pIRES2－MLAA34－EGFP穿梭载体的构建及表达

目的：构建pIRES2－MLAA34－EGFP重组质粒,并对其进行原核诱导表达。方法用RT－PCR的方法从U937细胞中提取 MLAA－34基因,利用酶切 T4连接等分子生物学技术将 MLAA－34目的基因克隆至pIRES2－EGFP表达载体中,经PCR 酶切等技术对构建的重组表达载体pIRES2－MLAA34－EGFP进行鉴定后,转化大肠杆菌BL21并进行诱导表达。结果扩增出MLAA－34全长基因1014 bp,构建了pIRES2－MLAA34－EG－FP重组质粒,经PCR和双酶切鉴定,与预期大小一致。重组质粒在大肠杆菌中经IPTG诱导和SDS－PAGE检测,所表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。结论成功构建了pIRES2－MLAA34－EGFP重组质粒,并使其在大肠杆菌中高效表达。     

新抗原基因MLAA-34在急性单核细胞白血病患者的表达及意义

目的探讨白血病新肿瘤抗原基因MLAA-34在急性单核细胞白血病(AML-M5)初诊患者中的表达水平,分析其与临床特征及预后的关系。方法采用基于TaqMan探针的实时荧光定量RT-PCR方法检测MLAA-34在35例AML-M5患者、40例非AML-M5急性髓细胞白血病患者、12例非白血病的血液疾病患者骨髓标本以及10例健康志愿者(正常对照)外周血单个核细胞中的表达水平并进行比较。结果初治AML-M5患者MLAA-34 mRNA表达水平较正常对照、非AML-M5白血病及非白血病疾病患者明显增高(P<0.05);完全缓解的M5患者MLAA-34 mRNA表达水平较治疗前明显下降(P<0.05),复发的M5患者MLAA-34 mRNA表达水平再次增高;对8例复发的AML-M5患者进行MLAA-34基因表达水平动态监测,发现复发前MLAA-34基因表达水平有上升趋势。结论 MLAA-34基因的过表达参与了急性单核细胞白血病的发病,在AML-M5中的表达具有较高的特异性,动态监测其表达水平在AML-M5的疗效评估、预后判断及复发预测方面具有一定的临床意义。     

结核分支杆菌Ag85A/hsp70嵌合DNA疫苗的免疫效应研究

目的:比较不同疫苗的免疫效应.方法:昆明鼠50只随机分为5组,即生理盐水组,neo组,BCG组,hsp70与Ag85A联合组,Ag85A/hsp70组,每组10只.两次加强免疫后,检测小鼠血清γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素2(IL-2)的水平.结果:测得各组IFN-γ依次为:471.5±76.8pg/ml、574.4±48.5pg/ml、630.0±60.5pg/ml、815.8±119.4pg/ml、822.8±106.7pg/ml;测得各组IL-2依次为:37.5±5.4pg/ml、39.0±7.9pg/ml、49.3±8.2pg/ml、58.8±14.1pg/ml、73.5±17.6pg/ml.嵌合DNA疫苗组与前4组比较有显著性差异(P<0.01).联合免疫组与BCG组也有显著性差异(P<0.01).结论:Ag85A/hsp70嵌合DNA疫苗能刺激更多的免疫活性细胞,免疫效应最强.编码不同抗原基因的多个质粒联合免疫与BCG免疫相比免疫效应更强,也具有较高的免疫保护性.     

人急性白血病淋巴细胞HSP70及 HSP70 mRNA的表达研究

目的：检测急性白血病病人血淋巴细胞热休克蛋白70（HSP70）及其mRNA的表达。方法：ELISA法检测HSP70,RT－PCR法检测HSP70 mRNA。结果：化疗前急性白血病病人淋巴细胞HSP70及mRNA明显低于正常人;而化疗后,急性白血病病人淋巴细胞HSP70及mRNA明显高于正常人（P＜0．01）,结论：HSP70与急性白血病癌细胞关系密切,对癌细胞起保护作用。     

