- blot检测转染疫苗的 COS7细胞显示细胞中有分子质量为 44k Da的蛋白表达 ;疫苗组与对照组比较 ,CTL杀伤率差异有显著性。结论 :pc DNA3.1 ( + ) Flk1 -Domain1 - 3核酸疫苗可有效的引起针对 Flk1的免疫反应。     

小鼠IFN-γ基因佐剂对分泌型柯萨奇病毒B3 VP1核酸疫苗免疫作用的影响

目的: 构建小鼠IFN-γ真核表达质粒,观察其对分泌型柯萨奇病毒B3(CVB3)核酸疫苗的影响. 方法: 以RT-PCR扩增小鼠IFN-γ基因,构建真核表达重组质粒pcDNA3/mIFN-γ,检测其在cos-7细胞内的表达;将分泌型pcDNA3/sVP1, pcDNA3/sVP1 pcDNA3/mIFN-γ肌注免疫小鼠,每2 wk注射1次,共3次,每次免疫后13 d取血测血清抗体水平. 末次免疫后2 wk,以500 TCID50的CVB3腹腔内感染,观察小鼠的存活情况. 结果: 成功构建了pcDNA3/mIFN-γ并能有效表达;pcDNA3/sVP1组和pcDNA3/sVP1 pcDNA3/mIFN-γ组均能诱导小鼠产生中和抗体,抗体滴度随免疫次数的增加而提高,但两组小鼠抗体滴度和生存率无显著性差异;混合质粒注射组血清的病毒滴度明显低于pcDNA3/sVP1组,且心肌病理损伤明显减轻. 结论: IFN-γ作为基因佐剂,在一定程度上增强了分泌型 CVB3 VP1基因疫苗的免疫保护作用.     

ESAT6抗原DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答

目的:构建结核杆菌ESAT6抗原DNA疫苗,并观察其在BALB/c小鼠体内诱导的免疫应答.方法:构建结核杆菌ESAT6抗原DNA疫苗pVAX-ESAT6,并将其肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,用ELISA方法检测小鼠的血清抗体(IgG、IgG2a/IgG1)水平,并在体外用特异抗原刺激小鼠脾细胞,检测其分泌细胞因子(IFN-γ、IL-4)的水平;用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定小鼠细胞毒性T淋巴细胞反应.结果:pVAX-ESAT6 DNA疫苗诱导了抗原特异的体液免疫应答和细胞免疫应答,抗体亚型检测显示IgG2a与IgG1的比值为(2.28±0.4),脾细胞分泌的细胞因子水平检测显示IFN-γ的水平(360士45 Pg/ml)高于IL-4的水平(124±16 Pg/m).结论:成功地构建了pVAX-ESAT6 DNA疫苗,它能在小鼠中诱导抗原特异的免疫应答,应答类型以Th1型占优势.     

融合基因GM-CSF/IL-2转基因瘤苗在肝癌特异性免疫治疗中的应用

目的 制备人白细胞介素2(hIL-2)与鼠粒-单核细胞集落刺激因子(mGM-CSF)融合基因修饰的H22肝癌全细胞瘤苗,探索融合基因GM.CSF/IL-2转基因瘤苗,在肝癌主动免疫治疗中特异性抗肿瘤作用.方法 用含hlL-2与mGM-CSF融合基因的真核表达载体在体外转染H22肝癌细胞,制成疫苗,皮下接种Balb/c小鼠,同时建立Balb/c小鼠荷瘤模型,ELISA法检测H22/pcDNA3.1( ).GM-CSF/IL-2瘤苗免疫组小鼠与各对照组小鼠(分别接种H22/pcDNA3.1( )瘤苗、H22瘤苗、PBS)血清中IL-10、IFN- γ水平,观察小鼠存活期;同时用51Cγ释放法测定H22/pcDNA3.1( )-GM-CSF/IL-2瘤苗免疫组小鼠与各对照组小鼠(单纯荷瘤组、正常组)脾细胞对亲本H22肝癌细胞的杀伤活性.结果 成功制备了含有hIL2与mGM-CSF融合基因的H22肝癌瘤苗,转基因瘤苗免疫组小鼠的脾细胞在体外对亲本H22肝癌细胞的杀伤率为38.3%,显著高于对照组小鼠的脾细胞对亲本H22肝癌细胞的杀伤率(分别为13.6%和7.5%),也高于其对S180细胞的杀伤率(9.1%)(P＜0.05).转基因瘤苗免疫组小鼠血清IFN-γ较对照组明显升高(P＜0.01),血清IL-10较对照组明显降低(P＜0.01).同时,转基因瘤苗免疫组小鼠生存期亦有明显延长.结论 转染hIL-2与mGM-CSF融合基因的同系肿瘤细胞瘤苗可激发特异性细胞介导的免疫反应,改善抗肿瘤免疫反应,延长荷瘤小鼠生存期.     

