三丁酸甘油酯诱导白血病细胞分化及凋亡机制的研究

为了探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂三丁酸甘油酯（tributyrin,TB）诱导NB4、K562白血病细胞分化和（或）凋亡的作用机制,利用Western blot方法及逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测TB作用前后NB4、K562细胞组蛋白H3乙酰化水平以及p21^WAF1表达量的改变.结果表明：NB4（或K562）细胞经TB0.1 mmol/L（或TB 0.5 mmol/L）作用16小时后可见组蛋白H3乙酰化水平明显上升,并有剂量依赖效应.NB4、K562细胞经TB 0.1 mmol/L作用后可见p21^WAF1 mRNA表达上调,且具有剂量依赖效应.p21^WAF1 mRNA的这种上调开始于TB作用2小时后,16小时达高峰,可维持48小时.结论：TB诱导NB4、K562细胞发生分化和（或）凋亡的机制与TB引起细胞组蛋白高乙酰化和继而上调p21^WAF1表达有关.     

异硫氰酸苯己酯对Molt-4细胞组蛋白甲基化、乙酰化调控的实验研究

目的 研究异硫氰酸苯己酯（PHI）在体外对淋巴细胞白血病Molt-4细胞系的作用，观察PHI对Molt-4细胞组蛋白甲基化、乙酰化调控的影响。方法 采用MTT法、克隆抑制实验观察PHI对Molt-4细胞增殖的影响；采用流式细胞术检测PHI诱导细胞凋亡和对细胞周期的影响；用Western blot法观察PHI作用后细胞的组蛋白乙酰化酶、组蛋白甲基化及乙酰化状态的变化。结果 PHI可上调Molt-4细胞组蛋白乙酰化酶P300／CBP水平，显著提高组蛋白H3、H4乙酰化及H3K4甲基化水平，抑制组蛋白甲基化H3K9表达，阻滞细胞于G0／G1期，并诱导细胞凋亡。结论 PHI可能是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，同时能调控组蛋白甲基化，影响其表观遗传学，可能作为新的抗白血病治疗药物。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对多发性骨髓瘤细胞MM1R的抑制作用

本研究探讨新一代组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589单药或者联合蛋白酶体抑制剂硼替佐米,对多发性骨髓瘤(MM)细胞的抗瘤效应。采用MTT法检测LBH589(10、20、50 nmol/L)及50 nmol/L分别联合硼替佐米(10、20 nmol/L)作用于人多发性骨髓瘤MM1R细胞24,48 h后的细胞增殖抑制作用;采用流式细胞术检测LBH589对MM1R细胞周期和细胞凋亡的影响;采用Western blot分析LBH589(10、20、50 nmol/L)作用MM1R细胞24 h后组蛋白H4乙酰化的程度。结果表明,LBH589单药及与硼替佐米联合均能够抑制MM1R细胞增殖,并与药物浓度和作用时间呈正相关。MM1R细胞经药物作用48 h后,G0/G1期细胞逐渐增多,G2/M期及S期细胞逐渐减少,细胞阻滞在G0/G1期,同时可见MM1R细胞的凋亡率增加,作用呈浓度依赖性,且LBH589与硼替佐米联合作用均较单药作用更加明显(均P<0.001);Western blot分析显示,不同浓度LBH589作用MM1R细胞24 h后组蛋白H4乙酰化的程度上调,呈浓度依赖性。结论:LBH589能够抑制MM1R细胞增殖,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡,且与硼替佐米联合对骨髓瘤细胞有协同作用。     

脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠体外诱导Kasumi-1细胞分化和凋亡作用

目的 探讨组蛋白脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠(PB)体外阻断AML1-ETO的生物学功能，消除AML1-ETO的转录抑制，诱导Kasumi-1细胞生长抑制、分化和凋亡作用。方法 应用MTT比色法观察PB对细胞的生长抑制作用，普通光学显微镜和透射电镜观察细胞形态和结构改变，流式细胞术分析细胞周期和检测髓系分化抗原的表达，Annexin V标记、DNA凝胶电泳和流式细胞术分析细胞凋亡。结果 ①PB明显抑制Kasumi—1细胞的生长，半数抑制浓度(IC50)约为2．3mmol/L；②经PB作用后细胞阻滞于G0／G1期，伴有S期细胞减少；③PB可诱导Kasumi—1细胞髓系分化抗原CD11b和CD13表达增加，并呈剂量和时间依赖性；④PB诱导Kasumi-1细胞凋亡，呈时间剂量依赖性，PB3mmol/L培养2d早期凋亡细胞增加，培养3d晚期凋亡细胞增加，培养5d出现明显DNA梯形条带；⑤处理后的细胞出现单核细胞样分化和凋亡细胞形态改变。结论 脱乙酰化酶抑制剂PB抑制Kasumi—1细胞生长，使细胞阻滞于G0／Gl期；诱导细胞部分分化和凋亡。     

去乙酰化酶抑制剂Scriptaid对骨髓瘤IM9细胞的影响及作用机制

目的:研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid对骨髓瘤细胞IM9的生物学作用,并初步探讨Scriptaid诱导其凋亡的作用机制。方法:选用多发性骨髓瘤细胞IM9,应用CCK8法检测Scriptaid对IM9细胞活力的影响,流式细胞术检测Scriptaid对IM9细胞周期及凋亡的影响,应用RT-PCR技术鉴定Scriptaid诱导凋亡的相关靶基因,进一步通过报告基因检测Scriptaid对p21启动子活性的影响。结果:去乙酰化酶抑制剂Scriptaid抑制IM9细胞的活力,且呈浓度依赖性(r=0.9865)。Scriptaid能够使IM9细胞阻滞在G2/M期,伴随着药物浓度升高,G2/M期细胞比例显著增高(r=0.9845)。Scriptaid对IM9细胞凋亡有明显的促进作用,凋亡相关蛋白Caspase 9、Caspase 3以及PARP1被激活。Scriptaid处理IM9细胞后,凋亡相关因子BAD、PTEN及p21表达升高,其中p21启动子的活性被显著激活。结论:去乙酰化酶抑制剂Scriptaid可以通过转录激活p21促进IM9细胞的凋亡。     

丙戊酸钠对Kasumi-1细胞细胞周期的阻滞作用及其机制探讨

目的 研究组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂丙戊酸钠(VPA)对白血病细胞系Kasnmi-1细胞周期的影响并探讨其分子机制.方法 不同浓度VPA处理Kasumi-1细胞不同时间,碘化丙锭染色流式细胞术分析细胞周期的变化.RT-PCR及Western blot方法 分析细胞周期蛋白D1(cyclin D1)及周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21 WAF1/CIP mRNA或蛋白水平变化.结果 ①VPA抑制Kasumi-1细胞的细胞周期,使其阻滞于G0/G1期.3 mmol/L VPA处理3 d,G0/G1期细胞由(50.7±2.8)%上升至(80.7±1.7)%.②以3 mmol/LVPA处理Kasumi-1细胞不同时间,与对照组比较,3 mmol/L VPA组cyclin D1 mRNA表达水平下调;以不同浓度VPA处理Kasumi-1细胞3 d,结果 发现随着VPA药物浓度增加cyclin D1 mRNA表达水平降低,呈现剂量依赖性.③VPA诱导p21WAF1/CIP mRNA表达明显增加,呈现时间及剂量依赖性.不同浓度VPA处理细胞3 d时,随着用药浓度的增加,p21WF1/CIP蛋白相对表达水平增加,3 mmol/L VPA处理细胞2 d与0 d比较,p21 WAF1/CIP蛋白相对表达水平明显增加(2.498±0.240对0).结论 VPA可以通过对cyclin D1及周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21WAF1/CIP调节使Kasumi-1细胞周期阻滞于G0/G1期.     