热休克蛋白70-Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D DNA疫苗的构建及表达

目的：针对Ⅱ型单纯疱疹病毒（HSV-2）包膜糖蛋白D（gD）,以热休克蛋白70（Hsp70）为载体,构建pVAX-Hsp70-HSV2gD DNA疫苗。方法：将Hsp70和HSV-2gD蛋白的基因分别克隆至真核表达载体pVAX,构建成重组质粒pVAX-Hsp70-gD并测序鉴定。重组质粒pVAX-Hsp70-gD转染COS-7细胞,用免疫组化、SDS-PAGE和West-ern blotting方法鉴定重组质粒的表达情况。结果：测序证实重组质粒序列正确,表达产物的SDS-PAGE分析发现,在相对分子量为92 000处有外源蛋白表达,与预期蛋白带一致。免疫组化方法和Western blotting也证明,构建的重组质粒能在COS-7细胞内表达。pVAX-Hsp70-HSV2gD组核酸疫苗免疫的小鼠,其脾淋巴细胞培养上清中γ-干扰素的水平高于其他组（P〈0.05）。结论：成功构建了pVAX-Hsp70-HSV2gD DNA疫苗,为其进一步的研究打下了基础。     

真核双表达载体pIRES-CEA-HSP70的构建与鉴定

目的 构建癌胚抗原（CEA）与热休克蛋白70（HSP70）的真核双表达质粒，并检测其在体外的表达。方法 从结肠癌及正常肝组织中经RT-PCR扩增获得CEA及HSP70 cDNA，并将其定向克隆至真核双表达质粒pIRES中，重组质粒pIRES-CEA及pIRES-CEA-HSP70，经酶切及测序鉴定后，分别转染仓鼠卵巢细胞（CHO）；经RT-PCR及ELISA法检测，CEA和HSP70在CHO细胞中得到有效表达。结果 真核双表达载体pIRES-CEA-HSP70构建成功且CEA和HSP70在CHO细胞中得到有效表达。结论 真核表达载体pIRES-CEA-HSP70的成功构建为治疗CEA阳性肿瘤提供一定的实验基础。     

HPV16嵌合型疫苗的构建及其免疫效应初探

目的 构建以碳末端锌指结构突变的E7基因为基础，融合HSP70的嵌合型DNA疫苗，检测其诱导的特异性T淋巴细胞增殖活性，初步评价此疫苗对HPV相关肿瘤的治疗作用。方法 利用PCR法定点突变E7基因碳末端的锌指结构，以其为基础融合热休克蛋白70，克隆入pcDNA．3．1-质粒构建嵌合型DNA疫苗。DNA测序，确认E7基因突变位点及DNA疫苗阅读框架。用脂质体法将pcd—E7-HSP转染A549细胞，经G418筛选后，提取RNA，RT—PCR检测E7基因表达。DNA疫苗免疫C57BL6小鼠。取其脾细胞与E7蛋白在体外共同培育，MTT法检测T淋巴细胞增殖活性。结果 E7基因突变位点及阅读框架均正确，E7基因可检测到表达。疫苗免疫后C57BL/6小鼠脾细胞增殖活跃。结论：E7基因锌指结构的突变及融合HSP70能够诱导特异性的细胞免疫应答。     

热休克蛋白70减轻大鼠急性坏死性胰腺炎机制的实验研究

目的 探讨热休克蛋白70减轻大鼠急性坏死性胰腺炎的机制.方法 80只SD大鼠随机分为4组,急性坏死性胰腺炎模型组（A）、假手术组（B）、温生理盐水腹腔灌洗预处理后急性坏死性胰腺炎（ANP）组（C）和温生理盐水腹腔灌洗和丝裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）抑制剂（SB202190）预处理后ANP组（D）,ANP模型由5%牛黄胆酸钠大鼠胰胆管逆行注射诱发而成.C组使用温生理盐水持续腹腔灌洗30 min,10 h后造ANP模型;D组在使用温生理盐水腹腔冲洗后,立刻行SB202190（10 mg/kg）腹腔注射,10 h后制造ANP模型.ANP术后6 h处死大鼠,检查各组大鼠血清细胞因子IL-6、TNF-α和IL-8;血清淀粉酶;取胰腺组织行病理检查,并使用PCR方法检测胰腺中热休克蛋白70（HSP70）/p38-MAPK的表达.结果 SB202190预处理组大鼠血清淀粉酶[（1779.77±84.90）U/L]和温生理盐水腹腔灌洗预处理组[（2845.70＆#177;204.78）U/L]明显低于ANP组[（4064.93±188.97）U/L,P＜0.05],但高于假手术组[（1221.47±54.58）U/L,P＜0.05];SB202190预处理组低于温生理盐水腹腔灌洗预处理组（t＝3.329,P＜0.05）.SB202190预处理组和温生理盐水腹腔灌洗预处理组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8明显低于ANP组（P＜0.05）,但高于假手术组（P＜0.05）;SB202190预处理组低于温生理盐水腹腔灌洗预处理组（P＜0.05）.SB202190预处理组和温生理盐水腹腔灌洗预处理组胰腺组织p38MAPK mRNA含量明显低于ANP组（P＜0.05）,温生理盐水腹腔灌洗预处理组高于假手术组（P＜0.05）;SB202190预处理组低于温生理盐水腹腔灌洗预处理组（P＜0.05）.结论 HSP70可以通过调控p38MAPK从而下调细胞因子的表达,进而改善大鼠ANP病理生理.     

