过表达MiR-494抑制脑胶质瘤细胞U87的增殖

目的观察微小RNA-494(miR-494)对脑胶质瘤细胞U87增殖能力的影响。方法通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测5例瘤旁组织和14例胶质瘤样本中miR-494的表达水平,并且检测其在6种胶质瘤细胞系中的表达;将100 nmol/L miR-494 mimics瞬时转染至脑胶质瘤U87细胞,qRT-PCR检测miR-494表达情况;采用四唑盐比色法(MTT)检测U87细胞增殖情况;流式细胞术(FCM)检测对U87细胞周期的影响。结果与瘤旁脑组织相比,miR-494在胶质瘤中呈现低表达;U87细胞转染48 h后,miR-494 mimics组miR-494表达为对照组的357倍(P0.05);与对照组相比,miR-494 mimics转染后抑制了U87细胞的增殖能力(P0.05);S期细胞显著减少,而G1期细胞则明显增多。结论 miR-494在胶质瘤中低表达,过表达miR-494 mimics有效抑制了U87细胞的增殖,调节细胞周期S期降低G1期增多,提示miR-494有望成为胶质瘤治疗的分子靶点。     

siRNA靶向沉默组织蛋白酶D对胶质瘤细胞生物学行为的影响

目的 探讨小分子干扰RNA(siRNA)靶向沉默胶质瘤细胞系U87中组织蛋白酶D(CD)对胶质瘤细胞生物学行为的影响. 方法 采用脂质体介导的CD siRNA、scramble siRNA、空白对照siRNA转染体外常规培养的胶质瘤细胞株U87,RT-PCR、Western blotting分别检测转染后U87细胞CD mRNA和蛋白的表达;MTT法检测转染CD siRNA、scramble siRNA 1～5 d后U87细胞的增殖;细胞侵袭实验检测转染CD siRNA、scramble siRNA 48 h后细胞侵袭能力的变化. 结果 转染48 h后CD siRNA组细胞CD mRNA、蛋白的表达明显低于转染scramble siRNA和空白对照siRNA组,差异有统计学意义(P＜0.05);转染后2、3、4、5d转染CD siRNA组U87细胞吸光度(A)值低于转染scramble siRNA组,差异有统计学意义(P＜0.05);细胞侵袭实验结果表明转染CDsiRNA组滤膜细胞数低于转染scramble siRNA组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 CD可能是具有广泛应用前景的胶质瘤分子生物治疗的靶点.     

阻断Eag-1通道活性抑制胶质瘤细胞增殖的研究

目的 探讨阻断Eag-1通道活性对胶质瘤细胞生物活性的影响. 方法 设计3对Eag-1通道蛋白的特异性小分子干扰RNA(siRNA)并转染入U87细胞,RT-PCR及Western blotting检测其对U87细胞Eag-1 mRNA和蛋白表达的影响;将50 nmol/L siRNA1、siRNA2转染U87细胞,同时设5、10、20、30和40mmol/L奎尼丁(Eag-1通道特异性阻断剂)组和空白对照组,MTT法观察作用24、48、72 h后U87细胞增殖情况,流式细胞仪检测作用48 h后细胞周期、细胞凋亡率、胞内活性氧簇(ROS)浓度的变化. 结果 RT-PCR及Western blotting结果 显示siRNA1和siRNA2转染U87细胞12 h后细胞Eag-1 mRNA、蛋白的表达产物带明显弱于空白对照组,而siRNA3转染组产物条带虽也弱于空白对照组,但条带仍清晰;MTT检测结果 显示与空白对照组比较,50hmol/LsiRNA1、siRNA2转染组和10、20、30、40 mmol/L奎尼丁组细胞培养24、48和72 h后吸光度值均降低,差异有统计学意义(P＜0.05),奎尼丁IC50为33.7mmol/L.流式细胞仪分析显示与空白对照组比较,50nmol/L siRNA1、siRNA2转染组和33.7mmol/L奎尼丁组G1期细胞百分比、细胞凋亡率和胞内ROS水平均增加,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 阻断Eag-1通道活性能明显抑制胶质瘤细胞增殖,使G1期细胞比例、胞内ROS水平明显升高并诱导其凋亡.     