长春花碱诱导MOLT-4细胞产生M期细胞阻滞的初步研究

本研究探讨化疗药物M期阻滞剂长春花碱（vinblastine,VLS）对MOLT-4急性淋巴细胞白血病细胞株产生的生物学影响并分析其意义。0．05μg／ml的VLS诱导MOLT-4细胞0-12小时产生M期细胞阻滞和／或细胞凋亡,流式细胞术检测DNA直方图和共聚焦显微镜观测细胞形态,采用阻滞增长率、阻滞效率、凋亡率及形态学指标分析阻滞前后的细胞周期分布、凋亡和细胞形态变化。结果表明,细胞阻滞可不伴随有凋亡率的显著增加;细胞阻滞的流式DNA直方图呈时间依赖的细胞周期分布动态改变,阻滞程度可量化;M期阻滞伴随有S期细胞堆栈;阻滞后细胞增殖率减低;M期阻滞细胞具有特征性细胞分裂的形态学特征。结论：长春花碱能单独诱导MOLT-4细胞M期阻滞,M期细胞阻滞的流式细胞检测和形态学特征的研究有助于进一步研究细胞阻滞与凋亡、检测点机制和抗癌新药开发提供参考。     

蛋白酶体抑制剂MG132对姜黄素诱导K562和Raji细胞HDAC1、P300表达的研究

近年来的研究显示泛素-蛋白酶体通路在细胞组蛋白乙酰化、去乙酰化的调控中发挥了重要的作用.有研究报道姜黄素可抑制肿瘤细胞增殖,影响细胞周期,姜黄素可通过调节组蛋白乙酰化、去乙酰化而发挥其作用.我们通过探讨姜黄素和蛋白酶抑制剂MG132联含姜黄素作用K562细胞、Raji细胞对组蛋白乙酰化酶（HDAC1）、P300蛋白的影响进一步明确了姜黄素发挥作用是否是通过泛素-蛋白酶体通路.     

转染p21WAF1基因降低K562细胞对VP-16的敏感性

为探讨p21^WAF1对K562细胞药物敏感性的谳节作用及其对VP－16诱导的K562细胞凋亡的影响，构建了p21^WAF1逆转录病毒表达载体，体外转染白血病细胞系K562。经RT－PCR和Western印亦检测得到稳定表达p21^WAF1的K562－p21^WAF1细胞克隆后，用MTT法和存活细胞计数法检测转染p21^WAF1的K562细胞对VP－16在剂量和作用时间上的敏感性变化，用DNA凋亡片段分析和流式细胞术检测其对VP－16诱导的K562细胞凋亡的影响。实验结果显示，外源性p21^WAF1的表达明显降低了VP－16诱导的K562细胞凋亡，降低了K562细胞对VP－16的敏感性。以上结果表明，p21^WAF1能通过抑制K562细胞的凋亡来降低其对VP－16的敏感性。     

三丁酸甘油酯对白血病细胞株SHI-1体外作用的研究

目的　探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂三丁酸甘油酯 (TB)体外诱导白血病细胞株SHI 1生长抑制、分化和凋亡作用 ,并对其作用机制进行初步研究。方法　应用细胞计数、锥虫蓝拒染法观察TB对细胞的生长抑制作用 ,通过细胞形态学观察、NBT还原实验、细胞表面抗原CD11b和CD14的检测、Annexin标记、DNA凝胶电泳等方法分析TB对SHI 1细胞的诱导分化及凋亡作用。通过West ernblot方法及逆转录聚合酶链反应检测TB作用前后细胞组蛋白H3乙酰化水平以及 p2 1WAF1/CIP1表达量的改变。结果　①TB可以抑制SHI 1细胞的增殖及活力 ,呈剂量 时间依赖关系。②TB 0 .1mmol/L可诱导SHI 1细胞发生部分分化 ,NBT阳性率升高 ,细胞表面CD11b、CD14表达上调。③SHI 1经TB 0 .5～ 1.0mmol/L作用 4 8h ,出现典型的凋亡形态学改变。细胞AnnexinⅤ结合力明显上升 ,并可见典型的DNA梯形条带。TB作用后SHI 1细胞组蛋白H3乙酰化水平升高以及 p2 1WAF1/CIP1表达上调。结论　TB能抑制SHI 1细胞的增殖并影响细胞活力 ,诱导SHI 1细胞分化和凋亡 ,其机制与TB引起组蛋白乙酰化水平升高、继而上调 p2 1WAF1表达有关。     

Effects of cisplatin, 5-fluorouracil, and radiation on cell cycle regulation and apoptosis in the hypopharyngeal carcinoma cell line