人急性白血病淋巴细胞HSP70及HSP70mRNA的表达研究

目的　检测急性白血病病人血淋巴细胞热休克蛋白 70 (HSP70 )及其mRNA的表达。方法　ELISA法检测HSP70 ,RT -PCR法检测HSP70mRNA。结果　化疗前急性白血病病人淋巴细胞HSP70及mRNA明显低于正常人。化疗后 ,急性白血病病人淋巴细胞HSP70及mRNA明显高于正常人。结论　HSP70与急性白血病癌细胞关系密切 ,对癌细胞起保护作用     

热休克蛋白70重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建人热休克蛋白70(HSP70)的腺病毒表达载体,为进一步研究HSP70对应激状态下细胞的保护作用提供实验基础.方法 采用AdEasy系统构建携带外源性HSP70编码基因的重组腺病毒载体pAd-HSP70,脂质体法转染人胚肾293细胞,包装产生重组腺病毒vAdvHSP.收获病毒进行滴度鉴定, RT-PCR方法检测目的 基因在Hela细胞的转录表达.结果 PCR、序列测定以及限制性酶切证实HSP70基因正确插入腺病毒表达载体,并在HEK293细胞中包装出重组腺病毒;荧光显微镜下可观察到GFP的表达,收获病毒的滴度为3.2×1012 U/L.结论 成功构建pAd-HSP70重组腺病毒表达载体,且重组腺病毒在Hela细胞能有效转录.     

日本血吸虫SjC23-Hsp70 DNA 疫苗与IL-12对水牛保护性作用的研究

目的:研究日本血吸虫中国大陆株23 kD 膜蛋白-热休克蛋白(SjC23-Hsp70)DNA 疫苗联合佐剂白细胞介素12(IL-12) 质粒DNA 对水牛的免疫保护作用。方法:将血吸虫病非流行区8~10 月龄健康水牛45 头随机分为A组(SjC23-Hsp70+IL-12)、B 组(SjC23+IL-12) 和C 组(pVAX+IL-12),每组15 头。每头牛经肩部肌注免疫3 次,每次间隔28 d。末次免疫后28 d,每头牛感染日本血吸虫尾蚴1000 条。解剖前2 天及当天分别收集粪便1 次,用定量法检测虫卵和毛蚴数。攻击感染后56 天解剖所有水牛,经胸主动脉灌冲法收集成虫,计数成虫数,检测每克肝组织虫卵数。结果:A,B 组与C 组相比,分别获得45.70%和26.61%的减雌率,44.51%和25.84%的减虫率,41.10%和31.63%的减粪卵率,48.11%和38.07%的减毛蚴率及43.39%和31.95%的减肝卵率。A 组的5 个率均比B 组高(P<0.05)。结论:用SjC23-Hsp70 DNA 疫苗和IL-12 联合免疫水牛可获得明显的免疫保护作用。     

SARS相关冠状病毒M基因片段的克隆及其DNA疫苗诱导的体液免疫

目的：构建含有SARS相关冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS—CoV)M基因片段的核酸疫苗，观察其免疫小鼠后病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的M基因片段克隆到核酸疫苗真核表达载体pVAX1中，免疫小鼠后，用SARS—CoV抗体ELISA检测试剂盒定期检测免疫小鼠血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：构建了重组核酸疫苗质粒pVCo—M，免疫小鼠后可诱导产生出病毒特异性抗体。结论：以M为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体，为进一步改进或探索同类DNA疫苗提供有益启示。     

