大肠杆菌耐药质粒的头孢哌酮抗性基因克隆和定位

用鸟枪法从耐药质粒ｐＦＣ上克隆到头孢哌酮抗性基因。快速小规模制备质粒ＤＮＡ进行限制性酶切分析鉴定含重组质粒的克隆株，经多次传代，克隆株抗性表达稳定。多种限制性内切酶谱分析并构建重组质粒的物理图谱与质粒ｐＦＣ物理图谱比较，定位出头孢哌酮抗性基因在ｐＦＣ物理图谱上３２ｋｂ至４８ｋｂ区间内，其分子量约１６ｋｂ。该基因包含有ＥｃｏＲⅠ、ＳｍａⅠ、及ＰｖｕⅡ位点。     

大肠杆菌耐药质粒头孢哌酮抗性基因的研究

目的 通过对头孢哌酮抗性基因（CPZ^r)的性质研究，进一步探讨E.coliHX88108多质粒共存并介导第三代头孢菌素耐药的分子机理。方法 采用Nitrocefin法检测CPZ^r表达产物，用紫外线分光光度计测定β-内酰胺酶活性，采用试管二倍液体稀法进行CPZ^r克隆菌株对18种抗生素的敏感性测定，同时还进行头孢哌酮（CPZ）对CPZ^r克隆菌株耐药性诱导试验和温度敏感突变试验。结果 CPZ^r表达产物为β-内酰胺酶，其酶活性强且与耐药质粒pFC表达产物的活性基本一致。CPZ^r只编码对氨苄青霉素、第一、第二代头孢菌素和第三头孢菌素中CPZ的耐药性，而对其他抗生素敏感。实验结果还显示了质粒pFC经多次传代后介导CPZ的耐药性显著下降，诺氟沙星、氨基糖甙类耐药性消失。CPZ^r克隆菌株CPZ耐药性增加为药物诱导所致，而非温度敏感突变。结论 耐药基因CPZ^r是通过编码β-内酰胺酶介导产生CPZ耐药性的，在抗生素压力下，CPZ^r克隆菌株对CPZ的耐药可以显著增加。     

大肠杆菌耐药质粒头孢哌酮抗性基因的研究

目的　通过对头孢哌酮抗性基因 ( CPZΓ)的性质研究 ,进一步探讨 E.coli HX8810 8多质粒共存并介导第三代头孢菌素耐药的分子机理。方法　采用 Nitrocefin法检测 CPZΓ表达产物 ,用紫外线分光光度计测定β-内酰胺酶活性 ,采用试管二倍液体稀释法进行 CPZΓ克隆菌株对 18种抗生素的敏感性测定 ,同时还进行头孢哌酮( CPZ)对 CPZΓ克隆菌株耐药性诱导试验和温度敏感突变试验。结果　 CPZΓ 表达产物为 β-内酰胺酶 ,其酶活性强且与耐药质粒 p FC表达产物的活性基本一致。CPZΓ 只编码对氨苄青霉素、第一、第二代头孢菌素和第三代头孢菌素中 CPZ的耐药性 ,而对其他抗生素敏感。实验结果还显示了质粒 p FC经多次传代后介导 CPZ的耐药性显著下降 ,诺氟沙星、氨基糖甙类耐药性消失。CPZΓ 克隆菌株 CPZ耐药性增加为药物诱导所致 ,而非温度敏感突变。结论　耐药基因 CPZΓ 是通过编码 β-内酰胺酶介导产生 CPZ耐药性的 ,在抗生素压力下 ,CPZΓ 克隆菌株对 CPZ的耐药可以显著增加     

大肠杆菌头孢哌酮抗性基因亚克隆及序裂初步分析

为了确定耐药质粒所编码β－内酰胺酶衍化类型,用人介入临床分离出一大肠杆菌耐药质粒ｐＦＣ包哌酮抗性基因,经分段亚克隆,构建重组质粒ｐＦＢ１、ｐＦＢ２、ｐＦＢ３,对上述３个重要闰分别测序获得的抗生基因序列经Ｉｎｔｅｒｎｅｔ互联网同源性检索,表明该抗性基因部分序列,与肺炎克雷伯氏菌编码超广谱β－内酰胺酶ＴＥＭ－５２的抗性基因序列存在高度同源性（９７％）,提示ｐＦＣ头孢哌酮抗性基因所编码的β－内酰胺酶可能     

