吉非替尼不同加药时间肺癌A549细胞放射增敏研究

目的 探讨吉非替尼不同加药时间对离体培养肺癌细胞系A549的放射增敏效应的影响.方法 实验分吉非替尼照前24 h加药组、照后即刻加药组、照后24 h加药组.用克隆形成法检测细胞存活分数,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分布,蛋白免疫印迹检测p21、Cdc25e、Bcl-2、Bax、Rad51和phospho-DNA-PK蛋白表达.结果 吉非替尼照前组、照射即刻加药和照后加药组的放射增敏比(D_0值比)分别为2.23、1.51和1.30.照前加药组观察到更高的凋亡率和G_2+M期阻滞.p21、Cdc25c、Bcl-2、Bax、Rad51和phospho-DNA-PK蛋白表达的改变也较其他组明显.结论 吉非替尼照前加药、照射即刻加药和照后加药对肺癌细胞系A549均有放射增敏效应,但照前加药的效应最强.     

选择性EGFR 酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼对宫颈癌离体细胞的放射增敏作用

 目的 探讨表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼对宫颈癌离体细胞的放射增敏作用。方法 以宫颈鳞癌Siha细胞，腺癌HeLa细胞为研究对象，利用MTT法检测吉非替尼对Siha和HeLa细胞的增殖抑制作用；利用集落形成实验检测吉非替尼对Siha、HeLa细胞的放射增敏效应。结果 吉非替尼能够抑制Siha、HeLa细胞的增殖，其JC20，值分别是0．15μmol／L、0．32μmol／L，而且抑制作用呈剂量依赖性；吉非替尼作用于Siha、HeLa细胞72h后，放射增敏比SER分别为1．693、1．228。结论 吉非替尼对宫颈癌Siha、HeLa细胞具有明显的放射增敏作用。     

厄洛替尼对非小细胞肺癌H1299细胞放射增敏研究

目的 探讨表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂对人非小细胞肺癌细胞放射敏感性的影响及其可能的机制。方法 体外培养人非小细胞肺癌细胞H1299。CCK-8检测厄洛替尼对H1299的毒性作用,并计算 IC50及 IC20,将 IC20作为后续试验的药物作用浓度。克隆形成实验检测射线联合厄洛替尼对H1299的作用,计算放射敏感性参数,绘制细胞存活曲线。流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡。Western blot检测细胞EGFR/PI3K/AKT通路及凋亡相关蛋白表达。结果 厄洛替尼对H1299具有一定增殖抑制作用,IC50为27.3μmol/L、 IC20为3.3μmol/L。X射线联合 IC20浓度厄洛替尼能够降低H1299的克隆能力,使 G0/G1期、G2/M期比例增加,S期减少比例,细胞凋亡增加;抑制pEGFR及pAKT蛋白表达,增加凋亡相关蛋白Active Caspase 3、Cleaved PARP表达。结论 厄洛替尼对H1299具有放射增敏作用,其可能的机制是厄洛替尼联合射线抑制EGFR/PI3K/AKT通路,降低细胞损伤修复能力,改变细胞生长周期,诱导细胞凋亡。     

塞来昔布对胃癌SGC7901细胞放射敏感性的实验研究

目的:探讨环氧合酶2(COX-2)抑制剂塞来昔布对胃癌SGC7901细胞株的放射增敏作用及其机制。方法:MTT法检测塞来昔布对胃癌SGC7901细胞株的抑制作用,计算出塞来昔布的半数抑制浓度(IC50);克隆形成实验用于检测20%IC50这个浓度的塞来昔布对胃癌SGC细胞是否具有放射敏感性;流式细胞术(FCM)分析细胞周期的分布情况。结果:MTT实验显示塞来昔布对SGC7901细胞株的抑制率随浓度的升高而升高,48 h的IC50是34.38μmol/L;克隆形成实验显示,照射组+药物组与单纯照射组相比,反映放射敏感性指标的存活分数(SF2)、平均致死剂量(D0)及准阈剂量(Dq)均下降,放射增敏比(SER)升高。FCM检测细胞周期G2和M期细胞比例增加,S期细胞比例减少。结论:塞来昔布能增加胃癌SGC7901细胞的放射敏感性,其机制可能与其抑制肿瘤细胞亚致死性损伤修复能力和促进肿瘤细胞周期再分布有关。     