I型γ-分泌酶抑制剂对恶性胶质瘤细胞株增殖及凋亡的影响

目的 探讨I型γ-分泌酶抑制剂(GSI-I)对U87、U251胶质瘤细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用.方法 应用GSI-I作用于U87、U251胶质瘤细胞,通过MTT法观察GSI-I对上述两种细胞的增殖抑制作用,通过流式细胞仪检测GSI-I对该两种细胞细胞周期的影响及诱导凋亡的作用.结果RT-PCR及实时定量荧光RT-PCR结果显示,GSI-T可明显抑制胶质瘤细胞中Notch通路的活性,主要体现为Notch通路的靶基因Hes-1表达明显下调.MTT检测结果显示2.5μmol/L及以上浓度的GSI-I对U87及U251胶质瘤细胞有明显的增殖抑制作用.与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),且该抑制作用呈剂量依赖型增加.流式细胞检测结果显示GSI-I主要使U87胶质瘤细胞的细胞周期阻滞在G1期而抑制细胞增殖,对于U251胶质瘤细胞则主要通过诱导凋亡来抑制增殖.结论 GSI-I可明显抑制U87及U251胶质瘤细胞的增殖并诱导凋亡,为恶性胶质瘤的临床治疗提供了理论参考依据.     

胶质瘤U87细胞中AKT2基因表达对化疗药物替尼泊苷敏感性的影响

目的探讨脑胶质瘤U87细胞中AKT2基因表达对替尼泊苷（VM-26）敏感性的影响。方法体外将慢病毒介导的AKT2-shRNA表达载体转染胶质瘤U87细胞,作为实验组;转染GFP—shRNA的U87细胞作为阴性对照组,未转染的U87细胞作为空白对照组。应用RT—PCR、Westernblot检测3组U87细胞中AKT2mRNA和蛋白的表达变化。应用MTT法检测3组U87细胞对VM-26敏感性的变化。结果与阴性对照组和空白对照组比较,实验组转染后的U87细胞AKT2mRNA和蛋白的表达水平明显下降（P〈0．01）。实验组VM-26对U87细胞的半数抑制量（IC50）为（6．46±0．42）μg／ml,阴性对照组为（1．16±0．25）μg／ml,空白对照组为（1．15±0．22）μg／ml,实验组与两对照组间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论AKT2-shRNA抑制AKT2基因表达,能增加人脑胶质瘤U87细胞株对化疗药物VM-26的敏感性。     

Evi1基因对胶质瘤细胞株U87/U251增殖、侵袭的影响

目的探讨Evi1基因在不同级别胶质瘤组织中的表达,以及调控该基因对胶质瘤细胞株U87和U251细胞增殖、细胞周期和侵袭影响,为靶向癌基因治疗胶质瘤提供客观依据。方法首先通过实时定量PCR(qRT-PCR)分别检测人脑不同级别胶质瘤组织以及U87和U251细胞株中Evil基因的表达水平。用合成的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰下调U87和U251细胞Evi1基因表达作为干扰组,同时设空白和阴性对照组。qRT-PCR检测转染前后Evi1基因在U87和U251细胞中的表达和转染效率。CCK-8法检测实验组细胞的增殖能力,流式细胞仪分析Flow Cytometer(FCM)其细胞周期。Transwell以及划痕试验检测各组U87和U251的侵袭和迁移能力。以及用qRT-PCR分析下调Evi1基因后U87和U251细胞基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达水平。结果 Evi1基因在胶质瘤组织中呈现高表达,且随着胶质瘤级别程度增加其表达水平亦上升,其中Ⅲ和Ⅳ级的胶质瘤组织以及U87、U251细胞Evi1基因表达明显高于非瘤脑组织(均P0.05)。通过siRNA下调Evi1基因后,胶质瘤细胞株U87和U251的增殖减缓(均P0.05),其侵袭和迁移能力明显下降(均P0.01),并能阻滞其细胞周期G1期(P0.05)。干扰组U87和U251细胞MMP2表达水平明显降低(均P0.01)。结论 Evi1基因在胶质瘤中呈高表达,干扰U87和U251细胞Evi1基因可抑制胶质瘤的增殖和侵袭。     

