汉坦病毒包膜糖蛋白基因核酸免疫的初步研究

目的将克隆有汉坦病毒包膜糖蛋白基因M片段及G1、G2基因的重组质粒免疫动物，了解上述目的基因在核酸疫苗中的应用价值。方法大量制备已构建好的pcDNA3．1-M、pcDNA3．1-G1、pcDNA3．1-G2重组质粒DNA及对照空质粒pcDNA3．1。然后用这四组质粒DNA通过肌肉注射的方法免疫6～8周龄的BALB／c小鼠（每组5只），每4周免疫一次，共免疫3次，每次免疫前及最后一次免疫后2周断尾取血，用免疫荧光的方法检测基因免疫的体液免疫应答效果。结果重组质粒pcDNA3．1-G1免疫小鼠有4只血清抗汉坦病毒抗体为阳性，重组质粒pcDNA3．1-G2以及重组质粒pcDNA3．1-M免疫小鼠各有1只血清抗汉坦病毒抗体为阳性。结论汉坦病毒糖蛋白基因核酸免疫动物后可刺激机体产生特异性的体液免疫应答。     

恶性疟原虫FCC-1/HN株DNA疫苗 在小鼠体内的免疫反应

:【目的】探讨恶性疟原虫DNA疫苗在小鼠体内的免疫反应。【方法】将恶性疟原虫FCC 1/HN株重组质粒pcDNA3 Pfs2 5及 pcDNA3 EBA175 /HRPⅡ经骨骼肌途径分别单独注射或两者混合注射免疫BALB/c小鼠 ,观察免疫后不同时间点血清中IgG抗体滴度、脾淋巴细胞增殖反应、CD4 /CD8 T细胞亚群比值和NK细胞杀伤活性的变化。【结果】pcD NA3 EBA175 /HRPⅡ与 pcDNA3 Pfs2 5分别单独肌肉注射或两者混合肌肉注射免疫小鼠后 ,均可见血清IgG抗体滴度增高 ;针对恶性疟原虫抗原的特异性T淋巴细胞增殖反应增强 ;CD4 /CD8 T细胞比率下降以及NK细胞杀伤活性增强。【结论】提示肌肉注射为一有效的DNA疫苗免疫途径 ,采用编码恶性疟原虫有性期阶段或无性红细胞阶段的重组质粒单独或两者混合免疫小鼠 ,均能诱导明显的体液免疫反应、细胞免疫反应和NK细胞杀伤活性。     

单纯疱疹病毒DNA疫苗的初步研究

目的：探讨含有HSV—2糖蛋白D全基因序列的重组质粒作为DNA疫苗的可能性。方法：采用PCR方法获得HSV—2gD片段，构建含HSV—gD片段的重组质粒pcDNA3-gD。重组质效作为DNA疫苗免疫小鼠，观察其对小鼠的免疫效果及保护作用。结果：重组质粒pcDNA3-gD免疫小鼠后产生特异性抗体；可保护小鼠免受HSV—2的致死性攻击(存活率达75％)。结论：重组质粒pcDNA3-gD能诱导小鼠产生特异性免疫反应，可以作为HSV的候选DNA疫苗。     

T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗诱发小鼠体液免疫反应

目的：研究T淋巴瘤TCRβ链独特型DNA疫苗诱发小鼠体液免疫反应。方法：大剂量提取质粒，将BALB／c小鼠随机分为pcNSA3．1组、pcDNA3．1／TCRVβ8组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋IL－2组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋CpG＋脂质体组和全硫代CpG组共5组（每组6），双侧股四头肌内注射疫苗免疫，于第0、2、4周各免疫1次，共3次。每次免疫前及免疫开始后至第8周，取鼠血，应用间接免疫荧光检测小鼠抗体生成情况。结果：pcDNA3．1／TCRVβ8组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋CpG＋脂质体组、pcDNA3．1／TCRVβ＋IL－2组小鼠血清中均产生了特异性抗独特型抗体，抗体滴度在第4周开始增高，第6周时达到高峰。在同一取血时间，pcDNA3．1／TCRβV8＋CpG＋脂质体组和pcDNA3．1／TCRVβ8＋IL－2组小鼠抗体滴度均高于pcDNA3．1／TCRβ8组（P＜0．001。结论：DNA重组质粒pcDN3．1/TCRVβ8可诱导小鼠产生特异性抗体淋巴瘤细胞的独特型抗体；IL－2、CpG和脂质体增强了TCRVβ8基因疫苗诱导的体液免疫反应。     

