SELDI-TOF-MS蛋白质芯片技术实验条件优化

表面加强激光解析电离-飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ionizatiOn-time of flight-mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)技术是近年在基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱法(matrix-assisted lascr desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)基础上改良发展起来的一种蛋白质分离技术[1-2].本研究采用美国Ciphergen公司3种不同类型的化学表面芯片(CM-10、H4、IMAC-3-Cu),探索建立蛋白质指纹图谱的最优化条件,初步筛选出研究细胞株蛋白质的最佳芯片,评估SELDI-TOF-MS技术结合蛋白质芯片分析的可靠性和重复性.为今后的进一步研究奠定基础.     

单纯性室间隔缺损血清标志蛋白的筛选

目的应用蛋白质组学表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱技术筛选单纯性室间隔缺损血清标志蛋白,为从蛋白质分子水平研究其致病机理奠定基础。方法用CM10芯片检测56例单纯性室间隔缺损患儿、85例儿科常见病患儿及23例其它先天性心脏病患儿血清,分析血清蛋白质谱,筛选室间隔缺损血清标志蛋白。结果有25个蛋白成分在三组之间具有统计学差异,其中,与儿科常见病对照组相比,11个蛋白成分在VSD血清中高表达,14个下调;与其它先天性心脏病组相比,14个蛋白成分在VSD血清中高表达,11个下调。结论表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱技术可能是发现与筛选室间隔缺损血清标志蛋白的快速、有效的蛋白质组学工具。     

基于iTRAQ技术筛选室间隔缺损患儿血清蛋白标志物

目的:应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术结合LC-MALDI-TOF/TOF方法比较室间隔缺损(VSD)患儿和健康对照组儿童血清中的差异表达蛋白质,筛选并鉴定潜在的VSD血清蛋白标志物。方法:收集VSD患儿和与之相匹配的健康儿童血清各30例,组内等量混合后利用多重免疫亲和层析柱(MARS)去除14种高丰度蛋白,iTRAQ试剂标记后的样本应用二维液相色谱分离,采用MALDI-TOF/TOF质谱鉴定及相对定量。结果:质谱鉴定出置信度>95%的蛋白质共166种,其中差异表达蛋白质21种,VSD组较健康对照组表达量上调≥1.5倍的蛋白质有13种,下调≤0.67倍的蛋白质有8种。结论:筛选出多种与VSD相关的差异表达蛋白质,为进一步验证VSD血清蛋白标志物奠定了基础。     

双向电泳-质谱技术寻找原发性高尿酸血症血清差异蛋白初探

目的 通过对比分析正常人和高尿酸血症患者血清蛋白双向电泳图谱,初步分析高尿酸血症血清差异蛋白.方法 采用双向凝胶电泳(2-dimentional gel electrophoresis,2-DE)和基质辅助激光解吸飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)对高尿酸血症患者和对照组健康人血清进行分析,寻找高尿酸血症血清差异蛋白.结果 差异表达蛋白质点数为10个,质谱成功鉴定出4个差异蛋白质,其中补体C3、触珠蛋白、α1-抗胰蛋白酶呈上调表达,载脂蛋白L1呈下调表达.结论 补体C3、触珠蛋白、o1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白L1在高尿酸血症组和正常对照组血清中存在差异,但结果有待运用其他生物学的方法进一步验证.     

血清TMT标记定量蛋白质组学对多囊卵巢综合征病因研究

目的 通过应用串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)联合液相色谱-串联质谱(liquid chromatography/tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技术、差异表达蛋白及其相关生物通路对多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)患者病因研究。 方法 本研究纳入20例PCOS患者作为PCOS组,18例正常女性作为对照组。通过TMT联合LC-MS／MS检测所有研究对象的空腹血清样本,对数据进行统计学和生物信息学分析。 结果 鉴定了38个差异表达蛋白质,其中21个蛋白在PCOS中表达上调(FC≥1.2,P＜0.05),17个在PCOS中表达下调(FC≤0.83,P＜0.05)。采用京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)和Reactome对差异表达蛋白进行富集分析,分别富集到18个和78个通路。将两个数据库富集分析结果整合,均发现补体级联反应的富集通路,共同涉及的差异表达蛋白为甘露糖结合蛋白(mannose-binding protein,MBL)。 结论 PCOS患者体内可能存在补体系统的过度激活,差异蛋白MBL可能是其中的关键致病因子。     