反义miR-155对人胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察敲低微小RNA-155(miR-155)的表达对人胶质瘤细胞系U251细胞增殖和凋亡的影响.方法 脂质体介导转染miR-155反义抑制序列(AS-miR-155)下调入胶质瘤U251细胞中miR-155的表达,同时设未转染组和无义序列转染组.实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测转染后细胞miR-155的表达,四甲基偶氨唑盐(MTT)实验检测转染后细胞增殖活性,流式细胞术(FCM)检测转染后细胞周期变化和凋亡情况.结果 与未转染组和无义序列转染组相比,miR-155 反义抑制序列转染组细胞miR-155表达下降;MTT实验结果显示细胞生长受抑;流式细胞术结果可见细胞出现G0/G1期阻滞,细胞凋亡率增高.结论 反义miR-155可抑制U251胶质瘤细胞生长增殖,促进其凋亡.miR-155可能成为治疗胶质瘤的候选靶标.     

下调BAG3表达对胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨下调BAG3表达对胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响。方法 体外培养U87细胞,转染pEGFP-BAG3-shRNA质粒构建BAG3低表达胶质瘤U87细胞株（低表达组）,转染pEGFP-shRNA对照质粒为对照组;利用RT-PCR和免疫印迹法鉴定;利用CCK8和EdU检测U87细胞增殖,利用流式细胞术检测U87细胞凋亡。结果 与对照组相比,RT-PCR和免疫印迹法检测结果显示低表达组BAG3 mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）,低表达组24、48、72 h细胞增殖水平均明显降低（P<0.05）,低表达组细胞凋亡率明显增高（P<0.05）。结论 下调胶质瘤U87细胞BAG3表达显著抑制其增殖、促进其凋亡。     

miR-106a抑制胶质瘤细胞增殖并诱导凋亡

目的胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,具有较高的病死率。现有的研究表明miR-106a在多种肿瘤中表达上调,并发挥着致癌性作用,但miR-106a在胶质瘤中的表达和作用却并不清楚。方法不同级别胶质瘤组织和胶质瘤细胞系(T98G,SHG44,U87,U251,U373)内的miR-106a水平通过实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定。转染miRNA寡聚核苷酸后的U87和U251细胞的增殖能力和细胞周期分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法和流式细胞仪测定,并且通过膜联蛋白/碘化丙啶(annexin V/PI)双染法测定了miR-106a对胶质瘤细胞的凋亡影响。结果miR-106a在胶质瘤组织和胶质瘤细胞系内表达水平相对正常脑组织显著下降,并且miR-106a表达水平与胶质瘤病理级别负相关。胶质瘤细胞转染miR-106a后,可检测到过表达的miR-106a可显著抑制胶质瘤细胞的增殖能力,阻滞细胞周期于G0/G1期,同时诱导胶质瘤细胞凋亡增加。结论 miR-106a可阻滞胶质瘤细胞细胞周期、抑制增殖和诱导凋亡。     

MSP58基因小干扰RNA对胶质瘤细胞系U251增殖的影响

目的观察核微球蛋白58（MSP58）基因特异性siRNA（small interfering RNA）对神经胶质瘤U251细胞的体外增殖的影响。方法体外化学合成针对MSP58基因的siRNA,脂质体法转染神经胶质瘤细胞系U251,荧光显微镜观察转染效率,逆转录酶-多聚酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别检测MSP58基因的mRNA和蛋白表达水平,甲基噻唑基四唑法（MTT法）绘制细胞生长曲线,流式细胞仪（FCM）分析细胞周期。结果MSP58基因的特异性siRNA转染U251细胞后,MSP58的mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖受到明显抑制;流式细胞仪检测显示转染后的U251细胞G2/M期细胞明显减少（P〈0.01）,S期细胞略有减少,G1期细胞明显增加（P〈0.01）,G1期发生明显阻滞。结论MSP58基因的特异性siRNA可明显抑制神经胶质瘤细胞U251的增殖,并引起G1期细胞阻滞。     

