丙型肝炎病毒非结构区的研究进展

198 9年美国的Ｃｈｉｒｏｎ公司和美国疾病控制中心 (ＣＤＣ)通力合作 ,摒弃传统病毒学研究方法 ,将分子克隆技术首先引用到肝炎病毒学研究中 ,并于当年成功地获得第一个ＨＣＶｃＤＮＡ克隆[1 ] 。此后几十年内 ,有关ＨＣＶ的形态、结构、生物功能的研究已取得了很大的进展。对ＨＣＶ基因组序列的比较分析表明 ,非结构区编码的蛋白包括几个重要功能元件基序 ,他们在病毒的复制及致病中起着重要的作用 ,这些结构的功能均由体外实验证实。现就近年来有关ＨＣＶ非结构区的研究 ,综述如下。1　ＮＳ2ＮＳ2基因位于ＨＣＶ基因组 2 772～ 34 19核苷…     

不同缺失突变的丙型肝炎病毒核心蛋白基因在大肠杆菌中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)全长及3种不同缺失突变的核心蛋白基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达. 方法:用PCR方法扩增基因型为1b型的HCV核心蛋白的全长及3种不同缺失突变的基因片段,对应氨基酸分别为C573:1-191aa,C510:1-59aa 81-191aa,C507:1-169aa,C444:1-59aa 81-169aa. 将其克隆到高效表达载体pRSET-A中构成重组质粒(pRSET-A-C573,pRSET-A-C510,pRSET-A-C507,pRSET-A-C444),转化大肠杆菌BL-21(DE3)pLysS. IPTG诱导表达6×His融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定. 结果:经酶切鉴定及测序证实全长及3种不同缺失突变的核心蛋白基因的原核表达载体构建正确. 经SDS-PAGE及Western blot显示在Mr约为21×103, 19×103, 19×103, 16.5×103处出现融合表达条带. 融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的20%. 结论:全长及3种不同缺失突变的丙型肝炎病毒核心蛋白基因均在大肠杆菌中得到有效表达.     

丙型肝炎病毒结构区基因变异的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）结构区主变异在HCV感染慢性化中的作用。方法：采用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增HCV的C、E1及E2／NS1区核苷酸片断（1kb）,扩增产物进行克隆,以单链构象多态性（SSCP）／异质性双体分析（HDA）方法对每份血清中30个克隆的C／E1和E2／NS1区准种（Quasispecies）进行优化筛选,分析HCV急性感染者和持续性感染者血清种复杂性。结果：HCV的C／E1区和E2／NS1区增片段形成的SSCP条带间差异明显,但E2区形成的异质性双体与同源双体之间差距准种复杂性的增加与病毒持续性感染有关。     

中国大陆基因2a/Ⅲ型丙型肝炎病毒部分基因的cDNA序列分析

目的分析来源于徐州的中国株２ａ／Ⅲ型丙型肝炎病毒（ＨＣ－ＸＺ）的部分核苷酸序列。方法以逆转录巢式聚合酶链反应获得位于７９１８位至８２９３位间的ｃＤＮＡ片段，聚合酶链反应直接序列分析技术测定核苷酸序列，计算机分析其特征。结果与日本株２ａ／Ⅲ型丙型肝炎病毒（ＨＣＪ６）及中国株１ｂ／Ⅱ型丙型肝炎病毒ＨＣＣ２相比，ＨＣＸＺ在核苷酸水平的同源性分别为８９．６０％与６８．００％，在氨基酸水平的同源性分别为９２．９２％与６９．０３％。ＨＣＸＺ与ＨＣＪ６在此区域的亲水性相仿。结论ＨＣＸＺ与ＨＣＪ６属于同一亚型，且亲缘性较高。     

丙型肝炎病毒基因NS_5区酶切分型研究

目的 :了解丙型肝炎病毒 (HCV)感染的基因型及其与临床的关系。方法 :用逆转录套式聚合酶链反应 (RT PCR)和限制性片断长度多态性 (RFLP)分析的方法 ,对 78例HCV感染患者进行HCVNS5区基因分型。结果 :HCV 1b型感染 71例 (91% ) ,HCV 2a型 7例 (9% ) ,未发现其它基因型 ;丙型肝炎患者有无输血史、是否重叠HBV感染 ,其基因分型构成比均无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;1b型HCV血清ALT异常者 (6 3.4% )明显多于 2a型(14.3 % ) (P <0 .0 5 )。结论 :本组HCV感染的基因型多数为 1b型 ,少数为 2a型 ,1b型更易致肝细胞损伤 ,并可能与活动性肝病有关     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因序列变异分析

为了研究西安地区丙型肝炎病毒基因组中Ｃ区基因的变异性,采用单链构象多态性（ｓｉｎｇｌｅ－ＳｔｒａｎｄＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ,ＳＳＣＰ）分析方法,对３６份ＨＣＶＲＮＡ阳性血清的ＰＣＲ产物进行分析,结果有３１份样品的ＳＳＣＰ图谱同,对其中二份样品进行测序,证明序是相同的;     