SELDI-TOF-MS技术在生物医学应用中局限性

表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术(surface-enhanced laserdesorption/ionization-time Of flight-mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)是近年发展起来的蛋白质组学研究前沿技术[1].2001年以来,国内外许多文献报道介绍了用SELDI-TOF-MS技术分析血浆/血清等人体液中的差异表达蛋白质图谱,发现多种肿瘤等疾病如卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肾癌、肺癌等相关生物标志物[2].随着研究深入,SELDI-TOF-MS技术在生物医学中研究中重现性较差,引起了人们注意[3-5].由于逐渐发现和了解SELDI-TOF-MS技术应用于生物医学研究中的问题和局限性,导致对SELDI-TOF-MS技术的血浆/血清蛋白质图谱产生争议[5-7].本研究对该技术在生物医学研究中若干方法学上问题及其局限性作一综述.     

氢醌对人骨髓间充质干细胞蛋白质表达谱的影响

[目的]了解氢醌（HQ）对人骨髓间充质干细胞蛋白表达谱的影响,筛选HQ骨髓毒性作用的靶蛋白。[方法]体外分离并培养人的骨髓间充质干细胞至第3代,随即将细胞分为实验组和对照组。实验组用5×10^-5mol/L的HQ染毒24h;对照组加入相同浓度的磷酸缓冲液处理24h。染毒完毕后即刻抽提两组细胞的总蛋白,然后利用双向凝胶电泳技术和LC-Qq-TOF质谱技术进行蛋白表达谱分析,找到可能的HQ骨髓毒性靶蛋白。[结果]在3次重复实验中,对照组与HQ处理组相比较,均有约20个差异蛋白点。其中3次中有11个重复的差异蛋白点,质谱分析鉴定出膜联蛋白-Ⅱ、甲酰-谷胱苷肽水解酶、尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶和醛缩酶-A4个蛋白点。[结论]HQ可诱导膜联蛋白-Ⅱ、醛缩酶-A和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶表达下调及甲酰-谷胱苷肽水解酶表达的上调。     

血水草血根碱致钉螺肝脏差异表达蛋白质的鉴定

目的 分析血水草血根碱致钉螺肝脏蛋白质表达的变化.方法 从血水草粉末中分离血根碱,配成5 mg/L水溶液,每500 ml药液投放50只钉螺,25℃浸泡36 h,解剖活螺并收集肝脏,双向电泳分离血根碱处理组和清水对照组钉螺肝脏蛋白质,ImageMaster 2D 5.0软件分析图谱,筛选差异蛋白质,并用质谱鉴定.结果 血根碱组和清水对照组分别检出(433±14)、(385±12)个蛋白质点;质谱鉴定获得11个差异表达蛋白,分别是原肌球蛋白、假定蛋白XP_533132、肌动蛋白87E、角蛋白6A、β-微管蛋白、线粒体内膜蛋白4样蛋白、角蛋白2、咽侧体抑制激素A前体、ENSANGP00000020184、肌动蛋白-3、ENSANGP00000013943.其中假定蛋白XP_533132、ENSANGP00000013943在血根碱处理组表达下调,其余9个蛋白质在血根碱处理组表达上调.结论 血根碱引起钉螺肝脏蛋白质表达发生改变.     

染矽尘大鼠早期肺组织蛋白质双向电泳图谱差异分析

目的 应用比较蛋白质组学方法分析染矽尘大鼠早期肺组织蛋白质表达的变化,寻找矽肺发病早期差异表达蛋白,以探讨矽肺发生发展的相关机制.方法 采用随机数字表法将Wistar大鼠分为对照组和染矽尘组(每组4只).气管暴露法建立染矽尘大鼠模型,14 d时处死大鼠取肺组织,提取总蛋白,双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析鉴定差异蛋白.免疫印迹法(Western blotting)检测差异蛋白在肺组织中的表达.结果 初步筛选出存在明显差异的11个蛋白点,经质谱鉴定得到6种蛋白质.与对照组相比,染矽尘组组织蛋白酶D前体、硫氧还蛋白过氧化物酶-1(peroxiredoxin-1,Prx-1)、热休克71 000同源蛋白(heat shockcognate 71 000 protein,HSP7C)、不均一核糖核酸核蛋白A3(hnRNPA3)、表皮脂肪酸结合蛋白(E-FABP)表达上调,两组中吸光度值(A值)分别为116.50±12.56、148.75±22.40;40.00±1.63、66.00±13.93;51.25±7.37、92.75±8.69;83.00±6.48、122.75±24.62;50.75±6.50、93.50±23.10;100.25±19.99、142.50±21.21;差异有统计学意义(t值分别为-2.51、-3.71、-7.28、-3.12、-3.56、-2.90,P值均<0.05).而SEC14类蛋白3表达下调,两组A值为153.00±11.28、109.75±18.32,差异有统计学意义(t=4.02,P<0.01).Western blotting结果显示差异表达蛋白Prx-1在染矽尘组与对照组中A值分别为0.61±0.05、0.35±0.05,染矽尘组中表达上调(t=-7.24,P<0.01),与双向电泳结果一致.结论 应用2-DE建立了染矽尘大鼠早期肺组织双向电泳图谱,分离并初步鉴定了6种与矽肺相关的差异表达的蛋白质,为研究矽肺发生发展相关机制提供了新的线索.     

