人NaDC1基因近端启动子生物信息学分析及载体构建

目的对人NaDC1（hNaDC1）基因近端启动子进行生物信息学分析,预测可能的调控区域及顺式元件,并构建相应基因序列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。方法使用First EF程序分析并获得hNaDC1基因近端启动子序列,使用MatInspector5.0软件对近端启动子序列中的转录因子结合位点进行预测。PCR法扩增hNaDC1基因近端启动子序列,PCR产物经KpnⅠ和HindⅢ双酶切后定向克隆到pGL3-Basic载体。重组质粒行KpnⅠ和HindⅢ双酶切及测序鉴定。结果使用FirstEF程序获得长度为2.4kb（-2232/＋136）的hNaDC1基因近端启动子序列。MatInspector5.0程序分析显示该基因序列共含有152个74种顺式作用元件。KpnⅠ和HindⅢ双酶切及测序鉴定证实构建的pGL3-hNaDC1A质粒插入片段正确无误。结论成功构建hNaDC1基因近端启动子转录调控序列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体,为利用双荧光素酶报告基因检测系统研究hNaDC1基因近端启动子转录调控元件的分布及其性质提供了基本试验条件。     

EOLAl基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.     

EOLA1基因5'侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(endothelial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1)基因5'侧翼区的调控序列.方法通过基因组步移克隆EOLA1基因5'侧翼区不同长度的片段,插入β-半乳糖苷酶(β-gal)报告基因载体,分析各片段在ECV304细胞中的β-gal调节活性.结果含EOLA1基因5'侧翼区-1～-2 659 bp和-1～-1 951 bp序列的重组质粒在ECV304细胞中能明显表现β-gal上调活性,而-1～-361 bp序列的重组质粒活性无明显变化.结论 EOLA1基因5'侧翼区-361～-1 951 bp内存在基因转录启动子元件.     

EOLA1基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.     

hfgl2凝血酶原酶基因5′端调控序列的克隆及生物信息学分析

目的扩增人纤维蛋白原样蛋白2(hfgl2)凝血酶原酶基因5′端调控序列,构建荧光素酶报告基因表达载体,对hfgl2基因5′侧翼启动子序列进行生物信息学分析,预测可能的调控区域及顺式作用元件。方法用聚合酶链反应(PCR)法从人外周血单个核细胞基因组DNA中扩增hfgl2凝血酶原酶基因5′端调控序列,PCR产物酶切后克隆至pGL3-Basic载体,重组质粒行酶切及测序鉴定,使用在线分析软件对5′端调控序列中的转录因子结合位点及启动子序列进行预测。结果扩增了长度为1 567bp的hfgl2凝血酶原酶基因5′端序列,酶切及测序鉴定证实构建的pGL3-hfgl2质粒插入片段正确无误,分析显示该基因序列共含有138个、31种顺式作用元件。结论构建hfgl2基因近端启动子转录调控序列荧光素酶报告基因的表达载体为研究hfgl2的转录调控奠定了基础。     

肺动脉高压患者Ⅱ型骨形成蛋白受体基因启动子-142G>A突变的研究

目的 探讨Ⅱ型骨形成蛋白受体(BMPR2)基因启动子突变与肺动脉高压发病的关系.方法 对1例家族性肺动脉高压(FPAH)、19例特发性肺动脉高压(IPAH)患者和50名健康成人进行BMPR2基因启动子区转录起始点上游-2022 bp的DNA序列测定.分别将突变型和野生型BMPR2基因启动子区片段插入pGL3-basic双荧光素酶报告基因载体中,获得pGL3-BMPR2启动子-突变型重组质粒和pGL3-BMPR2启动子-野生型重组质粒.以2种重组质粒分别转染人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)和人肺动脉内皮细胞(HPAEC),用Veritas微孔板发光检测仪检测突变型和野生型BMPR2基因启动子区片段在2种细胞中的转录调控活性(结果以萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶活性比值表示).应用MAPPER软件分析突变型和野生型BMPR2基因启动子区转录因子结合位点.结果 在1例36岁女性FPAH患者的BMPR2基因启动子区发现杂合子突变-142G>A.突变型BMPR2基因启动子片段在HPASMC和HPAEC中的转录活性(分别为9.58±3.85、59.07±25.54)均明显低于野生型(分别为16.80±3.55、115.58±38.02,均P<0.05),而且缺失转录因子Sp3结合位点.结论 BMPR2基因启动子-142G>A突变可能与FPAH发病有关.     

