双参通冠方药物血清对心肌细胞缺氧复氧损伤Ca~(2+)超载的影响

双参通冠方(SSTG)由人参、丹参、元胡3药的有效组分提取物组成,前期工作表明,该方是治疗心肌缺血再灌注损伤的有效中药制剂[1]。本实验运用血清药理学方法,在进行双参通冠方时-效、量-效及血清中含药成分研究后,确定SSTG含药血清制备的最优灌胃剂量、最佳取血时间,制备含药血清。复制心肌细胞缺氧复氧模型,观察SSTG含药血清对缺氧复氧损伤中Ca2+超载及心肌细胞膜ATPase活性的影响,阐明SSTG作用机制和作用环节。1材料与方法1·1     

双参宁心方血清药物化学和抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的实验研究

目的研究双参宁心方(SSNX)主要有效成分及其对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响。方法利用血药指纹图谱检测来源于SSNX的血中成分,并利用体外心肌细胞缺氧/复氧损伤实验进行验证。结果给药后血清样本中,共检测到15个来源于SSNX的原型成分,其中确定了人参皂苷Rg1、丹酚酸B、延胡索乙素、脱氢紫堇碱4个化学成分。在对心肌细胞缺氧/复氧损伤的实验中,人参皂苷Rg1、脱氢紫堇碱能抑制心肌细胞缺氧/复氧损伤导致的乳酰脱氢酶升高(P<0.05),丹酚酸B、延胡索乙素则能显著抑制乳酸脱氢酶的升高(P<0.01),对心肌细胞具有保护作用。结论提示人参皂苷Rg1、丹酚酸B、延胡索乙素、脱氢紫堇碱可能是SSNX抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的有效物质基础,可用于复方药代动力学的指标检测。     

甜菜碱对HepG2人肝癌细胞[Ca2+]i和细胞膜电位的影响

目的研究甜菜碱对肝癌HepG2细胞内游离Ca2 浓度([Ca2 ]i)和细胞膜电位的影响。方法Fluo-3/AM标记,激光扫描共聚焦显微镜观察HepG2细胞[Ca2 ]i,TMRE标记,激光扫描共聚焦显微镜测定细胞膜电位的影响。结果甜菜碱能够升高HepG2细胞[Ca2 ]i,降低细胞膜电位。升高[Ca2 ]i的强度具一定的剂量依赖性,随甜菜碱剂量的增大而升高。甜菜碱50、25mg/mL组与对照组比较差异非常显著(P<0.01),甜菜碱12.5mg/mL组与对照组比较差异显著(P<0.05)。给药48h时间段内细胞内的[Ca2 ]i升高的幅度较大,72h升高幅度相对较小。而降低膜电位上,在48h时间段内,甜菜碱50、25、12.5mg/mL各组膜电位均显著高于对照组(P<0.05),但在72h时间段内甜菜碱12.5mg/mL组与对照组比较没有显著性差异(P>0.05)。结论甜菜碱通过开放细胞膜上的通透性转换孔道(MPTP),从而升高HepG2细胞[Ca2 ]i,启动细胞凋亡机制,诱导HepG2细胞凋亡。     

针刺对局灶性脑缺血大鼠海马神经元细胞[Ca2+]i的影响

[目的]研究脑缺血不同时点大鼠海马神经元内游离Ca2+浓度[Ca2+]i及醒脑开窍针刺对其影响,探讨醒脑开窍针刺法早期干预对脑缺血的治疗作用。[方法]建立大脑中动脉所致局灶性脑缺血(MCAO)模型,采用醒脑开窍针刺法治疗,采用激光扫描共聚焦显微技术动态观察脑组织海马CA1区锥体细胞[Ca2+]i在不同时间点的变化。[结果]与正常组大鼠相比,模型组大鼠脑组织海马CA1区锥体细胞内游离[Ca2+]i(以细胞内Ca2+相对荧光强度表示)在局灶性脑缺血1 h时升高,持续升高至缺血24 h时(P<0.05)。假手术组与正常组相比[,Ca2+]i变化差异无统计学意义(P>0.05)。相应时间点非穴位针刺组与模型组[Ca2+]i比较,无统计学意义(P>0.05)。在相应时间点,醒脑开窍针刺组[Ca2+]i低于模型组(P<0.01)。[结论]急性局灶性脑缺血后大鼠海马神经细胞[Ca2+]i随缺血时间的延长而持续升高,提示细胞内钙超载;醒脑开窍针刺组能有效调节缺血区的[Ca2+]i,提示在缺血后针刺治疗效果越早越好,为临床及早应用针刺治疗缺血性脑血管病提供了理论依据。     