宫颈癌组织CHD1L ECRG4蛋白表达及其与HR-HPV感染的临床关系研究

目的探讨宫颈癌组织染色质解旋酶DNA结合蛋白1样基因(CHD1L)、食管癌相关基因4(ECRG4)蛋白表达,并分析其与高危-人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染的临床关系。方法选取98例宫颈癌患者癌组织、癌旁正常组织采用免疫组化法检测CHD1L、ECRG4蛋白表达并对比,对比不同临床病理特征患者宫颈癌组织CHD1L、ECRG4蛋白表达;分析宫颈癌组织CHD1L、ECRG4蛋白表达与HR-HPV感染的临床关系。结果宫颈癌组织CHD1L蛋白表达阳性率高于癌旁正常组织,ECRG4蛋白表达阳性率低于癌旁正常组织,差异均有统计学意义(P<0.05)。Ⅲ~Ⅳ期、腺癌、未/低分化患者宫颈癌组织CHD1L蛋白表达阳性率均高于Ⅰ~Ⅱ期、鳞癌/其他、中/高分化患者,宫颈癌组织ECRG4蛋白表达阳性率均低于Ⅰ~Ⅱ期、鳞癌/其他、中/高分化患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。HR-HPV感染占比为77.55%,HR-HPV感染患者宫颈癌组织CHD1L蛋白表达阳性率高于无HR-HPV感染患者,ECRG4蛋白表达阳性率低于无HR-HPV感染患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。宫颈癌组织CHD1L与HR-HPV感染呈正相关(r=0.702,P=0.026),ECRG4蛋白表达与HR-HPV感染呈负相关(r=-0.792,P=0.010)。结论宫颈癌组织CHD1L蛋白表达阳性率高,ECRG4蛋白表达阳性率低,与临床分期、病理类型、分化程度均有关,且前者与HR-HPV感染呈正相关,后者于HR-HPV感染呈负相关。     

SELDI蛋白芯片技术检测叶酸对胎鼠神经干细胞作用的蛋白表达谱

目的 探讨应用表面增强激光解离飞行时间质谱技术(surface-enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)测试不同剂童叶酸作用下胎鼠神经干细胞(NSCs)的蛋白质表达谱,从中筛选出差异表达蛋白.方...     

应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析宫颈鳞癌早期浸润蛋白质

目的探讨基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization ti me of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)对宫颈鳞癌(squamous carcinoma of thecervix,SCC)组织切片直接分析,获取宫颈鳞癌早期浸润的分子标志物的有效性。方法利用超微量点样枪将化学基质直接点样到宫颈鳞癌组织切片上,然后利用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱直接扫描宫颈鳞癌组织切片,分析宫颈鳞癌组织蛋白质分子。结果获得的25种蛋白质质谱峰强度比较,差异有显著意义(P<0.05)。其中7种差异蛋白质有分类意义,其质/核(M/Z)分别为:m/z3433,m/z4786,m/z10092,m/z10835,m/z15114,m/z15854和m/z16345。差异蛋白质m/z3433,m/z15114,m/z15854在宫颈鳞癌鳞状上皮组织高度表达,可作为宫颈鳞癌早期诊断的标志蛋白;差异蛋白质m/z16345在宫颈鳞癌的间质组织高度表达,可作为宫颈鳞癌早期间质浸润和扩散诊断的标志蛋白。结论利用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术成功获取一组差异蛋白质。该差异蛋白组可望作为宫颈鳞癌早期诊断的标志蛋白。     

