有序排列聚甲基丙烯酸甲酯电纺纳米纤维作为大鼠原代雪旺细胞负载支架的可行性研究

目的:探讨有序聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)电纺纳米纤维作为雪旺细胞负载支架的潜力。方法:构建有序PMMA电纺纳米纤维,以随机PMMA电纺纤维作为对照,纯化大鼠原代雪旺细胞并在纤维结构上进行培养,利用慢病毒技术转染绿色荧光蛋白基因作为显色手段,观察有序PMMA电纺纤维的拓扑线索在定向引导SCs生长上的作用,分析细胞对纤维结构的依从性;并在此基础上,持续动态观察雪旺细胞对有序电纺纤维的依从性,从而评价有序PMMA电纺纳米纤维作为神经损伤后植入性雪旺细胞负载支架的潜力。结果:雪旺细胞在随机及有序PMMA电纺纤维上均能顺利贴壁并生长;较之随机电纺纤维,雪旺细胞对有序纤维具有更好的依从性,能够受其接触引导形成和纤维走行方向一致的定向生长,并能够生成更长的细胞突起(P=0.0079);动态的观察则进而显示SCs对有序电纺纳米纤维的拓扑线索能维持稳定的依从性。结论:有序PMMA电纺纳米纤维具有作为神经损伤后植入性雪旺细胞负载支架的潜力。     

有序聚甲基丙烯酸甲酯电纺纳米纤维作为大鼠背根神经元负载支架的可行性研究

目的探讨具备有序或无序拓扑结构的聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)电纺纳米纤维材料作为原代大鼠背根神经元(dorsal root ganglion neurons,DRGn)负载支架的可行性。方法构建具有随机或有序拓扑结构的PMMA电纺纳米纤维;利用PMMA薄膜组作为对照,分离纯化大鼠原代DRGn,利用慢病毒技术转染绿色荧光蛋白基因作为显色手段,分析在随机及有序纤维支架上DRGn神经突的生长能力以及神经突和电纺纤维的依存关系。结果大鼠原代DRGn能够顺利在PMMA材料上贴壁并生长,在培养第2天,较之平面环境,DRGn未见平均神经突数量及神经突长度的明显区别,电纺纤维的拓扑结构对于DRGn神经突的生长具有明显的接触引导作用,在有序电纺纤维上DRGn能够生成和基质纤维延伸方向一致的神经突;通过GFP表达与背景纤维的合成图,发现在随机或有序电纺纤维上,DRGn神经突均能循纤维向前生长,但相比随机纤维,神经突似乎更倾向于接受有序电纺纤维的引导。结论有序PMMA电纺纳米纤维具有作为神经损伤后大鼠DRGn负载支架的潜力。     

视神经星形胶质细胞原代培养技术研究

目的 介绍一种快速原代培养、分离、纯化视神经星形胶质细胞的方法。方法 对P2期小鼠的视神经进行组织块原代培养,振荡法分离纯化,形态学观察,免疫组织化学染色。结果 培养的星形细胞纯度高,GFAP染色显示98%阳性。结论 组织块原代培养,振荡法分离纯化视神经的星形胶质细胞,对细胞的损伤小、纯度高,是快速得到该细胞的理想途径。     

大鼠脊髓星形胶质细胞的体外培养与鉴定

目的:探讨大鼠脊髓组织星形胶质细胞体外培养、纯化和鉴定的方法。方法:于无菌条件下取新生1~2 d的SD大鼠脊髓组织,采用机械吹打及胰酶消化法制成细胞悬液,通过差速贴壁和恒温摇床震荡去除杂细胞,进行培养。用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色对所培养的细胞进行鉴定。结果:分离培养的细胞具有典型的星形胶质细胞的形态,传至第3代细胞纯度达95%以上。结论:成功建立了大鼠脊髓星形胶质细胞体外培养方法,为脊髓星形胶质细胞的实验研究奠定基础。     

