21号染色体特异性柯斯质粒DNA克隆区域定位

为提高检测２１号染色体数目和结构异常的精确性，应用ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－１１－ｄＵＴＰ通过缺口平移法标记Ｄ１３Ｚ１／Ｄ２１Ｚ１和６个柯斯质粒（Ｃｏｓｍｉｄ）ＤＮＡ克隆，将标记后的Ｄ１３Ｚ１／Ｄ２１Ｚ１和６个柯斯质粒ＤＮＡ克隆双探针与正常二倍体细胞系染色体进行荧光原位杂交（ＦＩＳＨ），结合Ｑ显带方法将６个柯斯质粒ＤＮＡ克隆定位于２１ｑ２２；用柯斯质粒ＤＮＡ克隆探针与两个已知的平衡易位细胞系ＧＭ９５４２和８３２７Ｌ的染色体进行荧光原位杂交，检测并分析杂交信号在两个平衡易位细胞系染色体上的分布，结果表明柯斯质粒ＤＮＡ克隆精确定位于２１ｑ２２．２，６个柯斯质粒ＤＮＡ克隆定位结果一致。     

大肠杆菌菌株（λ衍生噬菌体）／PBR322衍生质粒作为人IL—6表 …

为探索人白细胞介素－６在原核细胞中高效表达的途径，选用ＢＬ２１／ＰＥＴ－２８作为表达系统，以聚质反应技术扩增了ｈＩＬ－６的经补ＤＮＡ的编码区，引入了ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ位点。用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切后，克隆于ＰＥＴ－２８载体的相应位点，转化ＤＨ５α。选出必克隆，经ＤＮＡ序列分析，表明其编码区内无非特异突变。将重组质粒转子ＤＨ５α，筛选阳性克隆，用异基硫代β－Ｄ－半乳糖苷进行诱导表     

人核糖体磷酸蛋白P2基因的克隆及鉴定

利用聚合酶链式反应技术（ＰＣＲ），从人肺巨细胞癌ＰＬＡ－８０１母系细胞系统克隆化高转移细胞株Ｄ中特异性扩增Ｐ２ ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ２ ｇｅｎｅ ｃＤＮＡ），并将扩增产物克隆入ｐＧＥＭ－３Ｚ载体，获得了重组质粒ｐＭＰ２，对其中两个克隆ｐＭＰ２－１、ｐＭＰ２－２的Ｐ２ ｃＤＮＡ进行了序列分析。结果表明：ｐＭＰ２－１的Ｐ２ｃＤＮＡ序列与文献报道基本     

IL－13：一种B细胞刺激因子

ＩＬ－１３：一种Ｂ细胞刺激因子〔英〕／ＴｈｉｅｒｒｙＤｅｆｒａｎｃｅ···／／ＪＥｘｐＭｅｄ．－１９９４，１７９（１）．－１３５～１４３ＩＬ－１的克隆和表达已获成功。ＩＬ－１３ｃＤＮＡ编码一分子量为１２．４ＫＤａ的多肽，有４个糖基化位点，氨基酸组成与...     

用简并寡核苷酸引物构建人类染色体区带特异性探针池的技术

目的建立快速有效构建人类染色体区带特异性探针池及其文库的技术。方法显微切割人类染色体３ｐ２３－ｐ２６，３ｑ２１－ｑ２２，４ｐ１２－ｐ１６区带，用简并寡核苷酸引物－ＰＣＲ（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｅｄｐｒｉｍｅｒｅｄ－ＰＣＲ，ＤＯＰ－ＰＣＲ）扩增，并用荧光原位杂交（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ）检测扩增产物来源，再将区带特异性扩增产物克隆于ｐＵＣ１９载体构建区带特异性文库，以及用α－３２ＰＡＴＰ标记的ｇＤＮＡ行菌落原位杂交。结果经ＦＩＳＨ证实，３ｐ２３－ｐ２６，３ｑ２１－ｑ２２，４ｐ１２－ｐ１６探针池均在切割相应区带出现特异性信号。其中３ｑ２１－ｑ２２获得的１．２×１０４个阳性克隆。随机分析３０个含插入片段的白色菌落，其插入片段平均约４２０ｂｐ。２２０个白色克隆菌落原位杂交示单拷贝和低度重复序列占８１％（１７８／２２０）。结论改进的显微切割结合ＤＯＰ－ＰＣＲ为人类染色体探针池及文库构建建立了一个简易、高效的方法，这将有助于基因克隆和人类基因的全序列分析。     