IL-15对体外培养的DC致敏的T淋巴细胞的作用研究

目的 通过与IL-2进行比较,观察IL-15激活T细胞反应,增强DC细胞疫苗抗肿瘤的免疫反应.方法 将骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）皮下注射小鼠作为初次免疫,14d后取小鼠脾脏,制备淋巴细胞,与细胞因子（IL-2、IL-15）和BMDCs共同培养作为再次免疫,产生细胞毒T淋巴细胞（CTL）.流式细胞术检测细胞因子（IL-2或IL-15）联合BMDCs刺激小鼠淋巴细胞CD62L、CD69、CD44的表达情况;采用Cr51释放实验检测CTL对Levis肺癌细胞的杀伤作用;采用酶联免疫斑点实验（ELISPOT）检测分泌干扰素γ（IFN-γ）细胞亚群比例.结果 IL-15联合BMDCs疫苗上调CD8＋T细胞表达CD69＋、CD44＋,增强对肿瘤细胞的杀伤活性,并能产生更多的IFN-γ分泌细胞.结论 IL-15可能较IL-2更能增强DC疫苗抗肿瘤的免疫反应,为IL-15和DC疫苗的联合免疫治疗提供重要的试验依据和临床前研究的理论基础.     

NY-ESO-1和热休克蛋白70融合基因的构建和原核表达

目的 构建热休克蛋白(HSP)70和肿瘤睾丸抗原NY-ESO-1融合基因,并在大肠杆菌中诱导表达. 方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从人肝癌细胞株HepG2扩增HSP70基因,测序后插入pGEX-ESO1质粒中,构建NY-ESO-1与HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-ESO1-HSP70,IPTG诱导含有该质粒的大肠杆菌BL21(DE3)表达目的蛋白,Western blot 鉴定蛋白的特异性. 结果 扩增得到长度为1 917 bp的人HSP70全长基因,测序结果表明与GenBank公布的序列一致;获得pGEX-ESO1-HSP70融合基因原核表达质粒,经IPTG诱导,在BL21(DE3)中表达分子量约106 kD的融合蛋白(包括GST 26 kD,NY-ESO1 10 kD,HSP70 70 kD),Western blot检测该蛋白可与HSP70特异性结合. 结论 成功构建pGEX-ESO1-HSP70重组表达质粒,并获得高效表达的ESO1-HSP70融合蛋白,为HSP70-多肽疫苗在肿瘤免疫治疗中的作用奠定基础.     

结核分枝杆菌Ag85B与IL-2基因双顺反子真核表达质粒的构建及体外表达

目的:构建结核分枝杆菌Ag85B与白细胞介素2(IL-2)双顺反子真核表达质粒。方法:以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR扩增出Ag85B基因。采用亚克隆的技术从pcDNA3.1-IL-2中获得小鼠IL-2基因的cDNA片段。将两者分别定向插入真核双表达载体pIRES,构建表达两个目基因的双顺反子重组质粒,然后用脂质体包裹体外转染A549细胞,RT-PCR检测Ag85B及IL-2的表达。结果:酶切分析及序列测定证实重组质粒构建正确;该重组质粒能在体外表达Ag85B及IL-2 mRNA。结论:成功构建了结核杆菌Ag85B及IL-2基因双顺反子真核表达质粒,为进一步在整体动物水平的实验研究奠定了基础。     