柯萨奇病毒B组3型VP1基因真核表达重组质粒的构建及免疫效果

目的构建柯萨奇病毒B组 3型 (CoxsackievirusesgroupB3,CVB3)VP1基因的真核表达重组质粒pcDNA3/VP1,并观察它对小鼠的免疫保护作用。方法从CVB3感染细胞中扩增出VP1片段 ,构建真核表达重组质粒 pcDNA3/VP1,经大量扩增纯化后 ,肌内注射免疫BALB/c小鼠 ,每次免疫后的第 6天 ,断尾取血检测CVB3中和抗体 ;3次免疫后用致死量 (10 0 0TCID50 )的CVB3感染小鼠 ,观察 pcDNA/VP1对小鼠的免疫保护作用。 结果pcDNA3/VP1重组质粒免疫小鼠后 ,能诱导机体产生中和抗体 ,各次免疫后抗体滴度分别为 <1∶5 ,1∶5 .7和1∶34.8;用致死量CVB3感染小鼠 ,pcDNA3/VP1重组质粒免疫组、pcDNA3质粒对照组及生理盐水对照组生存率分别为 30 %、2 0 %及 15 % ,3组小鼠生存率无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论 pcDNA3/VP1重组质粒在小鼠体内能够表达并能诱导机体产生中和抗体 ,抗体滴度随免疫次数增加 ,但免疫小鼠对致死量的CVB3感染无明显保护作用     

HSV-2DNA疫苗诱导小鼠免疫应答研究

目的探讨含有单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)糖蛋白D全基因序列的重组质粒作为DNA疫苗的可能性。方法采用PCR方法获得HSV-2gD片段，构建含HSV-gD片段的重组质粒pcDNA3-gD。重组质粒作为DNA疫苗免疫小鼠，观察其对小鼠免疫效果及保护作用。结果重组质粒pcDNA3-gD免疫小鼠后可产生特异性抗体，可保护小鼠免受HSV-2的致死性攻击，存活率达75％。结论重组质粒pcDNA3-gD可诱导小鼠产生特异性免疫反应，可以作为HSV的候选DNA疫苗。     

汉坦病毒H8205株G2-人源IL-2融合基因免疫效果的研究

目的对比研究两种融合基因pcDNA3．1／HisB-IL2-G2与pcDNA3．1／HisB-G2的免疫效果。方法大量制备重组质粒后免疫Balb／c小鼠，剂量为100μg／次。于0、4和8周，共免疫3次。免疫前和免疫后第2、6、10周采血，用间接免疫荧光法(IFA)与ELISA检测抗汉坦病毒(HTNV)抗体；用空斑减少中和试验(PRNT)检测免疫血清的中和效价；用淋巴细胞增殖试验检测免疫小鼠的细胞免疫反应；用免疫脾细胞转移保护实验检测疫苗的保护效应。结果两种融合基因均可刺激机体产生特异性的抗汉坦病毒76—118株的交叉抗体和中和抗体，且差异无显著性意义，而pcDNA3．1／HisB-IL2-G2诱导特异的细胞免疫明显高于pcDNA3．1／HisB-G2。结论pcDNA3．1／HisB-IL2-G2融合基因的免疫效果优于pcDNA3．1／HisB-G2，该研究结果为进一步研制有效的肾综合征出血热(HFRS)基因疫苗提供了重要实验依据。     

幽门螺杆菌napA基因真核表达系统的构建及其在小鼠体内的表达

目的构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）napA基因真核表达系统,了解其在小鼠肌细胞中的表达情况。方法根据GenBank中HpnapA基因序列（AF227075）和真核表达质粒多克隆位点序列设计引物,以Hp-RNA逆转录产物为模板,扩增HpnapA编码基因,用基因重组技术将目的基因定向克隆到pcDNA3多克隆位点上,转化大肠杆菌,经质粒扩增和DNA测序后,进行小鼠肌肉免疫、目的基因表达水平和抗体水平检测。结果经双酶切、PCR和测序验证,真核表达质粒HpnapA/pcDNA3构建成功。动物实验结果表明：真核重组质粒在小鼠肌细胞内获良好表达,表达产物能刺激机体产生一定效价的抗体。结论成功构建了HpnapA/pcDNA3真核重组表达质粒;用以免疫小鼠,在小鼠肌细胞内获较好表达并具有免疫原性,有用于疫苗研究的潜在价值。     