白杨黄素对人胃癌细胞SGC7901的放疗增敏作用及其相关机制研究

目的:探讨白杨黄素对人胃癌SGC7901细胞增殖的放射增敏作用及其相关机制.方法:应用克隆形成实验分别检测不同浓度白杨黄素及60Co γ射线联合应用对人胃癌细胞系SGC7901细胞生存率的影响;应用吖啶橙(AO)/溴化乙碇(EB)荧光染色和TUNEL法分别检测白杨黄素与60Co γ射线联合应用后对人胃癌细胞系SGC7901细胞凋亡的影响;应用Westen-blot检测与细胞凋亡调控相关的蛋白Caspase-3、Survivin和Bcl-2的表达情况.结果:白杨黄素能够明显增强60Co γ射线对人胃癌SGC7901细胞克隆集落形成的抑制作用;增强60Co γ射线导致的人胃癌SGC7901细胞的凋亡;白杨黄素能够上调60Co γ射线处理过后人胃癌SGC7901细胞内活性Caspase的表达,下调细胞内凋亡抑制蛋白Survivin和Bcl-2的表达.结论:对于胃癌细胞系SGC7901,白杨黄素可以作为一种有效的放射增敏剂.     

培美曲塞和吉非替尼不同时序应用对人肺腺癌细胞的作用和机制

目的 探讨培美曲塞与吉非替尼不同时序应用对肺腺癌细胞A549和PC-9生长及凋亡的影响, 并阐述其可能机制。方法 MTT法检测各组细胞的增殖抑制情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡及细胞周期分布,Western印迹法检测对EGFR下游信号通路及TS酶蛋白水平表达的影响。结果 培美曲塞序贯吉非替尼、培美曲塞同步联合吉非替尼对PC-9和A549细胞增殖抑制率及凋亡率较单药组均提高（P<0.05）,培美曲塞可以提高EGFR、AKT 、ERK磷酸化水平,而吉非替尼表现为抑制作用, 同时吉非替尼降低TS酶表达。培美曲塞序贯吉非替尼,培美曲塞同步联合吉非替尼抑制EGFR、AKT 、ERK磷酸化水平较单药更强。吉非替尼主要将PC-9、A549细胞阻滞在G0/G1期;培美曲塞主要将细胞阻滞在S期。培美曲塞序贯吉非替尼、培美曲塞同步联合吉非替尼较其他组G2/M期细胞比例提高（P<0.05）。结论 培美曲赛序贯吉非替尼、培美曲赛同步联合吉非替尼在PC-9、A549细胞中均起到协同增效作用,且培美曲赛序贯吉非替尼协同作用更为显著,可能主要与培美曲赛诱导EGFR、AKT 、ERK磷酸化及吉非替尼降低TS酶作用有关。     

吉非替尼敏感性不同的非小细胞肺癌中miRNA-7表达的差异及临床意义

目的检测吉非替尼敏感性不同的非小细胞肺癌中miR-7的表达差异,并探讨其临床意义。方法采用吉非替尼(Gefitinib)药物大剂量冲击法诱导H827,建立耐吉非替尼肺癌细胞亚系H827-7/GR,有限稀释法将H827-7/GR细胞单克隆化,CCK-8法检测耐药前后细胞株及各单克隆细胞对吉非替尼的敏感性;RT-PCR方法检测H827、H827-7/GR和耐药单克隆细胞株以及其他对吉非替尼敏感性不同的肺癌细胞株A549、H358、H1299、H1650和H1975中miR-7的表达差异。结果 H827/GR耐药指数大于100;获得的6株耐药单克隆细胞株对吉非替尼的半生长抑制浓度(the half growth inhibition concentration,IC50)值不同;和吉非替尼敏感株H827相比,诱导的耐药细胞株H827/GR、耐药单克隆细胞株和吉非替尼耐药株A549、H358、H1299、H1650和H1975中miR-7的相对表达水平均降低(P<0.05)。结论在非小细胞肺癌中,耐药细胞中miR-7的相对表达水平均较敏感细胞系降低,提示miR-7的低表达可能与非小细胞肺癌耐药性相关,其可能是潜在的肺癌药物敏感性预测分子标志物。     