电针对脊髓损伤后星形胶质细胞增生的影响

目的 :探讨督脉电针对成年大鼠脊髓损伤后星形胶质细胞增生的影响。方法 :选用成年雌性wistar大鼠 ,Allen氏法制作脊髓损伤模型 ,分别应用督脉电针治疗不同时间 ,以激素组和损伤不治疗组作对照。观察星形胶质细胞的形态、数量的变化 ;应用RT-PCR法检测GFAP表达变化。结果 :脊髓损伤后星形胶质细胞反应性增生 ,灰质强于白质 ,尾侧强于头侧 ,电针治疗组胶质反应较轻 ;电针组星形胶质细胞线粒体、核糖体增多 ,吞噬变性髓鞘增强 ;培养观察 ,电针组GFAP表达减少。结论 :电针可抑制脊髓损伤后星形胶质细胞反应性增生 ,防止胶质瘢痕形成     

SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞的体外原代培养

目的：建立原代培养的SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞体系.方法：取新生24 ～48 h的SD大鼠,无菌操作取出大脑皮层,剪碎后用胰酶消化、机械吹打制成分散细胞悬液,网筛过滤,将细胞悬液接种培养7～9d;置于摇床（37℃、250 r/min振摇6h）,弃掉含脱离细胞的细胞悬液,去除小胶质细胞及少突胶质细胞,细胞传代,进行GFAP细胞免疫荧光鉴定.结果：成功分离和培养原代星形胶质细胞,GFAP免疫荧光鉴定星形胶质细胞比例在95％以上.结论：采用该培养方法能够成功的建立原代SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞体系,为研究神经系统疾病及其相关疾病提供了可靠的细胞模型.     

星形胶质细胞在脊髓损伤修复中的作用

中枢神经系统损伤后的修复一直是科研人员和临床工作者关注的重点.虽然关于中枢神经系统损伤修复的研究已经很多,比如嗅鞘细胞、神经干细胞移植以及各种细胞因子等在损伤修复方面的积极作用[1-4],但目前在该领域的研究却没有实质性进展.星形胶质细胞(astrocyte,AST)是神经系统中数目众多的细胞之一,以往认为它仅是被动的辅助角色,只是起支持、提供营养及协助代谢等作用,而且胶质细胞过度增生形成的胶质瘢痕对哺乳动物神经系统损伤后轴突再生起障碍作用.     

星形胶质细胞对损伤反应的体外实验研究

目的：研究体外星形胶质细胞（Ast）反应性胶质化的发生、发展过程与规律。方法：体外分离培养Ast,利用划伤的方法,建立Ast对损伤反应的实验模型,通过形态学观察、RT－PCR、免疫细胞化学、原位杂交及图像分析等方法,研究体外Ast对损伤的反应及规律。结果：损伤体外培养的Ast后,观察到反应性胶质化的典型特征,表现为Ast胞体肥大、突变增粗、延长,GFAP免疫细胞化学染色增强;原位杂交、RT－PCR分析表明,GFAPmRNA表达显著提高。上述变化在伤后1d即可见到,5－7d达到高峰。结论：体外分离培养的Ast对损伤表现出活跃的反应,呈现出典型的反应性胶质化特征,其发生、发展过程与规律类似于在体情况下的Ast反应。     

大鼠星形胶质细胞的体外培养与鉴定

目的探讨大鼠星形胶质细胞的最优体外培养方法与培养条件。方法采用差异贴壁等手段进行组织原代培养,胰蛋白酶消化传代,并应用相差显微镜和即用型SP-9001免疫组化试剂盒对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果镜下培养细胞生长多呈多彤性、扁平状,胞体较大,胞突较多较长,细胞核呈圆形或卵圆形,常偏于胞体的一侧,免疫组化染色显示细胞浆为掠褐色,细胞核为蓝色,呈阳性表达,星形胶质细胞的纯度在95％以上。结论本法可获纯度高、结构和功能良好的大鼠星形胶质细胞,可作为体外的细胞模型为研究细胞因子对其功能的调控作用奠定实验基础。     