日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗不同免疫途径免疫保护效果研究

目的:观察本室所构建日本血吸虫大陆株31kDa组织蛋白B DNA疫苗在BALB/c小鼠体内的不同免疫途径的免疫保护效果.方法:用纯化的空白质粒载体VR1012、重组质粒VR1012-Sj31免疫BALB/c鼠,将36只6～8周龄BALB/c鼠随机分为3组,每组12只,对照组(A组)肌肉注射空白质粒载体VR1012,实验组(B组)皮下注射重组质粒VR1012-Sj31,C组肌肉注射重组质粒VR1012-Sj31.质粒剂量均为100μg,每隔2w免疫1次,共免疫3次,第3次免疫后第21d,每只鼠经腹部感染10条尾蚴,42d后剖杀计数各小鼠成虫数和每克肝卵数,观察诱导产生的减虫和减卵效果,并用ELISA分析小鼠血清中的抗体.结果:ELISA分析表明,第3次免疫后小鼠出现特异性IgG抗体.与空白质粒对照组比较,2个实验组的减虫率分别为15.0%(P＞0.05)和25.0%(P＜0.05),减卵率分别为38.22%和54.90%(P＜0.001).与皮下免疫组相比,VR1012/Sj31肌肉免疫组的减卵率分别为26.99%(P＜0.001).结论:DNA疫苗VR1012-Sj31能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用,肌肉注射的保护效果大于皮下注射.     

Epstein—Barr病毒LMP1 DNA免疫小鼠免疫效果的测定

目的：探讨EBV－LMP1重组体DNA免疫小鼠后的免疫效果。方法：将已构建的EBV LMP1基因（EBV LMP1）重组质粒pcDNA3－BLMP1肌肉注射免疫Balb/c小鼠,在免疫后的不同时间分别用ELISA、流式细胞仪及LDH法检测免疫小鼠体内特异性EBV LMP1抗体滴度、CD4^ /CD8^ T淋巴 细胞亚群的数量变化以及EBV LMP1特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。用pcDNA3质粒及PBS作为阴性对照及空白对照。结果：重组质粒免疫Balb/c小鼠后,可在外周血液血清中检测到特异性的EBV LMP1抗体;其脾细胞中CD4^ /CD8^ T淋巴细胞亚群数量明显高于阴性对照及空白对照,且可检测到EBV LMP1特异性的CTL存在。以上结果在免疫16周之内无明显改变。结论：EBV－LMP1质粒重组体可刺激小鼠产生特异性的体液和细胞免疫,并且可维持一定的时间,具有较好的免疫原性,是一种有效、制备方便的EBV候选疫苗。     

嗜肺军团菌pilE基因体外表达及其免疫原性研究

目的 构建嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛pilE基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-pilE,研究其真核细胞中的表达及其免疫原性.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌pilE基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1.-pilE.经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-pilE转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western-blot分别鉴定pcDNA3.1-pilE的瞬时和稳定表达产物.将pcDNA3.1-pilE作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ产生水平、CTL杀伤活性等指标,评价疫苗的免疫原性.结果 扩增出了429 bp的PilE基因,在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,在相对分子质量15000处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-pilE在细胞内表达PilE蛋白.pcDNA3.1-pilE免疫组的免疫原性均高于对照组pcDNA3.1( )组(P＜0.01).结论 成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中得到了表达,免疫小鼠后诱导了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答.     

SARS冠状病毒S蛋白多价核酸疫苗的构建和免疫学原性

目的构建以SARS冠状病毒（severe acutere spiratory syndrome coronavlrus,SARs．c0V）S蛋白3个保守片段基因的组合为抗原基因DNA疫苗,采用肌肉注射的方法接种小鼠后观察机体产生免疫应答的情况。方法将人工合成的S蛋白3个保守片段基因组合（称为Sa）克隆至真核表达载体pcDNA3、1（-）,随之将重组质粒进行小鼠肌肉免疫,定期检测血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平,流式细胞仪观察其淋巴细胞表型变化,PCR法检测质粒分布,免疫组化检测抗原表达。结果疫苗注射后15d就能在血清中检测出病毒特异性抗体,并且疫苗能在机体中持续表达抗原引发机体持续的免疫应答,直到注射后45d免疫应答都不见减弱;以CTLT淋巴细胞为主的CD8＋T淋巴细胞的百分比含量增加极显著,引起强大的体液免疫和细胞免疫;而空载体质粒对照组未检测出明显的特异性免疫应答。结论以S蛋白3个保守片段基因组合为抗原基因的DNA疫苗通过肌注能诱导小鼠针对SARS病毒强大的免疫应答。     