In head and neck cancer including hypopharyngeal cancer, cisplatin and 5-fluorouracil (5-FU) usually have been used as neoadjuvant chemotherapeutic agents. We investigated the effects of cisplatin, 5-FU and radiation on p53 protein expression and cell responses (cell cycle arrest and/or apoptosis) in the hypopharyngeal carcinoma cell line (PNUH-12; mutant type p53). PNUH-12 cells were treated with cisplatin, 5-FU and radiation. The changes in the cells were assessed by a cell cytotoxicity assay, Western blotting (p53 and p21(WAF1/CIP1) proteins), a DNA fragmentation assay, propidium iodide (PI) staining and DNA flow cytometry. The expression of p53 protein was increased after treatment with cisplatin and 5-FU, but not radiation. The expression of p21(WAF1/CIP1) protein was increased only after treatment with 5-FU, not cisplatin or radiation. With cisplatin and radiation, we observed apoptosis both by DNA fragmentation and PI staining and increased S phase in cisplatin and G2 phase in radiation by DNA flow cytometry. But, with 5-FU, we could not observe apoptosis by DNA fragmentation and PI stain but only an increased G1 phase by DNA flow cytometry. In PNUH-12, radiation induced p53-independent apoptosis and p21(WAF1/CIP1)-independent G2-phase cell cycle arrest. Cisplatin induced p53-dependent apoptosis and p21(WAF1/CIP1)-independent S-phase cell cycle arrest and 5-FU induced p53 and p21(WAF1/CIP1)-dependent G1-phase cell cycle arrest, not apoptosis. Cisplatin and 5-FU induced p53-dependent pathways, but radiation p53-independent pathway. The cell responses by cisplatin, 5-FU and radiation were all different pathways.     

直流电治疗对人肝癌细胞SMMC7721凋亡的诱导作用

研究电化学治疗对人肝癌细胞系ＳＭＭＣ７７２１凋亡的诱导作用及其机制,为ＥＣＴ治疗的临床应用提供依据。方法采用体外模型研究ＥＣＴ的效应。以ＡｎｎｅｉｎＶ标记法、ＤＮＡ含量测定、电子显微镜等方法观察了ＥＣＴ对人肝癌细胞系ＳＭＭＣ７７２１凋亡的诱导作用及对细胞周期的阻滞效应。     

苯丁酸钠通过上调p21 WAF1/CIP1基因抑制白血病细胞系的细胞周期

目的研究组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂苯丁酸钠(PB)对白血病细胞系细胞周期的影响,探讨其分子机制.方法PB处理白血病细胞系Kasumi-1、U937和NB4细胞,分别于处理后24,48和72 h收集细胞.碘化丙锭DNA染色,流式细胞术分析细胞周期的变化.半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析细胞周期相关基因p21WAF1/CIP1表达的变化.在人肾上皮细胞系293T细胞用荧光素酶报告基因分析PB对p21WAF1/CIP1基因启动子活性的影响.结果PB可以抑制Kasumi-1、U937和NB4细胞的细胞周期,作用呈时间和剂量依赖关系.3 mmol/L PB作用72 h,分别使Kasumi-1、U937和NB4细胞的G0/G1期细胞比例增加42.03%、44.36%和26.82%,S期细胞比例减少31.86%、38.91%和26.77%.PB使Kasumi-1、U937和NB4细胞p21WAF1/CIP1表达增高.PB处理后,p21WAF1/CIP1的表达水平较处理前增高(2.06±0.27),(2.78±0.40)和(1.78±0.20)倍.PB可以上调p21WAF1/CIP1启动子的转录活性,且呈剂量依赖关系.3 mmol/L PB处理48 h使转录活性增高(5.74±0.93)倍.PB上调p21WAF1/CIP1启动子转录活性主要是依赖于转录起始位点上游101 bp的序列.结论PB可以抑制白血病细胞系的细胞周期,这种作用可能是通过上调细胞周期相关基因p21WAF1/CIP1的表达实现的.     