针灸效应学体外实验方法观察星形胶质细胞超微结构

目的 探讨电针治疗大鼠脊髓损伤（spinal cord injury,SCI)血清对离体培养星形胶质细胞超微结构的影响。方法 采用针灸效应学体外实验方法对离体培养星形胶质细胞用透射电镜观察其超微结构的变化。结果 电针治疗组的星形胶质细胞其溶酶体较造模组少,而高尔基复合、内质网、微管、微丝较造模组明显增多。结论 电针可减轻损伤对星形胶质细胞中溶酶体的刺激,增强细胞器的蛋白合成和分泌功能。     

具备不同拓扑结构的聚甲基丙烯酸甲酯静电纺丝纳米纤维细胞支架的构建及鉴定

运用计算流体力学对超音速空气火焰喷涂（HVAF）喷枪流场进行模拟,根据模拟结果选择恰当的送粉位置,并研究了入射角度(θ)、WC 10Co4Cr颗粒入射质量流量(M)、颗粒直径(D)、入射速度(v)对颗粒轨迹的影响。研究发现：送粉位置有两个选择点,即分别距离喷嘴5倍于喷嘴直径处和20倍于喷嘴直径处;入射角为30°～50°时颗粒飞行轨迹最佳,而入射角为10°和70°时均出现部分颗粒撞击壁面的情况;当质量流量为1 g/s时,粒子在流场中的轨迹最佳;颗粒直径在50 μm左右时粒子飞行的轨迹最好; 当入射速度达到30 m/s左右时,颗粒的飞行轨迹最佳;而入射速度超过35 m/s后,会出现严重的颗粒相互撞击的现象。     

大鼠原代背根神经元和雪旺细胞在随机及有序排列聚甲基丙烯酸甲酯电纺纳米纤维上共培养的形态学

目的: 探讨聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)电纺纳米纤维支架的拓扑线索对于大鼠原代背根神经元(DRGn)培养及其与雪旺细胞(SCs)共培养的影响。 方法: 构建具有随机分布和轴向有序排列拓扑结构的PMMA电纺纳米纤维,分别为随机和有序PMMA电纺纳米纤维组,以PMMA薄膜作为对照组;分离纯化大鼠原代DRGn和SCs,与上述各组PMMA电纺纳米纤维共培养;利用慢病毒技术转染荧光蛋白基因作为显色方法,观察PMMA电纺纳米纤维的拓扑线索对于DRGn神经突生长的影响,在共培养实验通过荧光图像的快速傅立叶转换(FFT)及半高全宽值(FWHM)的计算,定量分析电纺纤维对DRGn神经突和SCs细胞突起的接触引导作用。 结果: 大鼠原代DRGn和SCs均能够顺利在PMMA材料上贴壁并生长;与PMMA薄膜组比较,随机和有序PMMA电纺纳米纤维组DRGn平均神经突数量及神经突长度差异无统计学意义(P>0.05);共培养实验中,电纺纤维的拓扑线索对于 DRGn神经突和SCs细胞突起的生长均具有明显的接触引导作用,与PMMA薄膜组和随机PMMA电纺纳米纤维组比较,有序PMMA电纺纳米纤维组DRGn和SCs的FWHM值均明显降低 (P<0.01),有序PMMA电纺纳米纤维能够在空间上促成DRGn神经突和SCs细胞突起建立共定位。 结论: 有序PMMA电纺纳米纤维具有作为脊髓损伤(SCI)后植入性支架材料的潜力,其拓扑线索有可能加速SCs的轴突髓鞘化过程。     

