引起深圳市一起疱疹性咽峡炎暴发的柯萨奇A4病毒的鉴定及其VP1区序列分析

目的鉴定引起2012年深圳市罗湖区一起疱疹性咽峡炎暴发的病原体,并对鉴定的柯萨奇A4病毒(coxsackie virus A4,CVA4)的VP1基因进行全长的序列测定和遗传进化特征分析。方法采集罗湖区某幼儿园疱疹性咽峡炎暴发期间患儿的4份咽拭子样本和1份粪便标本,采用荧光RT-PCR法鉴定CVA4病毒,对阳性样本采用RT-PCR方法扩增CVA4病毒VP1区全长序列,并进行核苷酸序列测定和系统进化分析。结果病原学检测结果显示,引起此次疱疹性咽峡炎暴发的病原体为CVA4病毒。同源性分析显示,引起深圳疱疹性咽峡炎的CVA4病毒SZ-SK12030005、SZ-SK12030007与山东省2010株(KF150144)进化关系最近,核苷酸和氨基酸同源性分别为96.4%和99.5%;与2006年吉林株(JQ715708)的同源性最低,核苷酸和氨基酸同源性分别为87.9%和96.6%。VP1区亲缘进化树显示CVA4-SZ-SK12030005和CVA4-SZ-SK12030007属于GⅠB亚型。结论 GⅠB型CVA4病毒是引起此次深圳市疱疹性咽峡炎疫情的病原体。     

龙岩市柯萨奇病毒B5型基因特征分析

目的分析龙岩市2012年病毒性脑炎病例柯萨奇B组病毒5型(CVB5)的基因特征。方法采集患者脑脊液进行病毒分离,用中和试验确定毒株血清型,用008-013(GCRTGCAATGAYTTCTCWGT/GGIGCRTTICCYTCIGTCCA)和012-011(ATGTAYGTICCICCIGGIGG/GCICCIGAYTGITGICCRAA)两对引物分段扩增VP1区,进行序列分析。结果从152份患者脑脊液标本中,分离出2株CVB5,其部分VP1编码区序列长度为469/434个核苷酸,编码156/144个氨基酸。2株核苷酸同源性为92%,氨基酸同源性86%;与原型株Faulkner的核苷酸同源性73%~77%,氨基酸同源性82%~91%。与2011年3株龙岩分离株的核苷酸同源性83%~92%,氨基酸同源性78%~93%。系统进化树分析显示,2株龙岩分离株同属D组基因型。结论龙岩市2012年流行的CVB5病毒株出现了较大变异,患者可能出现神经系统并发症。应加强对CVB5株所致疾病的监测及其遗传进化的研究,为相关疾病防控提供依据。     

一起暴发性病毒性脑炎的病原学调查

目的 分离鉴定引发2010年河南省一起病毒性脑炎暴发的病原,并进一步分析该病原体分离株外壳蛋白1(VP1)区基因特征。方法 于2010年4月河南省平顶山市鲁山县病毒性脑炎暴发期间,采集8例住院患儿的粪便标本（共8份）,其中3例患儿同时采集脑脊液标本（共3份）,未采集到脑脊液标本的5例患儿中4例采集了血清标本（共4份）。对标本进行病毒分离和肠道病毒(EV)组合血清鉴定,对阳性分离物采用逆转录PCR方法扩增VP1区基因、测定核苷酸序列并进行亲缘进化分析。结果 采集的脑脊液、血清、粪便标本共15份,荧光定量PCR检测结果显示,11份标本EV通用检测阳性,其中2份粪便标本分离到2株病毒毒株,EV组合血清鉴定血清型别均为柯萨奇病毒(Cox)阳性,VP1区全长基因序列均为849 bp,与Cox B5的核苷酸相似性为77.1％～96.9％,氨基酸相似性为95.8％ ～ 100％,遗传发育树分析与D基因型属同一分支。结论 CoxB5是引起本次河南省平顶山市鲁山县病毒性脑炎暴发的病原体,其基因型为D基因型。     

浙江省2006年柯萨奇B3病毒VP1基因分析

目的：研究2006年浙江省无菌性脑膜炎的病原柯萨奇B3（CoxB3）分离株（Zhejiang／52／06）的VP1基因特征。方法：采用RD、Hep-2细胞对患者脑脊液和粪便标本进行病毒分离，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）扩增病毒VP1基因并进行序列测定，用BioEdit等软件分析处理。结果：浙江省柯萨奇B3分离株的VP1基因852个核苷酸，编码281个氨基酸，与北京、哈尔滨的CoxB3分离株核苷酸同源性在79．1％～79．2％，与欧美国家分离株的核苷酸同源性在78．5％～81，7％，与乌兹别克斯坦分离株核苷酸同源性为82．7％。进化树分析显示，浙江省柯萨奇B3分离株（Zhejiang／52／06）与B3／Uzbekistart／99、B3／Germany／PD00分离株亲缘关系最近。结论：柯萨奇B3分离株的变异特征及亲缘进化，分析对无菌性脑膜炎的流行病学研究具有重要意义。     