埃克替尼提高胃癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的敏感性

目的:胃癌细胞大多对TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)不敏感。本研究为探讨胃癌细胞对TRAIL耐药的原因以及如何提高胃癌细胞对TRAIL的敏感性。方法:流式细胞术检测细胞凋亡,免疫印迹法检测蛋白的表达。结果:TRAIL(100ng/ml)作用MGC803和SGC7901细胞20小时,TRAIL诱导少量细胞凋亡,同时检测到EGFR和下游Akt、ERK的活化。用新型的EGFR酪氨酸激酶抑制剂埃克替尼(10μmol/L)预处理MGC803和SGC7901细胞2小时,之后加用TRAIL,结果抑制了TRAIL引起的EGFR和下游Akt、ERK的磷酸化,并最终提高了MGC803和SGC7901细胞对TRAIL的敏感性。结论:埃克替尼通过抑制EGFR通路从而增强了TRAIL诱导的胃癌细胞凋亡。     

胃癌细胞株中GnT-V表达水平的检测

目的检测正常胃黏膜细胞株GES-1和胃癌细胞株GnT-V的mRNA和蛋白质的表达水平。方法体外培养胃癌细胞株BGC823、SGC7901、MKN45和正常胃黏膜细胞株GES-1,应用RT-PCR、Real-time PCR、Westem blot等技术检测胃癌细胞株及正常胃黏膜细胞GnT-V mRNA和蛋白质表达的水平。结果检测显示3株胃癌细胞（BGC823、SGC7901、MKN45）均表达CmT-V mRNA,其中BGC823、SGC7901呈高表达,MKN45则低表达GnT-V（P〈0．05）。各细胞相对正常对照组GnT-V的相对表达倍数分别为18．25,13．36,9．25。Western blot结果显示3株胃癌细胞均不同程度的GnT-V蛋白表达,而正常对照组不表达GnT-V蛋白。结论胃癌细胞不同程度表达GnT-V,各细胞中以BGC823表达量最高,SGC7901表达量居中,MKN45呈低表达,提示GnT-V可能对于胃癌的发生发展有一定的影响。     

白杨黄素对人胃癌细胞SGC7901的放疗增敏作用及其相关机制研究

目的：探讨白杨黄素对人胃癌SGC7901细胞增殖的放射增敏作用及其相关机制。方法：应用克隆形成实验分别检测不同浓度白杨黄素及^60Coγ射线联合应用对人胃癌细胞系SGC7901细胞生存率的影响;应用吖啶橙（AO）／溴化乙碇（EB）荧光染色和TUNEL法分别检测白杨黄素与^60Coγ射线联合应用后对人胃癌细胞系SGC7901细胞凋亡的影响;应用Westen—blot检测与细胞凋亡调控相关的蛋白Caspase-3、Survivin和Bcl-2的表达情况。结果：白杨黄素能够明显增强^60Coγ射线对人胃癌SGC7901细胞克隆集落形成的抑制作用;增强^60Coγ射线导致的人胃癌SGC7901细胞的凋亡;白杨黄素能够上调^60Coγ射线处理过后人胃癌SGC7901细胞内活性Caspase的表达,下调细胞内凋亡抑制蛋白Survivin和Bcl-2的表达。结论：对于胃癌细胞系SGC7901,白杨黄素可以作为一种有效的放射增敏剂。     