丙型肝炎病毒山东分离株核衣壳蛋白区cDNA的序列测定

①目的　通过核衣壳蛋白区（ Ｃ区）基因序列分析,对丙型肝炎病毒（ Ｈ Ｃ Ｖ）山东分离株进行定型。②方法　应用反转录套式聚合酶链反应（ Ｒ Ｔｎｅｓｔｅｄ Ｐ Ｃ Ｒ）方法,从山东省 Ｈ Ｃ Ｖ 抗体阳性血清中扩增出 Ｈ Ｃ Ｖ Ｃ区基因的一个片段（４３２ｂｐ）,对其进行 Ｔ Ａ 克隆及测序,并通过 Ｄ Ｎ Ａ Ｓ Ｉ Ｓ软件和 Ｇｅｎｅｂａｎｋ 进行序列分析。③结果　此分离株与基因型１ｂ 的 Ｈ Ｃ Ｖ 分离株同源性最高,与４ 个已知 １ｂ 型分离株的核苷酸相应序列同源性为 ９６．５２８％ ～９８．１４４％ ,其推导的氨基酸同源性为９４．４４４％ ～９６．０３２％ ．④结论　此分离株归为 １ｂ 型。     

建立转录丙型肝炎病毒结构区基因细胞模型的研究

目的：建立转录丙型肝炎病毒(HCV)结构区基因的细胞模型，为研究中药在体外对HCV结构区基因转录的抑制作用提供实验用细胞模型。方法：用脂质体将已构建好的含HCV结构区基因1.73kb的真核细胞表达载体pBK—CMV转入人HeLa细胞，用G418选择性培养基筛选出成功转染的HeKa细胞(HeLaD细胞)，用Trizol提取HeLaD细胞的总RNA，通过特异性引物进行逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)，从mRNA水平来验证HeLaD细胞中HCV结构区基因的有效转录。结果：对从HeLaD细胞抽提的总RNA作RT—PCR，得到144bp的特异的扩增片段，证实HCV结构区基因在HeLaD细胞中有转录水平的表达。结论：重组质粒pBK—CMV能被成功地转染人HeLa细胞，且HCV的结构区基因能够有效地表达，成功建立了能转录HCV结构区基因的细胞模型-HeLaD。     

白血病微卫星不稳定与靶基因移码突变的研究

探究微卫星不稳定（MSI）的急性淋巴细胞白血病（ALL）中1 和基因微卫星序列移码突变的情况。方法采用荧光片段聚合酶链反应（PCR）对ALL细胞株和临床样本行MSI检测。采用基因测序和荧光片段PCR 检测1 、基因微卫星序列的移码突变。结果ALL 细胞株MSI 阳性率为80.0%（4/5）;儿童ALL 患者骨髓样本MSI 阳性率为25.0%（3/12）;成人ALL 患者骨髓样本MSI 阳性率为20.0%（2/10）。Molt4 细胞株中1 基因微卫星序列存在移码突变c.22delC, 基因微卫星序列存在移码突变c.2560delA;CCRF-CEM 细胞株中1 基因微卫星序列存在移码突变c.22delC;ALL患者骨髓样本中1 和基因微卫星序列均未检测到上述移码突变。结论MSI诱导1 和基因微卫星序列移码突变可发生于ALL细胞株。     

庚型肝炎病毒RNA NS3区基因分型

目的：探讨HGVNS3区基因变异与基因型的关系。方法：对32株NS3区序列进行酶切位点分析，比较中国株与GBV－C株和已发表的HGVNS3区酶切位点，选择特异性内切酶切点。结果：32株NS3序列酶切位点分析表明存在5种基因型。1组：在4338位无HhaI切点，而在4360位有HhaI切点；2组：4338位及4360位均无HhaI切点；3组：仅在4338位有HhaI切点；4组：4338位及4351位有HhaI及Tsp509I切点；5组：4351位有Tsp509I切点。其核苷酸变异率分别为0．85％、19．0％、20．5％、18．2％、19．6％等。结论：中国株与西非、东非、加拿大、美国及日本株不是同一基因型。     

中国HCV一株NS5区部分基因克隆及序列分析

研究HCVNS5基因的结构与功能，为进一步研制适合我国使用的第3代抗-HCV试剂打下基础。方法：自行设计引物，从河北固安县慢性丙型肝炎患者血中，用逆转录-聚合酶链反应扩增出HCVNS5基因，并将其克隆到载体pKPL-3α，经Dotblot、Southernblot和限制性内切酶分析筛选出阳性克隆pKHC－5α，进行序列测定。结果：核苷酸序列分析表明，克隆的HCVNS5基因与HCVⅡ／1b的核苷酸同源性约90％。结论：所克隆的HCV属于我国常见的HCVⅡ／1b基因型。     