白细胞介素37对宫颈癌HeLa细胞顺铂化疗敏感性的增强作用

目的：通过将白细胞介素37（IL-37）基因转染到宫颈癌HeLa细胞中,探讨IL-37对宫颈癌细胞的杀伤作用及其对宫颈癌细胞化疗敏感性的增强作用。方法：将重组pIRES2-EGFP/IL-37质粒（IL-37组）和pIRES2-EGFP质粒（NC组）分别转染到HeLa细胞。Q-PCR和Western blotting法检测IL-37基因和蛋白表达水平;CCK8法检测NC组、IL-37组、顺铂（DDP）组及IL-37+DDP组细胞活性,计算细胞抑制率;RT-PCR法检测信号转导和转录激活因子3（STAT3）及细胞周期蛋白D1（Cyclin D1） mRNA表达水平。结果：与NC组比较,IL-37组IL-37 mRNA和蛋白表达水平明显升高（P < 0.01）。给药后24~72 h,5~15 mg·L^-1 DDP组HeLa细胞活性受到明显抑制（P < 0.01）;与DDP组比较,IL-37+DDP组HeLa细胞抑制率在处理后48 h内明显升高（P < 0.05）;与IL-37组比较,IL-37+DDP组HeLa细胞抑制率在处理后96 h内均有升高（P < 0.05）。与NC组比较,IL-37组STAT3和Cyclin D1 mRNA表达水平明显下降（P < 0.01）。结论：IL-37高表达可抑制宫颈癌细胞的增殖,并能增强DDP对宫颈癌细胞的放疗效果,这种效应的发挥可能与IL-37使STAT3和Cyclin D1表达下调有关。     

前列腺特异性膜抗原、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子双顺反子DNA疫苗的构建及其免疫活性的测定

目的:构建前列腺特异性膜抗原(PSMA)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)核酸疫苗并测定其免疫活性.方法:应用DNA疫苗载体pIRES构建pIRES-PSMA-mGM-CSF、pIRES-PSMA、pIRES-mGM-CSF重组质粒,酶切鉴定正确后与pIRES空质粒分别免疫C56BL/6小鼠(每组15只),LDH释放试验测定各自免疫后小鼠的特异性细胞毒性T细胞(CTL)杀伤活性.结果:成功构建上述重组质粒;pIRES-PSMA-mGM-CSF免疫后小鼠特异杀伤率最高,pIRES-PSMA、pIRES-mGM-CSF次之,pIRES空质粒最差(P＜0.05),各组杀伤效果以效靶比为101时最高.结论:PSMA及mGM-CSF双顺反子DNA疫苗有望在前列腺癌的基因治疗中发挥积极的作用.     

脂质体法介导pIRES2-EGFP-hVEGF165转染人胎盘源间充质干细胞

目的：构建人血管内皮生长因子165（hVEGF165）的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165,通过脂质体法将其转入人胎盘源间充质干细胞(HPMSCs)中,鉴定hVEGF165的表达活性及携带目的基因的HPMSCs的多向分化潜能。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 技术,从人白血病细胞HL-60中扩增出hVEGF165的基因片段,构建pIRES2-EGFP-hVEGF165 重组质粒,经酶切检测其构建的正确性,通过脂质体法转染HPMSCs后分别采用RT-PCR、Western blotting 法及MTT法检测其转录和表达活性;荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP),检测含有报告基因EGFP空载体及携带报告基因和目的基因的真核表达载体转染靶细胞的情况;并再次鉴定转染后HPMSCs的多向分化潜能。结果：成功构建重组质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165;RT-PCR、Western blotting及MTT法检测表明,构建的质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165具有转录及表达活性;绿色荧光显微镜下观察到EGFP表达,目的基因成功转入靶细胞,携带目的基因的HPMSCs仍保持多向分化潜能。结论：成功构建具有表达活性的hVEGF165真核表达质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165,hVEGF165在HPMSCs中具有转录及表达活性,且对HPMSCs的增殖具有促进作用;HPMSCs本身可能具有hVEGF165的内分泌功能。     