替莫唑胺通过TFRC抑制U87胶质瘤细胞增殖和侵袭

目的 探讨转铁蛋白受体（TFRC）在替莫唑胺抑制U87胶质瘤细胞增殖和侵袭中的作用。方法 体外培养U87胶质瘤细胞,加入50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L替莫唑胺作用;构建control siRNA、siTFRC转染U87细胞沉默TFRC表达,构建pcDNA3.1空载体、pcDNA3.1/TFRC转染U87细胞过表达TFRC;利用CCK-8方法检测U87细胞增殖;利用Transwell小室实验检测U87细胞侵袭能力;实时荧光定量PCR和免疫印迹法检查U87细胞TFRC mRNA和蛋白表达。结果 与空白组相比,替莫唑胺处理后,U87细胞的增殖和侵袭能力显著下降（P<0.05）,TFRC mRNA和蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,当替莫唑胺浓度为200 μmol/L时,对U87细胞的抑制能力最强（P<0.05）。当利用pcDNA3.1/TFRC过表达U87细胞TFRC处理后,替莫唑胺对U87细胞增殖和侵袭的抑制能力显著下降（P<0.05）;而当利用siTFRC沉默U87细胞TFRC表达后,替莫唑胺对U87细胞增殖和侵袭的抑制能力显著增强（P<0.05）。结论 替莫唑胺可能通过抑制TFRC的表达而抑制U87胶质瘤细胞的增殖和侵袭。     

反义miR-30a-5p抑制人脑胶质瘤细胞U87生长的体外实验研究

目的 前期发现miR-30a-5p在胶质瘤中表达明显上调,本实验探究敲低miR-30a-5p对人脑胶质瘤细胞U87细胞生物学特征的影响.方法 real-time PCR检测转染miR-30a-5p I(miR-30a-5p抑制物)后U87细胞的miR-30a-5p表达水平,流式细胞术、MTT、Transwell、Annexin V法检测细胞周期、生长、侵袭及凋亡的改变;Western blot检测相关蛋白.结果 real-time PCR结果显示miR-30a-5p I可有效降低U87细胞中miR-30a-5p表达,抑制细胞增殖活性,使细胞周期阻滞在G0/G1期,侵袭能力明显受抑,凋亡增加,促增殖蛋白PCNA、促细胞周期进展蛋白Cyclin D1及促侵袭蛋白MMP-9的表达明显下调,而抑制侵袭蛋白TIMP-1及凋亡相关蛋白p53表达明显上调.结论 敲低U87细胞的miR-30a-5p表达可抑制胶质瘤的增殖及侵袭,诱导凋亡;miR-30a-5p可成为人脑胶质瘤基因治疗的潜在候选靶点.

Abstract：

Objective Our previous study had shown that there was overexpression of miR- 30a- 5p in malignant glioma cell lines.In the present study, we aim to investigate the effect of knocking -down miR -30a -5p on the biological characteristics of U87 glioblastoma cells.Method The U87 cells were divided into three groups:control cells,cells transfected with scramble oligonucleotides and cells transfected with miR -30a -5p inhibitors(miR-30a-5p I).Oligonucleotides mediated by lipofectamine were transfected to U87 cells.Real -time PCR was conducted to detect the expression of miR- 30a -5p in transfected cells.The cell proliferation was determined by 3- (4,5- Dimethylthiazol-2-yl) -2,5- diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay and flow cytometry.The cell invasion was evaluated by Transwell assay and cell apoptosis was detected with Annexin V staining Moreover, the relevant molecules regulating proliferation, invasion, cell cycle progression and apoptosis were examined by Western blot analysis.Results The expression of miR - 30a - 5p in the cells transfected with miR - 30a - 5p I was significantly reduced.The cell proliferation activity of U87 cell was inhibited.The cell cycle was arrested in G0/G1 phase, cell invasive ability was attenuated and apoptotic cells were increased in cells transfected with miR -30a -5pI as compared to those of the cells transfected with scrambled siRNA and control cells.The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), matrix metallopeptidase 9 ( MMP - 9) and Cyclin D1 were downregulated while the tissue inhibitor of metalloproteinase1 (TIMP - 1 ) and p53 were upregulated.Conclusions Transfection of miR - 30a-5p I into glioma cells could inhibit the proliferation activity and invasive ability of U87 cell and induce cell apoptosis, miR -30a -5p is a potential target of gene therapy for glioma.     