室间隔缺损血清候选标志物锌指蛋白41的验证研究

目的 验证锌指蛋白41(zinc finger protein 41,ZNF41)是否为室间隔缺损(ventricular septal defect,VSD)患者的血清候选标志物.方法 收集室间隔缺损患者的血清和与之性别、年龄、民族等频数相匹配的房间隔缺损(atrial septal defect,ASD)患者、法洛四联症(tetralogy of Fallot,TOF)患者和健康对照者的血清各20例,应用蛋白免疫印迹(Western blot)和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,EUSA)检测各组血清样本中锌指蛋白41的表达水平.结果 Western blot检测结果显示,锌指蛋白41在4组血清中均有表达,但VSD组中的相对表达水平均高于其他3组(均有P＜0.05);ELISA检测结果可知VSD组的血清锌指蛋白41浓度为(136.72±56.44) pg/ml,ASD组为(94.54 ±41.98) pg/ml,TOF组为(100.69 ±37.08) pg/ml,健康对照组为(82.08 ±42.46)pg/ml,4组间差异有统计学意义(P =0.008),进一步两两比较,VSD组与其他3组之间差异均有统计学意义(均有P＜0.05),而其他3组两两间差异均无统计学意义(均有P＞0.05).结论 锌指蛋白41在VSD患者血清中表达水平较高,可能是VSD的血清候选标志物.     

裸鼠皮下人鼻咽癌移植瘤模型体内差异表达蛋白的检测

[目的]分析裸鼠皮下人鼻咽癌移植瘤模型体内血清中的蛋白指纹图谱,并与正常对照裸鼠比较,筛选差异表达蛋白,为鼻烟癌的早期诊断提供特有的血清蛋白标志物. [方法]采用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)蛋白芯片技术检测12只正常裸鼠和45只裸鼠皮下人鼻咽癌移植瘤模型体内血清中的蛋白指纹图谱,用Ciphergen ProteinChip 3.0 软件进行数据的校正与分析,采用Ciphergen Biomaker Wizard 3.1版软件分析筛选对照与试验组间的差导表达蛋白. [结果]对照组与试验组间检出17个差异表达的蛋白质(P<0.0001),其质荷比(M/Z)分别为13447、14586、8948、8017、5553、6742、14743、11586、15675、9178、6423、14940、15492、11528、8615、6738、8102.分子量主要集中在20 000 D以内.大多数标志蛋白在试验组中表达明显增高,少数为低表达.在裸鼠皮下人鼻咽癌移植瘤模型体内随时间的推移而出现一些规律性表达的蛋白质、质荷化(M/Z)为6738、8017、8102、8615的4个蛋白质在接种癌细胞后表达逐渐增强,质荷比(M/Z)为14740、15484的两个蛋白质表达逐渐域弱. [结论]在正常裸鼠和裸鼠皮下人鼻咽癌移植瘤模型之间发现具有一定价值的差异表达蛋白,对鼻咽早期诊断的微量蛋白标志物的研究具有极其重要的意义.     

菱仁挥发成分超临界萃取及GC-MS分析

菱角为生长在池沼和湖泊浅水之中药食同用的菱科菱属植物[1],民间用于治疗溃疡,胃癌及食道癌等疾病[2].本研究前期工作通过传统水蒸气蒸馏法对菱角挥发油进行了提取,对菱角的化学成分和药效学进行了试验研究[3-7].为进一步了解菱角成分并解释其药效学物质基础,充分利用菱资源,采用超临界二氧化碳(SFE-CO2)萃取方法 对菱仁挥发油进行了提取,并运用气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪进行成分分析[8-10],结果 报告如下.     

食品及饲料中三聚氰胺检测方法研究进展

1992年,Okumura M等研究三聚氰胺的毒理作用,发现三聚氰胺能导致实验动物膀胱结石形成,并具有致癌性[1],之后的研究得到了相同的结论[2-3].2007年3月,美国食品药品管理局(FDA)在宠物食品中发现了三聚氰胺(mela-mine).随后,FDA和欧洲食品安全机构(EFSA)对三聚氰胺进行了初步风险评估[4].由于在饲料、宠物食品、乳制品、鸡蛋、水产品中检出三聚氰胺的报道引起了人们对食品安全的更多关注[5],国家有关部门相继发布了饲料、乳制品中三聚氰胺检测方法.目前常用的检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法、气相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法、酶联免疫法、光电比色浊度法等.本研究对其检测技术研究进展作一综述.     