大肠杆菌头孢哌酮抗性基因亚克隆及序列初步分析

为了确定耐药质粒ｐ Ｆ Ｃ所编码β内酰胺酶衍化类型，用从临床分离出的大肠杆菌耐药质粒 ｐ Ｆ Ｃ头孢哌酮抗性基因，经分段亚克隆，构建重组质粒ｐ Ｆ Ｂ１、ｐ Ｆ Ｂ２、ｐ Ｆ Ｂ３ ，对上述 ３ 个重组质粒分别测序获得的抗性基因序列经 Ｉｎｔｅｒｎｅｔ互联网同源性检索，表明该抗性基因部分序列，与肺炎克雷伯氏菌编码超广谱β内酰胺酶 Ｔ Ｅ Ｍ５２ 的抗性基因序列存在高度同源性（９７％ ），提示ｐ Ｆ Ｃ头孢哌酮抗性基因所编码的 β内酰胺酶可能衍化自 Ｔ Ｅ Ｍ型。     

纳豆激酶基因重组质粒在大肠杆菌与毕赤酵母中的稳定性

利用PCR方法以纳豆杆菌染色体DNA为模板扩增纳豆激酶基因片段,分别克隆到原核表达载体pBV220与真核表达截体pPICZaA上,转化大肠杆菌HB101与毕赤酵母GS115,筛选重组子,通过限制性内切酶,PCR分析及序列测定,测定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因,对重组大肠杆菌与毕赤酵母中外源基因的稳定性进行研究比较,结果表明外源基因的插入对宿主菌的生长没有太大影响,重组质粒在E.coli HB101中具有良好的分离稳定性,而结构稳定性较差,而外源基因在毕赤酵母（GS115中很稳定。     

葡萄球菌耐药质粒转化大肠杆菌的实验研究

目的 探讨葡萄球菌与大肠杆菌间耐药性传递的可能性.方法 抽提金黄色葡萄球菌耐氯霉素质粒,转化至对氯霉素敏感的大肠杆菌体内,以氯霉素抑菌试验筛选获得耐药性的大肠杆菌,以琼脂糖凝胶电泳分析2菌耐氯霉素质粒的DNA分子大小.结果 成功获得对氯霉素耐药的大肠杆菌,且可从其培养物提取出与耐氯霉素会黄色葡萄球菌相同大小的质粒DNA.结论 葡萄球菌可能具有天然穿梭耐药质粒,在人工条件下可成功转化大肠杆菌使之获得耐药性.     

基于大量质粒序列研究耐药基因与重金属抗性基因共分布

目的:抗生素或重金属通过共选择机制促进携带耐药基因(ARG)和重金属抗性基因(MRG)的质粒在细菌中传播与扩散是形成耐药的重要因素,本研究通过已测序的大量质粒基因组数据分析ARGs和MRGs的共分布规律。方法:对已测序的17 387个细菌质粒基因组序列中的ARGs和MRGs进行重注释,并采用物理距离深度评估ARGs和MRGs之间的共分布关系。结果:6.7%质粒(1178个)同时携带ARGs和MRGs,携带的抗性基因数分别占ARGs总数的47.2%(7026/14882)和MRGs总数的57.5%(9856/17144);主要的ARGs为氨基糖苷、β-内酰胺和磺胺,主要的MRGs为汞、银、铜和砷;不同种类的MRG最近的ARG谱具有偏好性;与植物宿主质粒比较,来源于人类、动物和污染的环境宿主的质粒具有更高的ARG和MRG共分布频率,并且ARG和MRG之间的物理距离更短。结论:本研究结果对进一步认识通过质粒介导的ARG和MRG共转移导致耐药性而引发的健康风险具有重要意义。     