乙型肝炎病毒X蛋白对SNAI1基因启动子转录活性调控的作用

目的 观察乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对SNAI1基因启动子活性是否存在调控作用,并明确SNAI1启动子区重要的转录激活调控序列.方法 运用分子克隆技术,构建一系列5'端缺失,保留共同3'端的SNAI1启动子荧光素酶报告质粒.将报告质粒分别与内参pRL-TK质粒、HBx重组腺病毒载体共转染人肝癌SMMC7721细胞,检测各组相对荧光素酶活性.结果 酶切鉴定及DNA测序证实SNAI1基因系列启动子荧光素酶报告质粒构建成功.HBx共转染下的系列启动子缺失实验发现,HBx能显著上调SNAI1基因启动子(-869～+59)活性[SNAI1(-869)Luc:无处理组6.17±0.08,阴性对照组6.09±0.44,实验组12.52±0.72,P<0.01],其转录调控序列定位于SNAI1基因启动子区-869～-514之间.结论 HBx可有效激活SNAI1基因转录表达,SNAI1启动子区存在HBx作用的重要转录活性调控序列,提示了HBx促进肝癌侵袭转移的新路径.     

二甲双胍和LPS通过转录因子RUNX2调控NFATc2基因的转录

目的 构建人T细胞活化核因子C2（NFATc2）基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-NFATc2-promoter,检测其转录活性,探究二甲双胍和脂多糖对其转录活性的影响。方法 利用UCSC网站查找人NFATc2基因的启动子序列并设计上下游引物PCR扩增人NFATc2基因启动子片段;用限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ双酶切质粒pGL3-basic,将人NFATc2基因启动子片段插入到pGL3-basic质粒,重组质粒命名为pGL3-NFATc2-promoter。将pGL3-NFATc2-promoter与内参质粒pRL-TK共转染293F细胞,检测其荧光素酶活性。同时构建人NFATc2基因启动子不同片段长度的报告基因载体并进行荧光素酶活性检测,分别给予不同浓度的二甲双胍和脂多糖处理24 h后检测二甲双胍和脂多糖对NFATc2转录活性的影响。进一步突变NFATC2基因启动子上转录因子RUNX2的结合位点探究二甲双胍和脂多糖对NFATc2的转录调控作用。结果 研究成功构建了不同片段长度（2170、2077、1802、1651、1083、323 bp）的人NFATC2基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-NFATc2-promoter,经酶切及测序鉴定完全正确。将不同片段长度的pGL3-NFATc2-promoter转染到293F细胞,发现pGL3-1651 bp具有最高转录活性,荧光素酶活性约为pGL3-2170 bp的3.3倍（1.8433±0.1457 vs 0.5467±0.0850）。中浓度（5 mmol/L）和高浓度（10 mmol/L）的二甲双胍分别上调pGL3-1651 bp的转录活性多达2.5、3倍（1.3467±0.1601 vs 0.8867±0.0321,1.8124±0.2771 vs 0.8867±0.0321）。不同剂量的脂多糖均能上调pGL3-1651 bp的转录活性不低于1.6倍（1.4813±0.0616 vs 0.8867±0.0321）。突变pGL3-1651 bp上的RUNX2结合位点后,二甲双胍和脂多糖上调的pGL3-1651 bp转录活性均受到抑制,转录活性下降（2.1667±0.1527 vs 1.233±0.1155;2.3667±0.2887 vs 1.1333±0.3786）。结论 pGL3-NFATc2-promoter在293F细胞中能被转录激活,并证实脂多糖和二甲双胍转录激活pGL3-NFATc2-promoter依赖于转录因RUNX2。     