HPV58 E2 DNA疫苗的构建及免疫原性研究

目的探讨人乳头瘤病毒58型（HPV58）早期基因E2作为DNA疫苗候选抗原的可行性。方法构建HPV58 E2真核重组表达载体pcDNA3/58E2,转染SiHa细胞,利用RT PCR检测HPV58E2 mRNA的转录。pcDNA3/58E2 DNA肌肉注射免疫BALB/C小鼠,ELISA检测小鼠血清中特异性anti HPV58E2 IgG水平。结果RT PCR结果表明,pcDNA3/58E2能够在真核细胞中有效转录HPV58E2mRNA。动物实验表明,质粒pcDNA3/58E2肌肉接种可诱导免疫小鼠产生抗E2特异性抗体。结论本研究成功构建了重组真核表达载体pcDNA3/58E2,并初步证明HPV58 E2 DNA 疫苗有良好的免疫原性。     

共刺激分子B7-1与汉坦病毒核蛋白基因共表达载体的构建及免疫调节作用

目的:探讨共刺激分子B7-1(CD80)对汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫调节作用.方法:构建双启动子共表达B7-1基因和汉坦病毒核蛋白基因的真核表达载体pcDNA 3.1-B7-S,酶切鉴定后直接肌注免疫BALB/c小鼠,同时设对照组pcDNA 3.1 空质粒接种组、pcDNA 3.1-S接种组.ELISA法检测血清特异性抗体,MTT法检测T细胞增殖反应.结果:pcDNA 3.1-B7-S接种组鼠在抗体的产生水平及淋巴细胞增殖指数上均较pcDNA 3.1-S接种组明显增高.结论:接种B7-1基因和汉坦病毒核蛋白基因的共表达质粒优于注射单目的抗原基因表达质粒,为探索增强基因疫苗的免疫作用提供了新的途径.     

地方株HPV16L1基因诱发的小鼠体液免疫反应

目的检测pcDNA-L1的表达,评价地方株HPV16L1基因疫苗诱导的体液免疫反应.方法采用PCR技术从宫颈癌组织中获得L1基因,以pGEM-T Easy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析,再将L1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1（-）中,构建地方株HPV16L1基因疫苗,转染COS-7细胞,通过IFA试验验证L1蛋白的表达.用pcDNA-L1肌肉内注射方法分别于第1天、第15天和第43天免疫6周龄BABL/c小鼠,在特定时间段采血分离血清,IFA分析基因免疫在小鼠体内诱导的免疫应答,设pcDNA载体对照.结果pcDNA-L1能够在COS-7细胞中暂态表达,免疫小鼠后能检测出特异的抗体,用IFA方法在第一次免疫后的第30、60和180天均可检测到抗体;原载体免疫后未检出特异抗体.结论本实验构建的地方株HPV16L1基因疫苗可诱导产生特异性的体液免疫反应.     

丙型肝炎病毒多CTL表位DNA疫苗免疫学特性的初步研究

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)疫苗研制并为抗HCV感染提供实验依据。方法:从HCV J株基因组中,选取小鼠(H-2d)CTL表位基因序列,以pcDNA3.1(+)质粒为载体,构建相应的真核表达质粒,经肌肉免疫后,取受免疫小鼠血清和脾细胞,用ELISA及MTT法检测小鼠血清中IL-2和IFN水平及小鼠脾细胞的增殖活性。结果:实验组小鼠血清中IL-2及IFN水平明显高于对照组[IL-2:(208±8.88)比(106±6.06);IFN:(179.5±2.52)比(90.5±2.52),P<0.05];实验组淋巴细胞增殖指数明显高于对照组(1.56比1.13,P<0.05)。结论:本实验构建的pcDNA3.1(+)/HCV CTL真核表达质粒,经肌肉免疫后可以使受免疫小鼠细胞免疫应答水平提高,淋巴细胞增殖活性增高。     

HBV preS2-S DNA免疫诱导小鼠体液免疫应答

目的:构建HBV表面抗原preS2-S基因表达质粒,并探讨其在小鼠体内的表达及诱导体液免疫应答的能力.方法:采用PCR方法,以PBR322-HBV2.0(adr亚型)质粒DNA为模板获得HBV preS2-S基因,并将其重组进入pcDNA3.0表达载体中,转染7721细胞系进行稳定表达;以此重组质粒免疫小鼠,ELISA方法检测免疫小鼠抗HBs抗体浓度.结果:构建了HBV preS2-S基因的表达质粒pcDNAS2-S,该表达质粒可在7721细胞中稳定高效表达;免疫接种小鼠2周后抗HBs抗体浓度明显升高,接种后第4周布比卡因处理组小鼠抗HBs抗体的浓度达到峰值161.4 mIU/ml,布比卡因非处理组第5周抗HBs抗体的浓度可达133.7 mIU/ml.结论:所构建的pcDNAS2-S表达质粒能有效表达并诱导小鼠体液免疫应答.     