家族性肌萎缩性侧索硬化症的研究进展

本文阐述了ＦＡＬＳ为常染色体显性遗传性疾病及其临床特点。通过微小卫星ＤＮＡ标记进行遗传连锁分析，确定本病基因定位于２１号染色体上。认为发病原因与Ｃｕ／ＴｎＳｏＤ－１基因突变有关。对寻找有效的治疗和预防方法提供了新的依据。     

未培养外周血间期分子细胞遗传学研究

近年来，随着分子生物学技术的发展及制备探针技术的提高，荧光原位杂交（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ－ｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ）技术已被广泛应用于遗传学及其它相应学科中。本文选用Ｄ２１Ｚ１／Ｄ１３Ｚ１ＤｘＺ１探针与未培养的外周血间期白细胞进行荧光原位杂交来检测染色体非整倍体。结果表明：通过统计间期核中的杂交信号，能准确检出２１三体及Ｔｕｒｎｅｒ＇ｓ综合征，与常规细胞遗传学结果相符，该法省去了复杂的细胞培养过程和周期，不仅使常规的细胞遗传学得以简化，而且为产前诊断染色体非整倍体及肿瘤病因学的研究提供了捷径     

从人活化B细胞株3D5细胞λgtll cDNA文库筛选到的1…

对用单抗５Ｃ５和单抗５Ｃ５－Ｇ１的混合物从３Ｄ５细胞λｇｔｌｌ ｃＤＮＡ文库筛选到的７个阳性ｃＤＮＡ克隆中的１个（３Ｄ５－５）进行了核苷酸序列分析。由于３Ｄ５－５ ｃＤＮＡ长１．６ｋｂ左右，不能直接测序，故先依测序用质粒ｐＢＳｃｒｉｐｔ－ＫＳ多克隆位点中的内切酶点行单酶切，经电泳分析画出测序用的物理图谱，再用相应内切酶行单酶酶切。藉低熔点琼脂糖回收各个片段。带质粒ｐＢＳｃｒｉｐｔ－ＫＳ的大片段经直     

大肠杆菌菌株(λ衍生噬菌体)/PBR322衍生质粒作为人IL-6表达系统的研究

为探索人白细胞介素－６（ＩＬ－６）在原核细胞中高效表达的途径，选用ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＰＥＴ－２８作为表达系统，以聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增了ｈＩＬ－６的互补ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）的编码区，引入了ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ位点。用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切后，克隆于ＰＥＴ－２８载体的相应位点，转化ＤＨ５α。选出阳性克隆，经ＤＮＡ序列分析，表明其编码区内无非特异突变。将重组质粒转入ＤＨ５α，筛选阳性克隆，用异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）进行诱导表达。全细菌裂解液进行十二烷基黄酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ），结合固化蛋白质的免疫学测定（Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ）杂交进行分析。结果表明：Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ杂交发现有与抗ＩＬ－６特异结合的蛋白带，以４ｈ的产量最多，激光扫描显示ＩＬ－６的吸收峰占总吸收面积的３７％（４ｈ诱导）。分子量约为２７ｋＤ。实验显示，人ＩＬ－６在原核细胞中实现了高效表达，表达产物具有ＩＬ－６的免疫活性     

应用连锁不平衡检验法进行单纯性先天性心脏病易感基因 …

将人类单纯性先天性心脏病（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｈｅａｒｔｄｅｆｅｃｔ，ＣＨＤ）易感基因初步定位，为进一步对其克隆奠定基础，方法在胚胎心脏发育调控相关基因－ＨＯＸ基因Ａ簇、Ｂ簇所在在的染色体区域７ｐ１４－１５、１７ｑ２１内选择３个微卫星ＤＮＡ标记Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ６７３、Ｄ１７Ｓ７９１，应用荧光标记聚合酶边反应技术扩增微卫星征 段，对３９个单纯性ＣＨＤ核心家系的１１２名成员进行基因型，并进行遗传     

我国旋毛虫Ts254 DNA探针制备及序列测定

我国云南猪体旋毛虫分离株（ＢＳ）经随意扩增的多态ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）方法产生的２５４ｂｐ条带，以地高辛（ｄｉｇｏｘ－ｉｎｉｎ）标记制成探针（Ｔｓ２５４），将此探针与７株旋毛虫总ＤＮＡ进行斑点杂交，出现明显的杂交斑点，检出的ＤＮＡ量为１ｎｇ。但与其它相关寄生虫、质粒ｐＢＲ３２２、昆明株小鼠肌肉ＤＮＡ均未出现杂交反应，表明Ｔｓ２５４探针具有一定的特异性和较高的敏感性。将此Ｔｓ２５４ＤＮＡ片段克隆进Ｍ１３ｍｐ１８／１９噬菌体，扩增后，筛选阳性重组子，抽提单链后测序。经Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ序列数据库检索，Ｔｓ２５４序列与真核ＤＮＡ及结构ＲＮＡ序列无有意义的同源性，此旋毛虫ＤＮＡ序列为我国首次报道。     