胃癌细胞uPA表达与腹膜种植潜能的相关性研究

目的探讨不同胃癌细胞系尿激酶型血浆纤溶酶原激活因子(uPA)的表达及其与腹膜种植能力的关系。方法采用半定量RT-PCR、Western blot和ELISA方法,比较不同胃癌细胞系(AGS、SGC7901、MKN45和MKN28)uPA表达和uPA活性的差异。将胃癌细胞直接注入裸鼠腹腔,建立腹膜种植模型,通过观察裸鼠生存时间等方法,比较不同胃癌细胞系的腹膜种植潜能。结果uPA表达以SGC7901细胞最高,uPA活性以MKN45细胞最高,AGS细胞uPA表达和活性均最低。AGS未发生腹膜种植肿瘤;SGC7901和MKN45均出现大小不等的腹膜种植肿瘤;MKN28出现伴有血性腹水且大小相似的腹膜种植肿瘤;但MKN45最早形成腹膜种植肿瘤,并且该组裸鼠的生存时间最短。结论各株胃癌细胞的uPA表达在转录和翻译水平相一致,但uPA的表达量和uPA活性大小有明显差异,并且这二者与腹膜种植能力呈正相关。     

LncRNA-MALAT1在缺氧诱导胃癌侵袭转移中的作用

目的:探讨LncRNA-MALAT1对缺氧诱导胃癌侵袭转移的影响。方法:RT-PCR检测胃癌组织标本和胃癌细胞株中MALAT1的表达;通过基因重组方法构建MALAT1的siRNA载体,并感染人SGC7901及MKN45胃癌细胞,RT-PCR验证siRNA干扰有效;Transwell实验研究其对胃癌细胞SGC7901及MKN45侵袭转移能力的影响。结果:MALAT1在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达高于癌旁组织和胃正常上皮细胞;缺氧能够促进SGC7901及MKN45细胞的侵袭转移能力,而下调MALAT1能够明显抑制缺氧条件下SGC7901及MKN45细胞的侵袭转移能力。结论:MALAT1在促进胃癌细胞的侵袭转移中发挥重要作用,为胃癌靶向治疗提供理论依据。     

KLF8在缺氧诱导胃癌细胞多药耐药中的作用

目的:探讨KLF8（Kruppel-like factor 8）在缺氧诱导胃癌细胞多药耐药表型中的作用。方法:利用Western blot和实时定量PCR的方法检测三株胃癌细胞系MKN28、MKN45、SGC7901在常氧及缺氧条件下KLF8的表达水平。Western blot和实时定量PCR检测胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR、SGC7901/ADR和亲本细胞系SGC7901中KLF8的表达水平。构建KLF8正义表达载体及KLF8小干扰RNA的慢病毒载体,将其转染入实验细胞中,用Western blot和实时定量PCR的方法检测KLF8表达量的变化。MTT、Annexin V/PI染色法及阿霉素蓄积量与潴留实验检测KLF8在缺氧诱导胃癌细胞多药耐药表型中的作用。结果:缺氧可诱导胃癌细胞系MKN28、MKN45、SGC7901中KLF8的表达升高。与胃癌亲本细胞系相比,KLF8在胃癌耐药细胞系中的表达升高,并且在SGC7901/VCR细胞中表达升高的更为明显。外源性转染KLF8后可显著增加胃癌细胞中KLF8的表达量,KLF8小干扰RNA可有效降低常氧及缺氧条件下胃癌细胞中KLF8的表达。常氧条件下,外源性转染KLF8的正义表达载体可增加胃癌细胞对不同化疗药物的耐受性,降低化疗药物诱导的胃癌细胞凋亡指数,同时可增加细胞内阿霉素的泵出率。缺氧条件下,KLF8小干扰RNA能够逆转胃癌细胞中上述现象的发生。结论:初步实验结果发现了一个新的缺氧反应分子-KLF8。表型试验证实该分子在缺氧诱导胃癌多药耐药中发挥作用。     