青龙衣多糖对S180小鼠红细胞Ca2+,Mg2+-ATP酶活性及[Ca2+]i的影响

目的考察青龙衣多糖对S180小鼠红细胞Ca2 ,Mg2 -ATP酶活性及[Ca2 ]i的影响。方法青龙衣多糖对S180小鼠ip给药7 d,比色法结合试剂盒测定S180小鼠红细胞膜Ca2 ,Mg2 -ATP酶的活性,采用激光共聚焦显微镜结合Fluo-3/AM荧光探针测定红细胞内[Ca2 ]i。结果青龙衣多糖能提高S180小鼠红细胞膜Ca2 ,Mg2 -ATP酶活性(P<0.05);降低S180小鼠红细胞[Ca2 ]i(P<0.05),并且青龙衣多糖的作用呈剂量依赖性,以高剂量组的作用最佳(P<0.01)。结论青龙衣多糖通过提高S180小鼠红细胞膜Ca2 ,Mg2 -ATP酶的活性,排除离子跨膜转运障碍,稳定其能量代谢和物质代谢,有利于维持细胞内Ca2 的正常浓度。     

芪丹通脉片对大鼠心肌细胞Ca2+及超微结构的影响

目的探讨芪丹通脉片(QDTM T)对急性心肌缺血的防治作用。方法SD大鼠ig QDTM T(2 g/kg)两周后,sc异丙肾上腺素(Iso,5 m g/kg)诱导急性心肌缺血模型。通过透射电镜观察心肌超微结构的变化;用比色法测定心肌组织及心肌细胞线粒体中C a2 水平及心肌细胞线粒体中C a2 -ATPase活力的变化。结果大鼠igQDTM T两周后,sc Iso所造成的心肌超微结构的损害明显减轻;心肌细胞线粒体中C a2 -ATPase活力增加,而心肌组织及心肌细胞线粒体中C a2 水平显著降低(P<0.01)。结论QDTM T可能是通过抑制心肌细胞线粒体中钙超载及保护心肌细胞超微结构,达到防治急性心肌缺血的目的。     

基于中药血清化学及血清药理学方法探讨香青兰保护心肌细胞缺氧/复氧损伤物质基础

目的:利用中药血清化学及血清药理学方法探讨香青兰保护心肌细胞缺氧/复氧损伤的物质基础。方法:测定和比较香青兰提取物及其灌胃给药前后大鼠空白血清和含药血清的HPLC,寻找香青兰入血成分;体外培养乳大鼠原代心肌细胞及H9c2细胞,用Na2S2O4或N2为缺氧剂建立缺氧/复氧损伤模型,以细胞活力、LDH释放量、T-SOD活力、MDA产量及细胞凋亡为指标,考察香青兰提取物及其含药血清、香青兰提取物不同给药剂量及不同给药时间段所采血清的处理物对细胞损伤的影响。结果:香青兰在血清中出现4个移行成分,其中3个为原型成分,1个可能为代谢产物;与模型组或空白血清组相比,香青兰提取物、含药血清及不同因素影响下的血清处理物显著降低缺氧/复氧心肌细胞LDH释放量和MDA产量(P<0.05,P<0.01),显著升高T-SOD及细胞活力(P<0.05,P<0.01),明显抑制细胞凋亡。结论:香青兰提取物4个入血成分可能为香青兰保护心肌细胞缺氧/复氧损伤的物质基础。     

灵芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞胞浆游离Ca2+浓度的影响

 目的:探讨灵芝多糖(GLP)对免疫细胞信号转导过程的影响?方法:采用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术,动态监测GLP均一体组分GLB₇对小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)胞浆游离Ca²⁺浓度([Ca²⁺]i)的影响?结果:GLB₇(20μg·ml^-1)引起小鼠腹腔MΦ中[Ca²⁺]i明显升高,升高值为(248±18)%(n=6);GLB₇引起小鼠腹腔MΦ外钙内流及MΦ内IP₃敏感和IP₃非敏感钙池释放Ca²⁺,[Ca²⁺]i升高值分别为(76±10)%,(58±10)%,(41±8)%(n=6);GLB₇对MΦ[Ca²⁺]i的影响与K⁺通道及其引起的膜电位变化无关?结论:MΦ是灵芝多糖作用的靶细胞;GLB₇引起MΦ中[Ca²⁺]i快速升高,可能是灵芝多糖产生作用的重要途径?     