从人活化B细胞株3D5细胞λgtll cDNA文库筛选到的1529bp cDNA的核苷酸序列分析

对用单抗５Ｃ５和单抗５Ｃ５－Ｇ１的混合物从３Ｄ５细胞λｇｔｌｌｃＤＮＡ文库筛选到的７个阳性ｃＤＮＡ克隆中的１个（３Ｄ５－５）进行了核苷酸序列分析。由于３Ｄ５－５ｃＤＮＡ长１．６ｋｂ左右，不能直接测序，故先依测序用质粒ｐＢＳｃｒｉｐｔ－ＫＳ多克隆位点中的内切酶点行单酶切，经电泳分析画出测序用的物理图谱，再用相应内切酶行单酶酶切。藉低熔点琼脂糖回收各个片段。带质粒ｐＢＳｃｒｉｐｔ－Ｋ５的大片段经直接自身环化，小片段与质粒载体ｐＢＳｃｒｉｐｔ－ＫＳ重组，构建测序用的亚克隆。用双链双脱氧末端终止法测各亚克隆的核苷酸序列，再拚接出全长为１５２９ｂｐ的３Ｄ５－５ｃＤＮＡ全长序列。与国际基因库资料比较，未见有相同的序列。此ｃＤＮＡ中有一个长４６５ｂｐ（从５４０ｂｐ－１００４ｂｐ）的ＯＲＦ，编码１５４个氨基酸的蛋白质。此蛋白质中有二个疏水区（第１～３４位氨基酸及第７９～１０９位氨基酸），提示它可能属Ⅰ类穿膜蛋白。     

CD34基因克隆和表达

ＣＤ３４分子是高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，主要表达于多功能造血干细胞、祖细胞表面，在成熟血细胞表面无ＣＤ３４抗原表达，提示ＣＤ３４分子在早期造血调控方面起着重要的作用。本文采用ＲＴ－ＰＣＲ方法，从高表达人ＣＤ３４抗原的ＫＧ－１ａ细胞系中成功地克隆出人ＣＤ３４抗原全长ｃＤＮＡ，并将此基因插入克隆“载体ｐＵＣ１８ＨｉｎｃＩＩ酶切位点，构建了重组质粒ｐＵＣ１８－３４。用双酶切ｐＵＣ１８－３４质粒，将分离得到的基因片段插入痘苗病毒载体的ＳｍａⅠ位点，构建了重组质粒ＰＪＳＡ１１７５－３４。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ＰＪＳＡ１１７５－３４转染已被野生痘苗病毒感染的ＴＫ￣－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人ＣＤ３４抗原全长ｃＤＮＡ的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和ＡＰＡＡＰ检测，表明重组痘苗病毒能特异地表达人ＣＤ３４抗原。人ＣＤ３４抗原ｃＤＮＡ克隆和表达，为进一步研究其结构和功能的关系以及研究造血调控机理奠定了基础。     

地高辛标记的血小板T细胞活化抗原在cRNA探针的制？…

目的 制备用地高辛标记的血小板Ｔ细胞活化抗原１ｃＲＮＡ探针。方法 构建重组质粒ｐＧＥＭ－３ＺＦ（＋）－ＰＴＡ１,并做序列分析证实ＰＴＡ１基因的插入方向正确后,用ＥｃｏＲＩ消化得到线性ＤＮＡ片段,再用ＳＰ６ＲＮＡ聚合酶转录合成带有Ｄｉｇ标记的高比活度的单链ｃＲＮＡ探针。结果辛标记ＰＴＡ１ｃＲＮＡ探针的制备,为进一步研究ＰＴＡ１ｍＲＮＡ在组织、细胞的表达和分布提供了有效的工具。     