胃癌转移相关miRNA的差异表达谱及miR-218的生物学分析

目的 探讨胃癌转移相关微小RNA（miRNA）的差异表达情况并进行miR-218的生物学分析。方法 采用实时荧光定量PCR（qPCR）及miRNA芯片法检测低转移潜能的胃癌细胞亚系（SGC7901-NM、MKN28-NM）与高转移潜能的胃癌细胞亚系（SGC7901-M、MKN28-M）间miRNA的差异表达。提取不同转移潜能胃癌细胞系和10例胃癌冰冻组织及相应的转移淋巴结中的总RNA,利用qPCR检测miR-218在不同细胞及组织中的表达情况。结果 对不同转移潜能的胃癌细胞亚系进行芯片检测发现,与SGC7901-NM细胞比较,SGC7901-M 细胞有47个分子表达下调,15个分子表达上调。与MKN28-NM细胞比较,MKN28-M细胞有41个分子表达下调,83个分子表达上调。在SGC7901-M及MKN28-M细胞中,34个分子表达均出现下降,11个分子表达均出现上升。对不同转移潜能的胃癌细胞亚系以及人永生化正常胃黏膜细胞系GES进行检测可以发现,4种不同转移潜能的胃癌细胞亚系中miR-218的表达均低于正常胃黏膜细胞系GES,差异有统计学意义（P＜0.05）,且在高转移潜能胃癌细胞亚系中miR-218的表达均低于低转移潜能胃癌细胞系,差异有统计学意义（P＜0.05）。胃癌转移淋巴结中miR-218的表达水平为0.23±0.02,低于胃癌原发灶的1.09±0.05,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 胃癌转移相关miRNA会出现差异表达情况,高转移潜能胃癌细胞中的miR-218表达水平上调可能与胃癌转移存在一定关系。     

三氧化二砷诱导胃癌细胞凋亡及对相关基因表达的影响

目的 研究三氧化二砷（As2O3)诱导胃癌细胞的凋亡作用及对凋亡相关基因p53、c-myc、bcl-2、bcl-xl和bcl-xs表达的影响,探讨其诱导胃 癌凋亡的作用机制。方法 研究As2O3对胃癌细胞SGC－07901和MKN－45的诱导凋亡作用和对凋亡相关基因表达的影响。结果 As2O3作用于细胞可见典型的细胞凋亡。出现典型的亚二倍体“凋亡峰”。10μmol／LAs2O3的诱导胃癌细胞SGC－7901和MKN－45的凋亡率为13．8％和22．5％。细胞凋亡指数在1．42％－9．5％之间。As2O3作用后能明显下调SGC－7901细胞的bcl-2蛋白和mRNA的表达;对SGC－7901细胞的p53、c-myc、bcl-xl和bcl-xs蛋白的表达无影响。As2O3能促进MKN－45细胞的p53蛋白和mRNA的表达,对MKN－45细胞的bcl-2、c-myc、bcl-xl和bcl-xs基因表达无影响。结论 As2O3可通过不同途径诱导胃癌细胞凋亡,通过下调SGC－7901细胞的bcl-2的蛋白表达诱导其凋亡,通过上调p53表达诱导胃癌MKN－45细胞凋亡。     