幽门螺杆菌感染对冠心病患者血清炎症因子的影响

目的 探讨幽门螺杆菌(Hp)感染对冠心病(CHD)患者血清溶性细胞间黏附分子1(sICAM-1)、白细胞介素6(IL-6)和高敏C-反应蛋白(hs-CRP)等炎症因子表达水平变化的影响.方法 选择2010年3月-2011年4月于医院健康体检中心查体的CHD患者45例为研究对象,另选择30名健康体检者为对照组,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测HpIgG、sICAM-1、IL-6及hs-CRP的表达水平,分析Hp感染与sICAM-1、IL-6及hs-CRP表达变化之间的关系.结果 CHD组患者Hp-IgG阳性率为75.6％、血清sICAM-1(509.56±63.45)μg/L、IL-6(37.29±14.69)ng/L及hs-CRP(8.26±3.68)mg/L的表达水平均昆著高于对照组的50.0％,(154.24±27.39)μg/L、(15.63±6.84)ng/L及(4.72±2.38)mg/L,差异有统计学意义(P＜0.05),Hp感染阳性CHD患者的血清sICAM-1(615.86±89.45)μg/L、IL-6(44.09±13.49)ng/L及hs-CRP(10.52±3.48)mg/L表达水平均明显高于Hp感染阴性患者的(395.72±71.49)μg/L、(25.93±9.83)ng/L、(5.91±2.18)mg/L,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Hp感染与CHD的发生有关,Hp感染可能通过激发血清sICAM-1、IL-6及hs-CRP表达水 平而加重冠状动脉内炎症反应,参与动脉粥样硬化的病理过程.     

苯并[a]芘作用下ADP-核糖基化修饰蛋白分析方法的建立

目的建立苯并[a]芘(B[a]P)作用下ADP-核糖基化修饰蛋白分析方法。方法使用免疫共沉淀技术收集可能发生ADP-核糖基化修饰的蛋白,同步使用高效液相色谱技术和双向电泳技术对蛋白进行分离,再进行MALDI-TOF-MS/MS鉴定,比较两种分离方法鉴定蛋白的差异,并将鉴定蛋白的氨基酸序列与文献报道的ADP-核糖基化修饰蛋白的保守序列进行比对。结果通过高效液相色谱分离结合质谱鉴定找出3个蛋白,双向电泳分离结合质谱鉴定找出12个蛋白,双向电泳分离结合质谱鉴定方法存在明显优势;所鉴定蛋白存在与文献报道的ADP-核糖基化修饰蛋白相似的保守序列。结论免疫共沉淀蛋白双向电泳分离结合质谱鉴定方法可用于分析ADP-核糖基化修饰蛋白,并发现ADP-核糖基化蛋白存在相对保守的结合序列。     

冠心病儿童期危险因素及临床意义

冠状动脉性心脏病(Coronary Heart Disease CHD)已成为致死的主要原因.随着生活水平的提高,人们饮食结构和生活方式的改变,我国冠心病的发病率和死亡率也有增加,而且冠心病的发病有年轻化的趋势[1,2].Bogalusa心脏研究和青年粥样硬化的病理决定因素(PDAY)研究组的研究证实粥样硬化的病理过程在儿童期便开始出现[3],大量流行病学研究表明儿童期已经出现传统冠心病危险因素(如肥胖、高血压、血脂异常、高血糖、被动吸烟、早发冠心病家族吏、不健康的饮食习惯及运动习惯)的聚集现象,发展成儿童代谢综合症[4].近年来研究发现新的与冠心病发生有关的因素(如高敏C反应蛋白、纤维蛋白原、糖化血红蛋白、丙氨酸氨基转移酶、血清尿酸)在儿童时也已经存在异常[5-7].拥有多个冠心病危险因素的儿童到成人时冠心病的危险因素明显增加.该文综述了冠心病儿童期的危险因素及临床意义,为其防治提供依据.     

参考文献的若干规范

正(1)参考文献的引用和著录须按GB/T 7714-2015《信息与文献参考文献著录规则》;(2)期刊:主要责任者.题名[文献类型标志].连续出版物题名:其他题名信息,年,卷(期):页码.例如:[1]李燕平,胡职权,郑建莉,等.龙岩市308株分枝杆菌鉴定及药敏试验结果[J].海峡预防医学杂志,2017,23(4):101-103.