人细胞色素p450IA1基因cDNA的克隆和鉴定

在用３－甲基胆蒽诱导培养人羊膜ＦＬ细胞２４ｈ后，抽提细胞总ＲＮＡ并直接合成ｃＤＮＡ第一链。利用人工合成的一对寡核苷酸引物，采用ＰＣＲ技术特异性地扩增Ｃｙｔ ｐ５０ＩＡ１ ｃＤＮＡ。３０个循环后琼脂糖凝胶电泳显示１．５Ｋｂ大小片段，长度与预计相符。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果证实此片段确为Ｃｙｔ ｐ４５０ＩＡ１ ｃＤＮＡ。将此片段克隆至质粒ｐＧＥＭ－３Ｚ并进行部份序列分析。结果显示克隆片段包含Ｃｙｔ ｐ     

CD44H胞外区cDNA片段的克隆及在大肠杆菌中的表达

以ｐＵＣ／ＣＤ４４为模板，用ＰＣＲ法扩增出Ｈ型ＣＤ４４的ｃＤＮＡ片段。用ＥｃｏＲＩ／ＢｃＩＩ双酶切保留编码ＣＤ４４Ｈ的信号肽及胞外内ＤＮＡ片段，插入融合蛋白表达载体ＰＥＸ３１ｂ的ＥｃｏＲＩ／Ｓａ１Ｉ位点，形成重组质粒ＰＥＸ－ＣＤ４４，将ＰＥＸ－ＣＤ４４导入大肠杆菌菌ＲＲ１（ＰＣＩ８５７），经４２℃温控诱导，有额外蛋白的产生，分子量与预期大小一致，表达产物形成包涵体，表达产量占菌体总蛋白的２１％左右     

E－选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ－选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了重组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定。将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入到天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位点，构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和ＡＰＡＭ检测，重组痘苗病毒能有效地表达人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ。     

丁型肝炎病毒基因组RNA中核酶区的cDNA的体外转录

以质粒ｐＳＶＬＤ３为模板，通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增得到１条１３９ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，它含有丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）基因组ＲＮＡ中核酶区的ｃＤＮＡ，将此片段克隆到ｐＧＥＭ－３２中，经筛选、鉴定，得到克隆株ｐＨＤＮＡ１０８，提取质粒后经双脱氧末端终止法测序，发现有２个碱基变异。以该质粒为模板，通过Ｔ７ ＲＮＡ聚合酶转录出ＨＤＶ基因组ＲＮＡ中核酶区的前体，并观察到其自身裂解产物，自裂率达７１％。     

人白细胞介素6逆转录病毒表达载体的构建

实验以ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌｋｓ质粒为载体，构建了人白细胞介素６次级克隆ｐＢＩＬ－６。用限制性内切ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＶ消化ｐＢＩＬ－６，分离并回收了ＩＬ－６ｃＤＮＡ片段，并在其平未端加入了ＢａｍＨＩ接头。实验将带有ＢａｍＨＩ粘性末端的ＩＬ－６全基因片段插入到了逆转录病毒载体ｐＺＬＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）１的ＢａｍＨＩ位点上，构建了重组质粒ｐＺＬＰＩＬ－６。经对重组予ＤＮＡ的琼脂糖凝胶电泳、限制住内切酶分析和核酸杂交鉴定，筛选出了含有ＩＬ－６ｃＤＮＡ片段及插入方向正确的ｐＺＬＰＩＬ－６。     

猪卵透明带-3α基因在大肠杆菌中的融合表达和鉴定

目的通过遗传工程获得ＺＰ３α融合蛋白,以便用表达产物制备ＺＰ３α单克隆抗体。方法根据重新测序的猪ＺＰ３αｃＤＮＡ５＇端非编码碱基数,ｐＷＲ４５０表达质粒家族的ｐＷＲ４５０－２被选用来表达β－半乳糖苷酶（ＬａｃＺ）／ＺＰ３α融合蛋白。带５＇端非编码区和信号顺序的全长ＺＰ３αｃＤＮＡ片段,用ＥｃｏＲⅠ酶切自ｐＺ５８质粒,然后被重组插入ｐＷＲ４５０－２质粒中被截短ＬａｃＺ＇基因的３＇端多克隆区。此重组质粒转化大肠杆菌ＴＧ１后,ＺＰ３α融合蛋白的表达通过ＩＰＴＧ诱导。结果在１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ存在下可观察到ＬａｃＺ／ＺＰ３α融合蛋白在大肠杆菌中的表达,表达量约占总细菌蛋白的５％。在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上,融合蛋白显示相对分子质量为１０．２×１０４。在蛋白印迹实验中,融合蛋白显示了与兔抗猪ＺＰＩｇＧ的特异免疫学反应。结论猪ＺＰ３α融合蛋白的可获得性将有助于今后开展制备抗ＺＰ３α单抗和评价它的抗生育功效等研究