STIP1对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的 探讨下调磷酸化应激诱导蛋白1（STIP1）表达对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和凋亡的影响,及其对JAK2/STAT3信号通路的调控作用。方法 免疫印迹法检测体外培养的正常胶质细胞（SVG）和人胶质瘤细胞（U251、U87和U37）STIP1蛋白表达水平。NC-siRNA或STIP1-siRNA质粒转染U251细胞,CCK-8法检测U251细胞增殖;Transwell实验检测U251细胞侵袭能力;流式细胞术检测U251细胞凋亡率;免疫印迹法检测JAK2/STAT3信号通路蛋白表达水平。结果 与正常胶质细胞SVG比较,胶质瘤细胞U251、U87和U373的STIP1蛋白表达水平均明显增高（P<0.05）。与NC-siRNA组比较,STIP1-siRNA组STIP1蛋白表达水平、细胞增殖活力和细胞侵袭力明显明显降低（P<0.05）,细胞凋亡率明显增高（P<0.05）,而且,p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结论 STIP1在胶质瘤细胞中呈高表达,抑制STIP1表达可以抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭、促进凋亡,机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路有关。     

下调HOXA5表达对胶质瘤细胞增殖能力和细胞周期的影响

目的 探讨下调同源异型盒基因A5（HOXA5）表达对胶质瘤细胞增殖能力和细胞周期的影响。方法 应用生信分析方法,计算机检索CGGA数据库,下载mRNAseq-693和mRNAseq-325芯片数据,获取低级别胶质瘤（WHO分级Ⅱ级）和高级别胶质瘤（WHO分级Ⅲ、Ⅳ级）HOXA5 mRNA表达及病人生存信息;以HOXA5表达水平的平均值为界限,将高级别胶质瘤分为低表达组和高表达组。体外培养人胶质瘤细胞株U87和U251,使用Lipofectamine 2000法将HOXA5 siRNAs和阴性对照siRNAs分别转染U87和U251细胞;CCK-8和平板克隆形成实验评估胶质瘤细胞的增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期;免疫印迹法检测蛋白表达水平。结果 生信分析结果显示:高级别胶质瘤HOXA5表达水平均显著高于低级别胶质瘤（P<0.01）;HOXA5高表达组高级别胶质瘤病人中位生存时间较低表达组明显缩短（P<0.01）。体外细胞实验结果:敲低HOXA5表达,U87和U251细胞的增殖率和克隆集落数量显著降低（P<0.01）,U87和U251细胞G0/G1期细胞百分比显著增高（P<0.01）,U87和U251细胞CDK4蛋白表达水平显著降低（P<0.01）。结论 胶质瘤HOXA5呈高表达,病理级别越高,表达水平越高,病人生存预后越差。敲低HOXA5表达,明显降低CDK4表达,使细胞周期停滞在G0期,明显抑制胶质瘤细胞的增殖。     

lncRNA SNHG16对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的 探讨沉默长链非编码RNA核内小RNA宿主基因16（SNHG16）对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法 实时荧光定量PCR检测正常胶质细胞HEB、NHA和胶质瘤细胞A172、U251、U87、SHG-4中SNHG16的表达。用siRNA沉默U251细胞SNHG16的表达,分为NC-siRNA组和SNHG16-siRNA组,CCK-8法检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞侵袭,划痕实验检测细胞迁移。结果 与正常胶质细胞HEB和NHA比较,胶质瘤细胞A172、U251、U87和SHG-4的SNHG16表达水平明显升高（P<0.05）。与NC-siRNA组比较,SNHG16-siRNA组细胞增殖能力、细胞侵袭能力和细胞迁移能力均明显降低（P<0.05）。结论 SNHG16在胶质瘤细胞中高表达,特异性沉默SNHG16基因可以抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力。     

siRNA干扰整合素α_vβ_3表达抑制脑胶质瘤细胞U251增殖的实验研究

目的 探索特异性siRNA靶向干扰恶性胶质瘤U251细胞中INTα_vβ_3表达后对细胞生长的作用.方法 将INTα_vβ_3特异性siRNA经脂质体(LipofectamineTM~(2000))转染U251细胞.RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot法检测INTα_vβ_3蛋白表达.MTT检测干扰后细胞增殖变化.结果 INTα_vβ_3特异siRNA对U251细胞增殖有明显抑制作用.siRNA组、脂质体组与对照组各时间点的结果 差异有统计学意义.免疫细胞化学对照组和脂质体组均见INTα_vβ_3呈绿色表达,siRNA组表达降低.Western blot法和RT-PCR结果 证实转染特异siRNA后的细胞在蛋白及mRNA水平均能抑制INTα_vβ_3的表达.结论 特异性siRNA可干扰INTα_vβ_3在脑胶质瘤U251细胞中的表达并抑制细胞增殖.