益气通络方对缺氧再给氧心肌细胞bcl-2基因表达影响的血清药理学研究

目的：观察益气通络方含药血清对缺氧再给氧心肌细胞bcl-2基因表达的作用。方法：采用流式细胞仪检测缺氧再给氧心肌细胞bcl-2基因表达强度。结果：1．缺氧24h、再给氧4h组心肌细胞bcl-2阳性表达比率增加,与正常对照组比较具有显著差异（P＜0．01）;2．益气通络方低、中、高剂量含药血清组bcl-2阳性表达比率较单纯缺氧再给氧组增加,组间比较呈显著差异（P＜0．01）。讨论：缺氧再给氧能诱导心肌细胞bcl-2基因表达,益气通络方含药血清可增强其表达,可能是益气通络方保护缺氧再给氧心肌细胞,发挥抗缺血再灌注损伤的重要机制之一。     

针刺对惊厥性脑损伤大鼠海马神经元Caspase-12蛋白及内质网Ca2+表达的影响

目的:观察针刺对惊厥性脑损伤大鼠不同时点海马神经元内质网Ca²⁺表达、细胞凋亡和Caspase-12蛋白表达的影响,探讨针刺维持内质网钙稳态及抑制细胞凋亡级联反应的可能作用机制。方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组、针刺组,每组36只。采用腹腔一次性注射惊厥剂量(50 mg/kg)戊四唑造成大鼠惊厥。针刺组于惊厥后即刻针刺“百会”“大椎”30 min。各组分别于惊厥发作后2、12、48 h采用TUNEL法检测海马神经元细胞凋亡情况;采用内质网Ca²⁺荧光探针技术检测大鼠海马神经元内质网Ca²⁺表达;采用免疫组织化学法观察各组大鼠海马组织中Caspase-12蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组2、12、48 h海马神经元凋亡细胞数明显增加(P<0.01),海马神经元内质网Ca²⁺表达降低(P<0.01),Caspase-12蛋白表达升高(P<0.01);与模型组比较,针刺组在惊厥发作2、12、48 h海马神经元凋亡减轻,凋亡细胞数明显减少(P<0.05,P<0.01),...     

含药血清药理作用强度与体内给药的量效、时效关系研究

目的:考察含药血清药理作用强度与体内给药的量效、时效关系。方法:以中药有效组分配伍方剂双参通冠方不同灌胃剂量、药后不同取血时间所得的药物血清为受试药物;培养心肌细胞,进行缺氧复氧实验,复氧同时给予不同双参通冠方药物血清处理,实验结束后取培养上清检测LDH值,以LDH释放抑制率为指标,观察含药血清药理作用强度与体内给药的量效、时效关系。结果:体内给药量大所获得的药物血清其LDH释放抑制率并不一定高,二者之间无明显量效关系;药后不同时间取血所获得的药物血清对LDH释放的抑制率亦不相同,以药后90 min所得药物血清药理效应最佳。结论:体内给药量并非越大其药物血清药理效应越好,药后最佳取血时间亦得自行摸索。     

血府逐瘀浓缩丸抗血小板活化的临床疗效与体外血清药理作用的相关性研究

目的：探讨血小板活化在不稳定性心绞痛（unstable angina pectoris,UA)和急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI)中的意义以及血府逐瘀浓缩丸抗血小板活化的临床疗效及其体外血清药理作用的相关性。方法：采用流式细胞技术和特异性标记抗体，检测口服血府逐瘀浓缩丸前后UA患者全血血小板膜糖蛋白CD62P和CD41／45的表达，并以UA患者的含药血清与AMI模型小鼠的外周血体外共温育后，检测大鼠CD62P水平。结果：UA患者CD62P及CD41／45表达量增高，分别为（24．36±7．91）％和（29．51±12．21）％，经有效治疗后降至（19．57±7．22）％（与治疗前比较，P＜0．05）和（20．87±8．73）％；同时血小板粘附和聚集率增高。AMI大鼠CD62P为（39．73±12．36）％，与有效病例的含药血清后降至论（30．41±10．36）％（与温育前比较，P＜0．05），而疗效不佳患者的药后血清干预作用则较差（P＞0．05）。结论：UA患者和AMI大鼠的血小板活化增强。血府逐瘀浓缩丸含药血清药理与临床整体药效在抑制血小板活化作用上的一致性，反映出中药血清药理作用与临床整体药效的良好相关性。     

枸杞糖肽对缺氧及KCl诱导的心肌细胞钙超载的影响

目的:研究枸杞糖肽(LbGp)对低氧心肌细胞内钙浓度([Ca²⁺]_i)的影响,以及对KCl诱导的心肌细胞钙超载的影响。方法:采用SD大鼠乳鼠进行心肌细胞培养,建立心肌缺氧模型,实验分3组:正常对照组;缺氧模型组:细胞缺氧6h;枸杞糖肽预处理组:加入枸杞糖肽,再行缺氧6h。MTT法检测细胞活力。以Fluo/AM荧光指示剂负载,通过激光扫描共聚焦显微系统和Flou3/AM荧光指示剂标记技术,观察枸杞糖肽对缺氧心肌细胞游离钙含量的影响。加入终浓度60mmol·L^-1KCl溶液,动态观察KCl刺激后心肌细胞[Ca²⁺]_i的动态变化及LbGp预处理后对KCl诱导的钙超载的影响。结果:心肌细胞缺氧时间延长,损伤随之加剧,缺氧枸杞糖肽组心肌细胞荧光密度均较模型组显著降低(P<0.01),50μg·mL^-1LbGp最为明显,[Ca²⁺]_i明显减少。枸杞糖肽组加入KCl溶液后[Ca²⁺]_i荧光强度曲线升高,但与模型组比较,幅度明显减小,25,50,100μg·mL^-1LbGp且呈现量效关系。结论:低氧导致心肌细胞钙超载,而枸杞糖肽能减轻钙超载。亦能对抗KCl诱导的心肌细胞钙超载。机制之一是枸杞糖肽作用于L型钙通道。     