培养大鼠星形胶质细胞牵张损伤后超微结构的变化

目的研究体外培养星形细胞牵张损伤后超微结构的变化。方法取新生1~2 d大鼠的皮层细胞原代培养,经纯化后传代培养于乳胶膜培养皿中。采用计算机控制的牵张损伤装置,分别以50、150、250 kPa压力牵张损伤培养于乳胶膜上的大鼠皮层星形胶质细胞。用3%戊二醛固定后,行扫描电镜和透射电镜观察。结果当用50 kPa驱动压力进行牵张损伤时,细胞结构即有明显破坏,表现为细胞间隙增宽,部分胞体和突起被撕裂;以50 kPa牵张损伤后1 h,透射电镜下可见线粒体肿胀、嵴减少;损伤后6 h可见线粒体致密、细胞器减少等。当牵张应力增大,星形细胞损伤程度加重,细胞器明显减少,线粒体空泡化,微丝、微管明显减少,直至水样胞质或致密胞体。结论较小的应力即可致星形细胞紧密连接的破坏和超微结构的改变,可能与脑外伤后产生广泛的脑水肿有关。     

Ultrastructural features of cultured rat cortical astrocytes with stretch-induced injury]

OBJECTIVE: To investigate the changes of ultrastructural features of cultured rat cortical astrocytes after stretch-induced injury. METHODS: Rat cortical astrocytes isolated from 1- to 2-day-old rats were cultured till confluency, and then plated in tissue culture wells with flexible silastic bottom after purification. A computer-controlled device was used to produce stretch-induced injury in the astrocytes with the imposed pressure of 50, 150, and 250 kPa respectively, followed by observation of the ultrastructural changes in the astrocytes with light and electron microscopy. RESULTS: Obvious ultrastructural destruction of the astrocytes occurred when the imposed stretch pressure was 50 kPa, and scanning electron microscopy demonstrated increased intercellular space and laceration of the cell body and its processes. Transmission electron microscopy revealed mitochondria swelling 1 h after stretch-induced injury and 6 h after the injury, vacuolar degeneration of the mitochondria occurred. Increased stretch pressure caused further decrease in the amount of glial filaments and densification of astrocytes. CONCLUSIONS: Stress, even at a relatively small scale, can cause disruption of intercellular juncture and ultrastructural change of the cultured astrocyte, which may be related with extensive brain edema after traumatic brain injury.     

人胚胎RPE细胞在微孔聚酰胺纳米纤维膜和蚀刻多孔聚酯膜上生长的比较研究

目的: 比较观察人胚胎视网膜色素上皮(RPE)细胞在微孔聚酰胺纳米纤维膜(EPN)和蚀刻多孔聚酯膜(EPP)上的生长情况,为理想Bruch’s 膜替代物的研究奠定实验基础。方法: 人胚胎RPE细胞培养在底分别为EPN(EPN组)、EPP(EPP组)的Transwell 小室以及常规Transwell小室(对照组)。在第2,4,8 h和第1,4,8天分别评估3组细胞的贴壁和增殖情况。对比观察细胞生长形态及两种替代物的表面结构;免疫荧光染色观察RPE细胞ZO-1的表达。通过组织病理切片观察EPN和EPP植入21天龄(P21) RCS大鼠视网膜下间隙2周后的生物学反应。结果: 接种8 h(密度为4×10⁵/cm²)后,EPN组, EPP组和对照组RPE细胞贴壁生长数量分别为1.23×10⁵/cm²,1.70×10⁵/cm²和1.64×10⁵/cm²,其中EPN组细胞数量明显少于EPP组及对照组(P<0.05);以2.5×10⁵/cm²的密度接种后第1天,EPN组细胞密度明显低于EPP组和对照组(P<0.05),但在接种后第8天,EPN组细胞数量显著多于EPP组和对照组(P<0.05)。EPN 和EPP均支持RPE 单细胞层形成,前者纤维排列类似Bruch’s 膜内胶原层;与对照组比,EPN和EPP组RPE细胞均呈现较强的ZO-1表达,较好地保持了原代RPE细胞表型;EPP和EPN植入视网膜下间隙后出现纤维包裹和光感受器层破坏、丢失,但在移植物附近未见明显毒性或排斥等其他异常反应。结论: EPN和EPP均支持人胚胎RPE细胞生长,二者植入P21 RCS大鼠视网膜下间隙后存在大体生物相容性。EPN的纤维排列与Bruch’s膜内胶原层相近,可能是一种具有广阔发展前途的Bruch’s 膜替代物。     

新型番荔枝酰胺衍生物FLZ对去血清培养损伤星形胶质细胞的保护作用

目的 评价番荔枝酰胺衍生物FLZ对去血清培养损伤星形胶质细胞的作用,并探讨其可能的作用机制.方法 在去血清培养的星形胶质细胞模型上,以3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测细胞存活率,Hochest 33342染色观察细胞核形态变化,荧光比色法检测细胞内活性氧簇(ROS)生成.酶联免疫...     