Immunity induced by DNA vaccine of plasmid encoding the rhoptry protein 1 gene combined with the genetic adjuvant of pcIFN-γ against Toxoplasma gondii in mice

Objective To construct the eukaryotic expression recombinant plasmid, pcIFN-γ, as a gene tic adjuvant and observe the immune responses elicited by pcDNA3-rhoptry protei n 1 （pc-ROP1） combined with pcIFN-γ against Toxoplasma gondii (T.go ndii) infection in mice.Methods A fragment of the IFN-γ gene was directly inserted into the pcDNA3 plasmid and identified by two restriction endonucleases digestion.pcIFN and pcROP1 DNA wa s injected into the left leg muscle of mice at a dosage of 100 μg, and a boost er vaccination was given at the same dosage after two weeks.Control groups wer e injected with pcDNA3 blank plasmid or normal saline.At 30, 50 and 70 days af ter booster injection, kinetic tests were carried out: MTT assay for the prolife ration response of T lymphocyte cells and the activity of NK cells, sandwich ABC -ELISA for the determination of IFN-γ, IL-2 and IL-10; a serum enzymetic aa ssay for nitric oxide (NO) in sera and ELISA for the titer of IgG antibody in sera.Results The recombinant plasmid, pcIFN-γ was constructed.The proliferation response of spleen T lymph cells, NK cell killing activity, and serum levels of IFN- γ, IL-2 and NO in mice injected with pcROP1 and pcIFN-γ were higher than in those injected with pcROP1 alone.There was no difference in IgG antibody level s between the two groups. Conclusion The genetic adjuvant, pcIFN-γ, could enhance the cellular immune response indu ced by DNA vaccine of pcROP1 in mice against Toxoplasma gondii infection.     

Humoral immune response to HCV core DNA vaccine in mice

DNAvaccine,alsocallednucleicacidvaccine,isarecombinanteukatyoticexpressionplasmidencodingcertainantigenofpathogen.DNAvaccinecanexpressantigenandinducecellularandhumoralimmuneresponsesaftervaccinationbyintramuscularinjectionorplasmid--coatedmicroparticlebombardment.Itshightemperaturestability,lowexpenseofmassproductionandtheabilitytoinducestrongimmuneresponsesevenfortheuseintherapyhavemadeDNAvaccineanexcitingwayfornewvaccinedevelopment['J.InordertofurnishevidenceforHCVDNAvaccinesuitablefo…     

Construction of a recombinant plasmid harbouring the rhoptry protein 1 gene of Toxoplasma gondii and preliminary observations on DNA immunity

Objective To observe the immune responses elicited in BALB/c mice by a DNA vaccine. A ge ne encoding rhoptry protein 1 (ROP1) from Toxoplasma gondii (T. gondii) was cloned into vector pcDNA3.Methods Amplifyied gene fragments coding for ROP1 from the genomic DNA of T.gondii ZS2 were inserted into cloning vector, pUC18, and sub-cloned into pcDNA3. Mice wer e injected at a dosage of 100 μg recombinant plasmid DNA by intramuscular inje ction and boosted after 2 weeks. pcDNA3 and normal saline were used as control . 30, 50 and 70 days after the second immunization, NK cell activity, T lympho cyte proliferation and sub-clusters and serum IgG antibody were assayed.Results The specific gene fragment coding for ROP1 was amplified and a pcROP1 recombinan t was constructed. At 30 days after immunization, the spleens of the mice were obviously enlarged evidently. NKC activity and the proliferation of spleen T ly mphocytes seen on MTT assay were higher in pcROP1 group than in the controls. T he number of CD4(+) T cells exhibited no obvious increase compared with that of the control, but CD8(+) T cells were obviously increased (P&lt;0.05). At 90 d ays after vaccination, the titer of IgG antibody in the serum of vaccinated mice was positive (1∶100).Conclusion pcROP1 was constructed and it could elicit both cellular and humoral immune r esponses in immunized mice.