Decitabine,a DNA methyltransferases inhibitor,induces cell cycle arrest at G2/M phase through p53-independent pathway in human cancer cells

Decitabine (5-aza-2′-deoxycytidine), an inhibitor of DNA methyltransferases, has a wide range of anti-metabolic and anti-cancer activities. Decitabine also induces cell cycle arrest at G2/M phase and apoptosis in human cancer cells. However, the cellular and molecular mechanisms of this cell cycle arrest are poorly understood. In the present study, we investigated the roles of the tumor suppressor p53 and the cyclin-dependent kinase (Cdk) inhibitor p21 following decitabine-induced G2/M arrest in human cancer cells. DNA flow cytometric analyses indicated that decitabine induced a G2/M arrest in AGS gastric and A549 lung carcinoma cell lines, which have wild type p53. Western blot analyses using whole cell lysates from AGS cells demonstrated that decitabine treatment did not change the steady-state level of Cdks and Cdk inhibitor p27, but it partially inhibited expression of cyclin A, cyclin B1, and Cdc25C proteins. However, similar results were found using the A549 cell line, where decitabine induced a dramatic up-regulation of both p53 and p21 expression, and the increased levels of p21 were associated with increased binding of p21 with Cdks, cyclin A, and cyclin B1. Knockdown of p53 by small interfering RNA (siRNA) markedly abolished p53 induction by decitabine in AGS cells, yet p53 siRNA had no attenuating effect on p21 induction. In addition, depletion of p21 expression with siRNA, but not p53, significantly attenuated decitabine-induced G2/M arrest. We also observed that decitabine strongly induced G2/M arrest associated with p21 induction in both p53 allele-null (–/–) HCT116 and wild type p53 (+/+) HCT116 cell lines. Therefore, our data indicated that p21 plays a crucial role in decitabine-induced G2/M arrest and operates in a p53-independent manner.     

Roles of the Tumor Suppressor p53 and the Cyclin-dependent Kinase Inhibitor p21WAF1/CIP1 in Receptor-mediated Apoptosis of WEHI 231 B Lymphoma Cells

Treatment of WEHI 231 immature B lymphoma cells with an antibody against their surface immunoglobulin M (anti-IgM) induces apoptosis and has been studied extensively as a model of self-induced B cell tolerance. Since the tumor suppressor protein p53 has been implicated in apoptosis in a large number of cell types and has been found to be mutated in a variety of B cell tumors, here we sought to determine whether p53 and the p53 target gene cyclin-dependent kinase inhibitor p21^WAF1/CIP1 were involved in anti-IgM–induced cell death. Anti-IgM treatment of WEHI 231 cells increased expression of p53 and p21 protein levels. Ectopic expression of wild-type p53 in WEHI 231 cells induced both p21 expression and apoptosis. Ectopic expression of p21 similarly induced apoptosis. Rescue of WEHI 231 cells from apoptosis by costimulation with CD40 ligand ablated the increase in p21 expression. Lastly, a significant decrease in anti-IgM–mediated apoptosis was seen upon downregulation of endogenous p53 activity by expression of a dominant-negative p53 protein or upon microinjection of an antisense p21 expression vector or antibody. Taken together, the above data demonstrate important roles for p53 and p21 proteins in receptor-mediated apoptosis of WEHI 231 B cells.     

地西他滨对白血病Kasumi-1细胞的毒性作用及其机制研究

目的:探讨地西他滨对白血病Kasumi-1细胞的毒性作用及其机制。方法:应用CCK-8法检测0.5～100μmol/L地西他滨作用Kasumi-1细胞24、48、72 h后的细胞存活率,An-nexinⅤ-FITC/PI双染色法检测0.5～20μmol/L地西他滨处理Kasumi-1细胞48 h后的细胞凋亡率,流式细胞碘化丙啶单染色法观察G0/G1期、S期、G2/M期Kasumi-1细胞比例;逆转录PCR法检测p21WAF1/CIP1基因表达水平的变化。结果:0.5～100μmol/L地西他滨均可抑制Kasumi-1细胞增殖,并呈现剂量依赖性与时间依赖性,作用24、48、72 h的IC50浓度分别为6.92、5.03、4.47μmol/L;0.5～20μmol/L地西他滨诱导Kasumi-1细胞凋亡水平较低,但能以剂量依赖的方式阻滞Kasumi-1细胞G2/M期,上调p21WAF1/CIP1基因表达。结论:地西他滨对Kasumi-1细胞具有毒性作用,其机制可能与上调p21WAF1/CIP1表达以及阻滞细胞周期有关。