桩蛋白在大鼠星形胶质细胞中的表达

目的：初步探讨桩蛋白（paxillin）在大鼠星形胶质细胞及神经元中的表达。方法：通过组织切片、细胞培养、免疫荧光和RT-PCR方法,观察桩蛋白在大脑皮层及体外培养的星形胶质细胞以及神经元中的表达。结果：桩蛋白在大鼠脑皮质的星形胶质细胞中表达,神经元未见明显表达;在体外培养的星形胶质细胞以及神经元中的表达情况与体内一致,主要表达于星形胶质细胞的胞浆及突起中。结论：桩蛋白主要表达于星形胶质细胞而非神经元中。本实验结果为进一步研究桩蛋白在星形胶质细胞中的生物学作用奠定了基础。     

臭氧对大鼠星形胶质细胞作用的体外研究

目的观察较短时间内臭氧(O3)对体外培养的大鼠星形胶质细胞(Ast)功能结构的影响,并探讨其作用机制。方法体外培养大鼠Ast并行免疫细胞化学鉴定;大鼠Ast传代接种入24孔培养板,分为3组（n=7）,纯氧组（O₂组）加入400μL纯氧作用20min后的完全培养基;O₃40组、O₃80组分别加入400μL的40μg/mL、80μg/mL臭氧作用20min后的完全培养基,分别于2、4h收集细胞悬液及破碎细胞后简易测定法测定细胞乳酸脱氢酶（LDH）漏出率,台盼蓝染色计数死亡细胞百分比。结果与O₂组比较,O₃40组Ast LDH漏出率在2、4h均降低（P＜0.05）,O380组在两时点均明显升高（P＜0.01）,且O380组4h较2h升高明显（P＜0.05）;与O₂组比较,O₃80组Ast死亡细胞百分比在2、4h均升高（P＜0.01）,且4h较2h升高明显（P＜0.01）。结论较短时间（2、4h）内,80μg/mL浓度的臭氧表现出对体外培养大鼠星形胶质细胞的损伤作用,而40μg/mL浓度的臭氧未表现出此作用。     

静电纺丝聚乳酸-乙醇酸聚合物膜与大鼠嗅鞘细胞的生物相容性研究

目的 探索静电纺丝技术制作的聚乳酸-乙醇酸聚合物（PLGA）膜与大鼠嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells,OECs）的生物相容性。方法 体外培养纯化成年大鼠OECs,将细胞接种于静电纺丝PLGA膜上,使用相差显微镜观察静电纺丝PLGA膜上OECs的细胞形态与分布;用CFDA SE荧光染色检测接种后1～5 d内静电纺丝PLGA膜上OECs的增殖情况;以多聚赖氨酸（PLL）包被细胞做对照。将静电纺丝PLGA膜植入大鼠体内观察其与大鼠的组织相容性。结果 体外培养纯化所得的OECs的细胞纯度大于90%。相差显微镜下示OECs在静电纺丝PLGA膜孔隙中的纳米纤维上黏附良好,细胞状态佳,且特异性地沿纳米纤维方向生长。接种后1～5 d内OECs在静电纺丝PLGA膜上均正常增殖,细胞数目与对照组相比差异无统计学意义。静电纺丝PLGA膜局部移植后大鼠无死亡,PLGA膜与周围组织融合并部分降解。结论 静电纺丝PLGA膜具有良好的生物相容性,OECs在其膜上的黏附和增殖状况良好,是有潜力的神经修复组织工程化神经移植物。