大枣中性多糖对小鼠腹腔巨噬细胞胞浆游离Ca^2＋浓度的影响

目的：探讨大枣中性多糖（JDP－N）对小鼠腹腔巨噬细胞（MΦ）胞浆游离Ca^2 浓度（[Ca^2 ]i)的影响。方法：采用激光扫描共聚焦显微镜技术（LSCM）测定[Ca^2 ]i。结果：JDP－N能引起MΦ内Ca^2 浓度[Ca^2 ]i明显升高,[Ca^2 ]i的升高是由胞外Ca^2 内流和通过IICP（IP3-induced calcium release)和CICR（calcium-induced calcium release)机制释放细胞内贮存Ca^2 引起。结论：[Ca^2 ]i升高是JDP－N活化MΦ的重要信号转导通路。     

电针对局灶性脑缺血大鼠脑细胞内Ca2+含量的影响

目的：研究电针对局灶性脑缺血大鼠脑细胞内Ca^2+的调节作用。方法：利用激光共聚焦扫描显微镜观察缺血区活体脑片中脑细胞内Ca^2+的变化。结果：缺血1h，皮质部细胞内Ca^2+含量还未出现明显变化，而纹状体部细胞内Ca^2+的含量明显升高；缺血3h，皮质部和纹状体细胞内Ca^2+含量均出现显著的升高，且纹状体细胞内Ca^2+含量明显高于皮质部；缺血3h并给予电针治疗30min后，则皮质部和纹状体细胞内Ca^2+含量均出现明显的下降。结论：电针可迅速调节缺血区脑细胞内的Ca^2+含量，抑制胞内Ca^2+超载，从而保护脑缺血后继发神经元的损伤。     

参元丹含药血清对缺氧复氧心肌细胞自噬的影响

目的:观察参元丹含药血清对缺氧复氧心肌细胞自噬的影响,探讨参元丹心肌保护作用机制。方法:建立缺氧复氧心肌细胞损伤模型,采用免疫细胞化学法观察心肌细胞微管相关蛋白1轻链3(LC3)和磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)表达,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法测定自噬相关基因(Beclin-1)和半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA表达量。结果:与正常对照组相比,缺氧复氧组LC3和PI3K荧光表达增强,参元丹含药血清组与相应浓度空白血清组相比,细胞LC3和PI3K荧光表达强度减弱,其中参元丹含药血清10%组PI3K荧光强度明显降低,具有统计学意义(P0.05);缺氧复氧组细胞Beclin-1和Caspase-3 mRNA表达量明显升高,与相应浓度空白血清组相比,参元丹含药血清组Beclin-1 mRNA表达水平明显降低;参元丹含药血清5%组Caspase-3 mRNA表达量降低。结论:参元丹含药血清对缺氧复氧细胞自噬具有抑制作用,可能与抑制PI3K,下调Beclin-1和Caspase-3基因有关。     

茯苓水提液对新生大鼠神经细胞内钙离子浓度的影响

探讨茯苓水提液对神经细胞内钙稳态的影响。应用双波长荧光分光光度计和激光共聚焦扫描显微镜测定新生大鼠大脑皮层神经细胞悬液和海马神经元原代培养在加入茯苓水提液后细胞内钙离离子浓度的变化。     

生脉散皂苷部位对大鼠培养心肌细胞内游离钙的调节作用

目的：研究生脉散皂苷部位对培养的大鼠单个心肌细胞内Ca^2+浓度的影响。方法：以Fluo-3AM负载心肌细胞，采用激光扫描共聚焦显微镜检测单个细胞内Ca^2+浓度的变化，结果：生脉散皂苷部位10μg/ml可明显增加心肌细胞内Ca^2+浓度，并使其持续在高水平（P＜0．01），，随后加入高Ca^2+和高K^+，对细胞内Ca^2+浓度无明显影响。生脉散泉苷部位100μg/ml诱导心肌细胞内Ca^2+浓度迅速明显增加后又迅速下降至静脉水平（P＜0．01），外加Ca^2+高K^+，不能刺激细胞内Ca^2+浓度明显增加，结论：生脉散皂苷部位对心肌细胞内Ca^2+浓度变化的影响与其浓度有关。