大肠杆菌yigP基因启动子的定位

在已知大肠杆菌yigP基因的最小功能片段为yigPP4P2基础上,将该片段装载于无外源启动子的载体质粒上,通过功能回补yigP基因缺陷株JDP14,发现其可以代替温敏质粒,保证大肠杆菌正常生长,推断其包含完整转录单元。RTPCR结果显示该片段内部有转录产物,即yigPP4P2片段具有转录独立性。将不同长度的yigPP4P2亚片段克隆到启动子探针质粒pSPZ上,通过对重组菌进行蓝白斑筛选及β半乳糖苷酶活性测定,结果显示pP40V3Z/JM83和pP40V4Z/JM83可观测到蓝色菌斑,并检测到较弱的β半乳糖苷酶活性,由此表明大肠杆菌yigP基因启动子位于该片段上游,下游边界位于引物V4区域内。     

Tropic 1808基因在大肠杆菌中的表达

目的;在大肠杆菌宿主系统中表达Ｔｒｏｐｉｃ１８０８基因编码的蛋白。方法：用ＰＣＲ方法从质粒中扩增出Ｔｒｏｐｉｃ１８０８ｃＤＮＡ开放阅读框架片段,并重组人表达载体ｐＥＴ－２１ａ中,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,用ＩＰＴＧ诱导Ｔｒｏｐｉｃ１８０８融合蛋白的表达,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,表达蛋白条带转至ＰＶＤＦ膜进行氨基酸序列分析,结果：构建了ｐＥＴ－２１ａ－１８０８重组质粒,外源性Ｔｒｏｐｉｃ１８０８基     

Characterization of cefoperazone resistance gene on plasmid pFC in E. coli HX88108]

OBJECTIVE: To investigate the characterization of cefoperazone resistance gene (CPZr) on plasmid pFC in E. coli HX88108 and inquire into the mechanism of resistance to CPZ at the molecular level. METHODS: E. coli HX88108 strain which demonstrated high-level resistance to cefoperazone (MIC, > 512 micrograms/ml) was isolated from a severely infected patient in 1988. Five plasmids coexisting in the strain were designated pFC, pFT1; pFT2, pFT3 and pFX, respectively. Four plasmids except pFX conferred CPZ resistance. Cefoperazone resistance gene (CPZr) has been cloned from plasmid pFC. beta-lactamase assays with Nitrocefin were performed. RESULTS: The expression product of CPZr was beta-lactamase. The high level beta-lactamase enzymatic activities against cephaloridine of CPZr transformants which were detected spectrophotometrically at 260 nm wave length demonstrated high level similarities to that of pFC. MICs of 18 antibiotics were determined according to a guideline of NCCLS by broth dilution method. CPZr transformants showed moderate level resistance to ampicillin, cefazolin, cefazolin, cefamandole and CPZ (MIC, 64 micrograms/ml). Meanwhile, susceptibility testing results demonstrated that the level of resistance to CPZ of pFC transformant in this study (MIC, 64 micrograms/ml) was much lower than that in 1988 (MIC, > 512 micrograms/ml) and resistance to nofloxacin and aminoglycosides was not observed. Induction experiment and temperature-sensitive mutation of CPZ resistance were performed. CPZr colonal strains revealed the higher-level of resistance to CPZ (MIC, 512 micrograms/ml) due to antibiotic CPZ induction rather than temperature sensitive mutation. CONCLUSION: This observation suggests that resistance to antibiotics encoded by plasmid might have been lower or lost under no antibiotic stress in a certain period, but higher under heavy stress.     