HCMV pp65 DNA疫苗诱导小鼠的细胞免疫应答

目的　构建含HCMV pp65336～ 50 7位氨基酸的重组真核表达质粒 pcDNA3 1 pp65作为HCMVpp65基因疫苗 ,观察其诱导小鼠的细胞免疫应答情况。方法　以 6～ 8周龄♀Balb/c小鼠为动物模型 ,试验组和对照组各 6只。试验组于股四头肌注射pp65DNA疫苗 ,对照组注射空载体pcDNA3 1。 2组小鼠分别在 0d、5d、3周注射该DNA疫苗 2 0 0μg。在末次免疫后 3d ,无菌取小鼠脾细胞 ,并用ConA和重组HCMV pp65336～ 50 7作为抗原刺激 ,吉氏液染色观察T淋巴细胞的形态学变化 ,并计算转化率。MTT法对脾脏的特异性杀伤细胞率和淋巴细胞的增殖指数进行测定 ,间接ELISA定量检测脾细胞上清中IFN γ的含量。结果　pp65336～ 50 7抗原刺激的DNA疫苗免疫鼠脾细胞体积变大 ,胞浆增多 ,核仁增多 ;淋巴细胞增殖试验示pp65336～ 50 7抗原能特异性刺激免疫鼠脾细胞增殖 ;试验组IFN γ较对照组增高 ,其含量为 80 0ng/L。与对照组比较 ,差异均具显著性 (P<0 0 5)。试验组及对照组脾细胞杀伤率分别为 :56 0 5 %±1 3 64 %、9 85 %± 2 0 6 % ,试验组脾细胞CTL活性比对照组增高 (P <0 0 5)。结论　HCMVpp65DNA疫苗可诱导小鼠HCMV特异性细胞免疫应答     

重叠延伸PCR技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化

目的：基于重叠延伸PCR (SOE PCR)技术构建转录因子EB (TFEB)丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。方法：根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物Fn和Rn进行第1步PCR扩增,获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步PCR扩增获得含突变位点的目的 DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用Bam HⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果。于大肠杆菌(E. coli)中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。结果：第1步PCR扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步PCR退火延伸和第3步PCR扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。双酶切鉴定,连接的DNA片段...     

SARS相关冠状病毒S2基因的克隆及其DNA疫苗的免疫效果

目的：构建抗原基因为SARS相关冠状病毒(severe acute resplratory syndrome coronavtrus，SARS—CoV)S2基因的DNA疫苗，将其接种小鼠后观察病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的S2基因片段克隆至真核表达载体，随之将质粒进行小鼠肌内接种免疫，定期检测血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：疫苗接种后第2周就能检测出病毒特异性抗体，随着时间的延续，抗体水平逐步升高，而空质粒对照组未检测出明显的特异性抗体。结论：以S2为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体。     

单纯疱疹病毒1型截短糖蛋白B基因疫苗的构建及其诱导小鼠细胞免疫应答

目的:构建、制备单纯疱疹病毒1型截短糖蛋白B DNA疫苗，检测其诱导机体产生的细胞免疫应答效果。方法:利用PCR技术从HSV-1 SM44毒株基因组中扩增出编码HSV-1 gB14～507氨基酸序列的一段基因。定向插入真核表达质粒pcDNA₃载体中，构建出重组真核表达质粒pcDNA₃-gBt，并对其进行酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定。于BALB/c鼠注射免疫3次，抗体分析CD4⁺、CD8⁺T细胞亚群的变化，羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)/碘化丙碇(PI)双标记的流式细胞计数法检测CTL活性。结果:PCR及测序鉴定结果显示，插入的克隆基因与GenBank中HSV-1F株gB基因序列一致，证实了HSV-1 gBt核酸疫苗的构建；pcDNA₃-gBt免疫组BALB/c鼠的CD4⁺T细胞数较空质粒（pcDNA₃）对照组和生理盐水对照组增加，CTL活性也较对照组明显增强，但是pcDNA₃-gBt免疫组BALB/c鼠的CD8⁺T细胞、CD4⁺/ CD8⁺T细胞比值与对照组比较差异均无显著性（P＞0.05）。结论:HSV-1 gBt核酸疫苗诱导较强的细胞免疫应答。