某院住院患者乙型和丙型肝炎病毒感染状况调查与分析

目的了解医院住院患者乙型和丙型肝炎病毒感染的血清流行病学状况。方法采用酶联免疫法对医院2012年住院患者肝炎病毒血清标志物HBsAg和抗-HCV进行检测。结果住院患者HBsAg总体阳性率为9．84％,抗-HCV总体阳性率为0．75％;儿科HBsAg阳性率最低,为4．93％,血液内科抗-HCV阳性率最高,为1．94％,阳性率与其他科室差异有统计学意义（P〈0．05）;HBsAg和抗-HCV阳性率在性别差异无统计学意义（P〉0．05）;51～60岁年龄段HBsAg阳性率最高,0～10岁年龄段HBsAg最低,二组差异有统计学意义（P〈0．05）;从事服务业的住院患者HBsAg、抗-HCV阳性率最高,与其他职业阳性率差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论医院住院患者HBsAg阳性率较高,应做好患者院内感染和医务人员职业感染的预防工作,对感染患者予以及时有效的治疗。     

肝病患者丙型肝炎病毒感染及C基因分型

以第２代抗体法分析急、慢性肝病患者中丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染，并对ＨＣＶ阳性者以型别特异的逆录聚合酶链反应进行Ｃ基因分型。在６４４例肝病患者中，第２代抗体阳性率为肝癌７．３％，急性肝炎３．４％，慢性肝炎６．６％，肝硬化６．６％；非肝病患者１０６例中，阳性率为３．８％。慢性肝炎ＨＢＶ感染达８９．５％。４１例ＨＣＶ阳性者的Ｃ基因分显示：Ⅱ型占８５．４％、Ⅲ型７．３％、Ⅱ／Ⅲ混合型７．３％，未见其他型     

佛山地区TTV感染情况调查

目的：调查佛山地区TT病毒（TTV）感染的情况，了解TTV与肝炎的关系。方法：选取非甲-庚肝炎患者、慢性乙型肝炎患者、静脉药瘾者及健康人群（健康义务献血员）血清作TTV-DNA扩增，微板核酸杂交-ELISA技术作TTV检测及TTV基因分型。了解不同人群TTV感染率及TTV的基因分布情况。结果：非甲-庚肝炎患者中检出29例，阳性率7.13％。慢性乙型肝炎患者中检出23例，阳性率6.46％。静脉药瘾者中检出11例，阳性率13.25％。健康人群中检出1例，阳性率0.63％。对64例TTV阳性标本进行基因分型，其中Ⅰ型60例，Ⅱ型4例。64例TTV感染者中6例肝功能检查ALT正常。结论：佛山地区存在TTV感染，基因型以I型为主。其中非甲-庚肝炎患者、慢性乙型肝炎患者、静脉药瘾者的感染率较高，为TTV感染的高危人群。TTV为非甲-庚肝炎的病原之一，存在着无症状携带状态。其传播似与血液途径有密切关系，可单独或混合感染致病，其在人群中的感染似与HBV感染存在与否无关。     

慢性丙型肝炎患者HCV核心蛋白基因及其肽链的序列分析

为探讨丙型肝炎病毒感染在肝癌发生中的作用，从３５例ＨＣＶ－ＲＮＡ阳性的非甲非乙型肝病患者血清中提取ＨＣＶ－ＲＮＡ，经随机引物逆转合成ｃＤＮＡ，在病毒的Ｃ基因区进行分型，再于病毒５‘－末端至Ｅ１区进行测序分析。     

肝癌和癌旁组织中HCV—RNA及其负链的研究

该研究采用ELISA法,对肝癌患者的血清检测HCV—Ab,用Nested-PCR法对患者的血清、肝癌组织和癌旁组织检测HCV-RNA和HCV-RNA负链,探讨肝细胞癌中是否存在HCV-RNA及其复制状态。对照组血清检测HCV-Ab、HCV-RNA1/17阳性。肝癌组16/31 HCV-RNA阳性;癌旁组织15例测到HCV-RNA负链,癌组织只有6例测到负链。结论:血清中抗HCV检测不能完全反映肝内是否曾有HCV感染情况。癌组织和癌旁组织均能检出HCV-RNA,说明肝癌组织中感染着丙型肝炎病毒。肝癌组织中确实存在HCV-RNA负链,说明HCV-RNA能在肝组织内不断地自我复制。     

分子杂交检测人血清中乙肝病毒DNA

作者采用放射性同位素~(32)P标记的HBV-DNA探针,与固定在硝酸纤维膜上的乙肝病杂交,然后经过放射自显影测人血清中的乙病肝毒,取得了满意的结果,可在临床检验中推广应用。