小鼠PGC-1α基因启动子的转录调控功能分析

目的 克隆小鼠PGC-1α基因的启动子并分析其转录调控模式.方法 设计引物,以小鼠肝脏组织DNA 为模板,PCR扩增PGC-1α基因启动子区并克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic 中,构建具有PGC-1α启动子转录活性的报告质粒pGL3-PGC-1α-Luc.通过特异性引物,引入替换碱基突变相关转录因子调控模序,构建点突变融合载体,并将其转染1c1c7 及c2c12 细胞系,检测荧光素酶的表达情况.结果 构建的pGL3-PGC-1α-Luc 系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA 测序分析都显示正确;PGC-1α基因启动子区域（-2533~＋78）具有较强的转录活性;突变失活PGC-1α基因启动子区域中的CRE及IRE反应原件导致转录活性明显降低.结论 成功构建小鼠PGC-1α基因启动子报告质粒,PGC-1α基因上游区域（-2533~＋78）具有较强的启动子活性;启动子区域中的CRE和IRE反应原件为主要转录调控位点.     

CCR5基因5′侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的 :研究CCR5基因 5′侧翼区的调控序列。方法 :分段构建CCR5基因 5′侧翼区的pCAT报告基因载体 ;分析各片段在Hela细胞中的CAT调节活性。结果 :CCR5基因 5′侧翼区基因 - 1～ - 4 86bp序列的pCAT重组质粒在Hela细胞中能明显表现CAT上调活性 ,其活性比pCATenhancervector的活性高 3倍。结论 :CCR5基因 5′侧翼区基因 - 1～ - 4 86bp序列中存在基因转录上调元件     

沙眼衣原体ompA基因克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆D型沙眼衣原体(Ct)ompA基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,为核酸疫苗的研制作准备.方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的的基因的表达.结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段;序列测定证实与GenBank登陆的D型Ct一致;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa中获得表达.结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞表达,为进一步研究Ct致病机制及DNA疫苗的研究提供理论依据.     

Ｌｉｍｓ Ｅ：一个新的ＬＩＭ同源域基因的克隆和初步分析

目的:克隆与分析小鼠不同剪切的Lims基因.方法:应用巢式RT-PCR,以小鼠cDNA为模板,扩增Lims基因不同剪切子,构入PinPointTM Xa-1T质粒,测序鉴定.结果:测序表明克隆了新的Lims基因变异剪切体Lims E,该变异剪切体编码区为1 164 bp.编码387个氨基酸.结论:比较基因组学分析显示,成功地克隆了一新的小鼠Liras基因剪切子Lims E,为进一步研究Lims基因在细胞发育中的功能打下了基础.     

哺乳动物性别决定基因的研究进展

目的了解哺乳动物性别决定基因的作用与功能。方法查阅本领域国内外文献并进行综述。结果SRY、SOX9、WT1、SF1、AMH及DAX1等基因都参与哺乳动物性别决定。结论性别决定基因的研究对性分化与发育异常等临床疾病的诊断和治疗具有十分重要的意义。     

穿梭质粒pZH32的构建

以pS189、pSV_2gpt、pMCi5为材料,构建了以EB病毒为基础,以酪氨酸tRNA琥珀突变校正基因SupF为靶基因,以黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因Eco gpt为选择标记基因的穿梭质粒pZH32。pZH32长9.4kb,克服了以SV40为基础的穿梭质粒自发突变率高以及宿主范围局限的缺点。SupF基因遗传背景清楚,长度126bp,便于进行序列分析。gpt基因使转化克隆的筛选更加方便。有利于建立一种化学诱变剂的分子检测系统,研究基因突变的类型和突变机制。     