ECHO30所致无菌性脑膜炎暴发的病原学检测分析

[目的]明确引起无菌性脑膜炎暴发的病原体，从病原学角度探讨引起暴发的原因。[方法]按照WHO规定的标准方法进行病毒的分离、型别鉴定以及血清中和抗体试验；采用传统的技术测定分离株的生物学特性。[结果]43份大便标本共分离19株肠道病毒阳性株，阳性率44.12％，型别鉴定均为ECHO30；分离株具备强毒株的“D”特征；76.92％双份血清抗体呈4倍升高。[结论]2003年济南章丘市无菌性脑膜炎暴发的病原体为具备强毒株特征的ECHO30。     

从手足口病病例分离的两株柯萨奇病毒A组4型毒株的VP4～VP2区基因特征分析

目的研究2008年甘肃省从手足口病（Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD）患儿分离的柯萨奇病毒A组4型（Coxsackievirus A4,CVA4）的VP4～VP2区特征。方法采集门诊就诊的两例HFMD患儿的临床标本,接种人横纹肌肉瘤细胞（Human Rhabdomyosarcoma,RD细胞）分离病毒,然后对阳性病毒分离物使用逆转录-聚合酶链反应法扩增病毒VP4～VP2区,并进行核苷酸序列测定和分析,通过生物信息学的方法进行分子定型,最后与其它16株基因数据库中登录的CVA4株构建亲缘进化树图。结果使用RD细胞成功地从两例HFMD患儿的临床标本中分离到病毒,分子定型鉴定为CVA4。2株CVA4在VP4～VP2区核苷酸同源性为94.6%,氨基酸同源性为100%;与CVA4原型株High Point/USA/1948株的核苷酸和氨基酸同源性分别为85.5%～85.8%和99.3%。在亲缘进化树图中显示,2株CVA4分离株位于独立的进化支中。结论与基因数据库中登录的在日本、蒙古分离的CVA4株相比,从甘肃省2008年HFMD病例分离的两株CVA4,在VP4～VP2区核苷酸序列上差异很大。同源进化分析结果表明,甘肃省CVA4属于独立的进化支。     

浙江省2008年病毒性脑膜脑炎病原柯萨奇B组5型病毒VP_1区基因变异分析

目的研究浙江省2008年病毒性脑膜脑炎中分离到的柯萨奇B组5型病毒(Coxsackie Virus B5,CVB5)VP1区的基因特征,并与其他国家的分离株和CVB5原型株进行比较,探讨病毒VP1区的变异与病毒性脑膜脑炎流行的关系。方法用人喉癌上皮细胞和人横纹肌肉瘤细胞对脑脊液(Cerebrospinal Fluid,CSF)和粪便标本进行病毒分离,对分离到的病毒株提取核糖核酸,再用逆转录-聚合酶链反应扩增CVB5VP1区基因片段并进行序列测定,用DNA MAN和Bioedit等软件进行分析处理。结果从浙江省2008年病毒性脑膜脑炎患者CSF和粪便标本中,分离到的5株CVB5,其VP1区的核苷酸长度均为735bp,未发现核苷酸插入与丢失。与浙江(Zhejiang,ZJ)/12/02株氨基酸同源性最高为99.6%～100%,与法国等国外毒株的同源性为97.3%～99.6%,而与CVB5原型株的同源性只有96.3%。不同年份、不同地点分离的CVB5在进化树上显示在同一个分支上。结论2008年引起浙江省病毒性脑膜脑炎的CVB5的VP1区变异较小,引起的病毒性脑膜脑炎在局部地区散发,未发生明显的流行。     

安徽省诺如病毒G II.4/Sydney 2012变异株分子特征分析

目的了解安徽省某高校一起急性胃肠炎暴发疫情的病原体基因分型和分子特征。方法采用实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)对6份粪便/肛拭子标本检测诺如病毒核酸,检出的阳性标本经传统RT-PCR扩增衣壳蛋白区(ORF2)部分序列、基因测序和型别鉴定,利用Clustal X 2.0和Mega 6.0软件对测定序列进行核苷酸同源性比对和构建基因进化和亲缘性关系树。结果检出4份标本诺如病毒核酸阳性,阳性率为66.67%(4/6);基因序列比对和进化亲缘性关系显示:诺如病毒基因型为GII.4型;2毒株序列之间核苷酸同源性为100%;与2014~2015年上海株、香港株核酸同源性最高,均为100%;与2012澳大利亚Sydney株(JX459908)同源性为99.6%;与上海和香港两地区毒株亲缘性关系最近,聚为独立一簇,同属GII.4/Sydney 2012分支。结论引发该起急性胃肠炎暴发的病原体为GII.4型诺如病毒,且属于GII.4 Sydney 2012变异株。     