ATM在人胃癌细胞系的表达及其在细胞DNA损伤中的作用

目的:研究DNA损伤剂对ATM基因缺陷和正常的胃癌细胞系的作用机制.方法:Western-blot方法检测6株胃癌细胞系ATM蛋白的表达情况,并用DNA损伤剂顺铂作用于ATM基因缺陷的MKN28细胞系和ATM基因正常的BGC823细胞系,采用Western-blot、DNAladder、Hoechest 33258 /PI双荧光染色等方法观察凋亡相关激酶的表达和细胞的应答反应.结果:Western-blot显示,ATM蛋白在胃癌细胞系MGC803、MKN28、MKN45、SGC7901的表达水平显著低于BGC823和AGS细胞系,BGC823细胞在CDDP作用后,ATM蛋白表达水平升高,磷酸化chk1和chk2活性24小时后增强,而Cdc25C表达减少;MKN28细胞中G2期检测点蛋白ATM、p-chk1、p-chk2表达较低,Cdc25C表达较高,但在CDDP作用前后无明显变化.MKN28细胞在DNA损伤剂作用后出现显著凋亡,而BGC823细胞在DNA损伤剂作用48小时后未见显著凋亡.结论:ATM在细胞周期的多个环节均有调控作用,特别是在细胞周期检测点和DNA损伤的修复中有重要的监视和启动作用.     

敲低PRMT5基因表达对胃癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及其机制

目的 观察蛋白质精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）在胃癌细胞中的表达,探讨敲低PRMT5表达水平后对胃癌细胞生物学行为的影响。方法 Western blot检测胃癌细胞系MGC803、SGC7901、MKN45和人胃黏膜上皮细胞GES-1中PRMT5蛋白表达水平,转染siRNA1和siRNA2质粒敲低PRMT5的表达水平,细胞增殖和凋亡实验、Transwell实验分别检测细胞增殖能力、凋亡率和细胞的侵袭能力,Western blot检测β-catenin、Cyclin D1和Bax蛋白表达水平。结果 与GES-1细胞比较,MGC803、SGC7901和MKN45细胞中PRMT5蛋白表达水平增加（P<0.001）。敲低PRMT5表达后细胞的增殖和侵袭能力减弱,凋亡率增加（P<0.05）,β-catenin和Cyclin D1蛋白的表达降低,Bax蛋白的表达增加（P<0.001）。结论 PRMT5在胃癌细胞中表达水平升高,敲低其表达水平后可通过减弱Wnt/β-catenin信号通路转导抑制细胞的增殖和侵袭并促进细胞凋亡。     

Expression of delayed rectifier potassium channels and their possible roles in proliferation of human gastric cancer cells

Voltage-gated potassium (Kv) channels have been reported to be involved in the proliferation of many types of cells, including tumor cells. The overexpression of the Kv channels and related channel activity are involved in the neoplastic process. Our previous study has shown the existence of delayed rectifier potassium (I(K)) current in gastric cancer cells SGC7901. However, the expression and function of most delayed rectifier potassium (K(D)) channel subunits in gastric cancer cells are not completely resolved. Here we examine expression of K(D) channel subunits in Kv1-Kv3 families in immortalized gastric epithelial cells GES and various gastric cancer cells (including AGS, KATOIII, MKN28, MKN45, MGC803, SGC7901, SGC7901/ADR and SGC7901/VCR), and their roles in cell proliferation. RT-PCR analysis reveals that all cell lines examined express Kv1.3, Kv1.5, Kv1.6, Kv2.1 and Kv2.2. However, Kv1.2 and Kv3.2 genes are barely detectable in any given cancer cell lines. Kv1.5 protein, high mRNA levels in all cell lines examined, is also expressed in some cancer cells lines and more frequently detected in gastric cancer tissues. Downregulation of the expression of Kv1.5 in SGC7901 with RNA interference significantly inhibited the proliferation and tumorigenicity of SGC7901 cells. Moreover, in Ca(2+)-containing rather than Ca(2+)-free medium, KCl (50mM) stimulated a rapid increase in the concentration of cytosolic calcium in empty vector transfected cells that was blocked by verapamil. Likewise, decrease the expression of Kv1.5 with short interfering RNA also blocked the depolarization-induced influx of Ca(2+). This finding suggests that more than one kind of K(D) channel subunits are expressed in various gastric cancer cell lines. Kv1.5 may be involved in tumor cells proliferation by controlling Ca(2+) entry, and the interference of K(D) channels expression and/or activity could provide a novel strategy to reverse the malignant phenotype of gastric cancer cells.