人B7-1/Sart3融合基因的克隆和表达

目的：构建人共刺激分子CD80(B7-1)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(Sart3)融合基因真核表达载体，并分别在原核和人成纤维细胞中表达。方法：采用RT-PCR技术，从人胎盘组织抽提的总RNA中克隆Sart3基因的部分cDNA序列(第1～1281bp)．此段序列包括已报道的能诱导HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞的抗原表位。然后将不含终止密码子的B7-1 cDNA和Sart3 cDNA共克隆入真核表达载体pEGFP-N1，测定核苷酸序列确定重组成功后，分别转染大肠杆菌和人成纤维细胞，利用流式细胞仪和Western blot检测B7和Sart3的表达。结果：构建人B7、Sart3融合基因真核表达载体B7sart3／pEGFPN。测序结果与GenBank的B7、Sart3相应序列(NM_005191、NM_014706)一致．阅读框无改变。流式细胞仪测定发现在转染的人成纤维细胞表面有明显的荧光增强．免疫印迹发现融合蛋白可以与抗B7抗体反应，融合蛋白分子量与B7-Sart3-EGFP的预测分子量相当。结论：成功构建真核表达载体B7Sart3／pEGFPN，并在人成纤维细胞中表达。为下一步研究将SART3蛋白作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的生物治疗打下基础。     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

Rh(-)献血者128例基因分型

目的：探讨Rh(-)献血者RhD基因分型的临床意义。方法：采用PCR－－SSP技术检测郑州市128例Rh（－）献血者的RhD基因结构，用氯仿／三氯甲烷法放散检测D^u检测，结果：RhD基因多态性存在3种基本形式，其中外显子完整存在32例（25．00％），全部为D^u型，完全缺失85例（66．41％），部分缺失11例（8．59％），其中2例为D^u型。结论：RhD基因的丰富多态性对于确保输血安全具有指导意义。     

肿瘤特异性报告基因载体的构建

目的：将构建一种能在肿瘤组织中进行肿瘤行异性表达的逆转录病毒载体，增强肿瘤基因治疗的靶向性。方法：PCR法获得HER2基因的启动子片段并将其克隆至逆转录病毒载体P^LXSN中，再将突变型绿色荧光蛋白（mtGFP)基因克隆至该启动子下游。结果：质粒P^LHSN经EcoR I和BamH I酶切后可切出510bp和5.8kb两条片段；质粒P^LHGSN经BamH I酶切可切出520bp和6.7kb两条片段。结论：成功构建了携带HER2基因启动子和mtGFP报告基因的逆转录病毒载体。     

慢性胃炎胃粘膜上皮细胞中bax、fas、p16基因的表达

目的:探讨bax、fas和p16在胃粘膜病变发生发展过程中的作用及意义.方法:应用免疫组织化学方法,检测慢性浅表性胃炎(CSG)和轻、中、重度慢性萎缩性胃炎(CAG)患者胃粘膜上皮细胞中bax、fas(促凋亡基因)和p16(增殖负调控基因)基因蛋白的表达情况.结果:CSG和轻、中、重度CAG胃粘膜中bax的表达率分别为41.75%、72.41%和78.26%,fas的表达率分别为39.81%、65.52%和78.26%,p16的表达率分别为9.71%、24.14%和30.43%.轻、中、重度CAG与CSG比较,bax、fas、p16的表达差异有显著性意义P<0.05～0.01.轻、中、重度CAG间比较,差异无显著性意义.结论:bax、fas和p16的高表达,使得细胞增殖/凋亡的比例失衡,在胃粘膜病变的发生发展中可能有重要意义.     

应用RNA干扰抑制目的基因在小鼠体内表达

目的研究RNA干扰(RNAi)对体外和体内基因表达的沉默作用。方法以PCR方法从基因组DNA中克隆出依赖于RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子,并用于驱动RNAi片段的合成;构建特异性针对目的基因(绿色荧光蛋白,GFP)的RNAi载体(Pi)。将RNAi干扰载体和GFP载体转染NIH3T3细胞,应用荧光显微镜观察、RT-PCR、流式细胞技术(FACS)分析上述细胞中RNAi对目的基因GFP表达的抑制效果,进一步在个体水平将RNAi载体注入小鼠体内,研究RNAi对GFP表达的抑制情况。结果RNAi能有效地使NIH3T3细胞中GFP表达量降低约60%以上,并能有效地抑制GFP在转基因小鼠体内的表达。结论RNAi技术能抑制目的基因在体内外的表达,是一种有效的基因治疗工具。