肠道病毒71型宁波株分子流行病学研究

目的:分析肠道病毒71型2010年宁波分离株的分子流行病学特征。方法:收集2010年宁波市手足口病患者临床标本177份,进行EV71荧光定量RT-PCR鉴定和病毒分离,采用RT-PCR对38株分离到的EV71进行VP1编码区基因扩增,并对扩增产物进行核苷酸序列测序和分析。根据VP1测序结果与国内外报道的各基因型和基因亚型EV71VP1序列进行同源性和亲缘进化分析。结果:88份鉴定为EV71的临床标本中共分离到38株病毒,分离株的VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别是97.1%～100%和99.3%～100%。与C4a亚型的核苷酸和氨基酸同源性分别为93.2%～99.3%和98.3%～100%。亲缘进化树显示,宁波分离株全部属于C4基因亚型的C4a进化分支,并存在多个传播链。结论:宁波地区分离的EV71与近几年国内其他地区EV71分离株亲缘关系很近,有共同进化的趋势,属于C4基因亚型的C4a进化分支,并存在多个传播链。     

浙江省病毒性脑炎病原柯萨奇B1病毒分子特征研究

目的:为了查明引起2008-2009年浙江省疑似病毒性脑炎的病原,分析病原的分子特征。方法:采用Hep-2和RD细胞从疑似患者脑脊液样本中分离肠道病毒,对分离株扩增VP1基因,测序并进行同源性与进化分析。结果:从患者11份脑脊液样本中分离到4株柯萨奇B1病毒(CVB1);测得VP1基因全长为834核苷酸(nt),无插入和缺失,推导编码278个氨基酸(aa)。4株浙江CVB1分离株(ZJ/CVB1)之间在VP1区nt和aa的同源性分别为96.3%~99.9%和100%。浙江CVB1分离株BLAST比对nt同源性最高的毒株为2006年山东株(SD/168/06),同源性为98.7%;与CVB1原型株(Conn-5/86)的nt同源性为78.9%。VP1区氨基酸进化树显示浙江CVB1分离株在CVB1 Clade3进化支上,与浙江株亲缘关系最近的毒株为山东CVB1株,均在同一进化支上。结论:从病毒分离结果证实浙江省疑似病毒性脑炎是由肠道病毒CVB1引起,2008-2009年在浙江循环的CVB1病毒之间没有明显差异,浙江CVB1流行株与山东株亲缘关系最近。     

无菌性脑膜炎暴发中Echo30病毒的基因特征及分子进化分析

目的了解引起无菌性脑膜炎暴发的Echo30病毒的基因特征，分析其遗传变异规律及进化来源。方法对2003年济南章丘市无菌性脑膜炎暴发中分离到的Echo30病毒进行了VPI区全基因序列测定，与国内外报道的Echo30病毒VPU区序列进行同源性比较，并通过构建进化树分析其遗传进化规律。结果济南章丘市Echo30分离株VPI区核苷酸同源性在98．9％～99．5％之间，与同年山东省泰安市Echo30分离株同源性最高（98．5％～990％），与浙江、江苏两省的Echo30分离株同源性在98．2％～98．9％，而与1997年法国分离株（89．1％～897％）和2001年台湾省分离株（87．4％～87．6％）的同源性相差较大，与原型株Bastianni株同源性最低，在82．4％～82．8％。进化树分析显示，中国大陆近几年无菌性脑膜炎Echo30分离株独处一支，呈单源性发生关系。结论2003年，Echo30病毒在山东省部分地区发生了一定程度的传播，并导致了无菌性脑膜炎的局部流行，进化树分析表明，中国大陆Echo30分离株与国外早期的分离株相比，其抗原性不完全相同，已形成新的基因亚型。     