Immune response induced by HPV18 E2 DNA vaccine combined with IL-12

Objective:To study the effectiveness of human papillomavirus type 18 E2 gene (HPV18-E2) vaccine and interleukin-12(IL-12) on their immune effects. Methods:Thirty-five Balb/c female mice aged 6-8-week-old were randomly divided into five groups (each n =7).The mice were given instramuscular injection of DNA vaccines at 2-week four 4 times(100mg/time).The tails were cut to draw blood at the 0,2,4,6 weeks,and then the mice were executed by eyeball blood letting at 8 weeks.ELISA was used for the quantitative detection of the specific lgG antibody in the srea of Balb/c mice and the cytokine IFN-γ and IL-4 in mice MTT assay.Results: after 8 weeks immunization, antibody IgA in E2 vaccine group andE2 +IL-12 vaccine group was statistically increased as compared with that of control group, and the difference was statistically significant (P<0.01). IFN-γand IL-4 levels of mice spleen lymphocyte culture supernatant inE2 group and E2 + IL-12 were significantly higher than other control groups (P<0.01). the spleen lymphopoiesis activeness of E2 + IL-12 group was significant enhanced as compared with the E2 group, there were statistically significant differences (P<0.01) . Conclusions: E2 DNA vaccine combined with IL-12 immune mice can effectively induce cell-mediated immunity and humoral immune responses, their capabilities of inducing immune response might be more stronger than that of single one.     

结核杆菌多价核酸疫苗的构建及其免疫原性的初步研究

目的构建包含结核杆菌3种抗原蛋白Ag85A、ESAT-6和CFP-10真核表达质粒的多价DNA疫苗,并对其在小鼠体内的免疫原性进行初步分析。方法PCR扩增获得结核杆菌ag85 a、esat-6和cfp-10基因片段,分别克隆入真核表达质粒VR1020的BamHⅠ位点构建DNA疫苗,以此多价DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内的特异性抗体应答和细胞免疫反应,并与BCG免疫组、质粒VR1020免疫组和生理盐水对照组相比较。结果多价DNA疫苗免疫小鼠后能产生特异性的细胞和体液免疫应答,DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞IFN-γ的表达量显著高于BCG免疫组,而DNA疫苗免疫组小鼠所产生的特异性抗体水平低于BCG免疫组。结论成功构建了结核杆菌多价DNA疫苗,免疫小鼠后检测到特异性细胞和体液免疫应答。     

干扰素β1a基因真核表达质粒的构建和表达

目的：构建干扰素β1a(IFN-β1a)的CHO表达体系，探讨人IFN-β1a在真核细胞中的表达效果。方法：采用全基因合成法获取重组人IFN-β1a基因，并通过点突变将IFN-β1a的17位半胱氨酸进行修饰，合成的基因经PCR扩增，连接入 pSV2-dhfr 质粒中，构建重组真核表达质粒 pSV2-dhfr-IFN-β1a。将质粒转染至 CHO-dhfr－细胞中，经 MTX 加压筛选，获得稳定生长的能够持续表达IFN-β1a的单克隆细胞株；提取细胞基因组DNA，进行PCR 鉴定。收集细胞培养上清液，采用 Wish 细胞病变抑制法检测转染细胞中 IFN-β1a的抗病毒活性。结果：重组真核表达质粒 pSV2-dhfr -IFN-β1a 经 PCR 及双酶切鉴定证明构建正确；以转染细胞基因组 DNA 为模板，可扩增出 IFN-β1a 基因；转染后重组细胞表达的 IFN-β1a具有抗病毒活性，达到3×105 IU·mL^－1。结论：IFN-β1a基因真核表达质粒构建成功，并在 CHO 细胞中成功表达了具有较高生物学活性的 IFN-β1a 蛋白。