大肠杆菌HX88108膜孔蛋白初步研究

为了解大肠杆菌ＨＸ８８１０８耐药机理中有无膜孔蛋白缺失骑车,用十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳检测了大肠杆菌ＨＸ８８１０８的膜蛋白,并与膜孔蛋白标准株进行比较分析。     

质粒载体pUC19在头孢哌酮抗性基因(CPZ~r)克隆中的应用探讨

目的 :研究质粒pUC19是否为头孢哌酮抗性基因 (CPZr)分子克隆的理想载体。方法 :氯化钙法将质粒pUC19转化至工程菌E .coliDH5获得pUC19转化菌 ;采用试管二倍液体稀释法进行pUC19转化菌对 2 5种抗生素的敏感性测定 ;鸟枪法克隆耐药质粒pFC片段到载体pUC19获得含有CPZr 的重组质粒。结果 :pUC19转化菌对氨苄青霉素高度耐药 (MIC >2 5 6 μg/ml) ,对第一代头孢菌素中度耐药 ,对第二代头孢菌素中的头孢孟多耐药 ,而对头孢呋新敏感 ,在第三代头孢菌素中只对头孢哌酮耐药 (MIC ,6 4μg/ml) ,对其他第三代头孢菌素及 β 内酰胺酶抑制剂均高度敏感 ,同时敏感性测定结果还发现pUC19转化菌对氟喹诺酮类和氨基糖甙类抗性素均敏感。pUC19作为载体克隆到含有头孢哌酮抗性基因 (CPZr)的重组质粒少 ,克隆效率低 ,未能达到预期的目标。结论 :pUC19不适合作为CPZr 的克隆载体。     

大肠杆菌HX88108膜孔蛋白初步研究

为了解大肠杆菌ＨＸ８８１０８耐药机理中有无膜孔蛋白缺失参与,用十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）检测了大肠杆菌ＨＸ８８１０８的膜孔蛋白,并与膜孔蛋白标准株进行比较分析。结果发现：大肠杆菌ＨＸ８８１０８具有膜孔蛋白ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣ,其耐药与膜孔蛋白缺失所致的抗生素进入减少无关     

耐头孢酮的的E.coliHX88108株的β—内酰胺酶研究

近年国外报道许多对第三代头孢菌素耐药的细菌是由于产生新的β－内酰胺酶所致，为探讨耐头孢哌酮的Ｅ．ｃｏｌｉＨＸ８８１０８及其４株转化菌ＰＦＣ，ＰＦＴ１ＰＦＴ２ＰＦＴ３的β－内酰胺酶性质，进行了β－内酰胺酶底物轮廓测定，酶抑制剂棒酸和舒巴坦敏感性研究以及薄层分析性等电聚焦电泳。     

人肥胖基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆中国人的肥胖基因，并在大肠杆菌中高效表达人瘦素蛋白。方法 用RT-PCR从培养的中国人脂肪细胞提取的总RNA中扩增出肥胖基因，与TA载体连接后进行核酸序列测定．并将该基因定向克隆至高效表达质粒pBV220，在大肠杆菌中表达。结果 克隆出中国人肥胖基因，其cDNA序列与献报道的一致，构建了重组质粒pBV220-OB，并成功地实现了人肥胖基因在大肠杆菌中的表达。结论 人肥胖基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达，为进一步研究该基因在肥胖症及其相关疾病中的作用，以及在脂肪代谢与脂肪细胞分化中的调控机制奠定基础。     

大肠杆菌硫氧还蛋白基因的克隆及序列测定

目的：获取大肠杆菌硫氧还氧白基因，并进行序列测定，为今后研究其机理及应用创造条件。方法：用ＰＣＲ法从大肠杆菌ＤＮＡ中扩增ｔｒｘＡ基因编码区，重组人ｐＵＣ１９质粒载体，用双脱氧法测定目的基因序列。结果：从大肠杆菌中成功的扩增到ｔｒｘＡ基因，测出的序列与已知基因序列一致。结论：构建了ｔｒｘＡ基因的重组克隆，为以后的深入研究奠定了基础。     

人内皮抑素基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人内皮抑素基因并在大肠杆菌中表达。方法 采用PCR技术进行内皮抑素基因的克隆，并使基因定向插入表达载体PGEME－1中经IPTG诱导获取表达。结果 经DNA序列分析，人内皮抑素基因序列完全正确，经SDS－PAGE分析，出现一条特异性蛋白质条带，大小与基因10和人内皮抑素蛋白的大小的总和相符合。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得融合表达。