2008年余姚市肠道病毒71型检测与VP1基因特征分析

目的研究2008年余姚手足口病主要病原肠道病毒71型(EV71)毒株的分子生物学特征。方法收集手足口病患者粪便样品,用荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测EV71,选择5个代表性样品进行VP1基因的扩增和核苷酸序列测定,测序结果利用DNAstar软件进行比对分析。结果 52例手足口病患者大便样品中检测到EV71阳性,阳性率为69.3%。5个代表株与A、B和C基因型标准株VP1基因核苷酸同源性分别为81.9%~82.2%、83.7%~84.3%和94.9%~95.3%,5个毒株之间的核苷酸同源性波动于96.2%~99.9%。在基因系统发生树上,这5个毒株均属于C基因型。结论本研究表明引起2008年余姚手足口病的主要病原是EV71毒株,它属于C基因型。     

一起爆发型柯萨奇病毒性脑炎的病原分离与鉴定

20 0 1年 6 - 7月间 ,安徽省某市发生了一起爆发型脑膜脑炎 ,在排除了乙脑之后 ,对病人早期粪便及脑脊液分离病毒 ,2 2份粪便及 15份脑脊液中分别有 12份及 5份分离阳性 ,阳性率分别为 5 4.5 %及 33.3% ,经血清中和试验鉴定为Cox(柯萨奇 )B5型病毒 ,证实此次流行为肠道病毒CoxB5所致的无菌性脑炎。     

2006-2020年四川省急性弛缓性麻痹病例中柯萨奇B组病毒的基因特征分析

目的 了解2006-2020年四川省急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)病例中各血清型柯萨奇B组病毒(Coxsackie virus B,CVB)的时空分布情况及基因特征,探索CVB在四川省的传播动态.方法 对AFP病例标本进行细胞分离培养,血清学鉴定,全VP1基因序列的测定及同源性...     

Coxsackievirus B5 virus-like particle vaccine exhibits greater immunogenicity and immunoprotection than its inactivated counterpart in mice

Coxsackievirus B group 5 (CVB5) represents one of the major pathogens that cause diseases such as hand, foot and mouth disease (HFMD) and aseptic meningitis et al. Currently, no specific drugs and vaccines are available, and a safe and effective CVB5 vaccine is of great value for control of the diseases. In this study, CVB5 P1 precursor and 3CD protease were co-expressed in Sf9 cells by using a baculovirus expression system. The P1 was processed by 3CD and self-assembled into CVB5 virus-like particles (VLPs). VP1 and VP3 capsid proteins of CVB5 could be detected by SDS-PAGE and Western blotting. Transmission electron microscopy revealed that the CVB5 VLPs were spherical particles with a diameter of about 30 nm, mimicking wild-type CVB5 virus. Our study showed that the total IgG and neutralizing antibodies induced by CVB5 VLPs were higher than those induced by inactivated vaccine. More importantly, the CVB5 VLPs conferred full protection to the CVB5-challenged suckling mice via passive immunity while protection efficiency of the inactivated vaccine was only 80%. The CVB5 VLPs vaccine could protect the limb muscles, brain, and heart tissues of suckling mice from CVB5-induced damage. These results demonstrated that the CVB5 VLPs vaccine possessed stronger immunogenicity and provided more robust immunoprotection than the inactivated CVB5 vaccine, suggesting that the CVB5 VLPs promise to be a CVB5 vaccine candidate in future.     

安徽省六安市一起埃可病毒6型脑膜炎暴发的调查

目的分析2005年安徽省六安市一起埃可病毒6型（Ech06）脑膜炎暴发疫情的流行病学、临床、实验室特征。方法对所有病例进行流行病学、临床特征分析，通过病例对照调查危险因素。采用病毒分离方法确定病原，运用分子生物学检测进一步确证，利用血清学检测分析隐性感染情况。结果105例病例分布在金寨县30个乡镇中的17个，41．0％病例集中在斑竹园镇，该镇罹病率为203／10万，具有学校和班级聚集性。发病年龄在3～15岁之间，以6～10岁小学生为主，平均年龄7．8岁，罹病率为10．9／10万，男性和女性的罹病率分别为24．2／10万和8．4／10万。大部分患者主要临床表现为发热、头痛、呕吐。从72例患者脑脊液中分离出25份Ech06，占35％。病例组与对照组比较，喝饮料OR=4．1，95％CI：1．4～12．0；尤其喝袋装饮料OR=3．3，95％CI：1．3～8．8。在生产袋装饮料的7名职工中有6人粪便检出Ech06。100名7～14岁健康人血清中和抗体阳性46人，阳性率46．0％，与病例组阳性率73．5％相比差异有统计学意义（Χ^2=12．526，P=0．000）。结论为一起主要由Ech06感染所致的病毒性脑膜炎的疫情，病例组喝饮料尤其袋装饮料的比例明显高于对照组。     

引发脑膜脑炎流行的柯萨奇B5病毒的序列分析

安徽省明光市 2 0 0 1年 6～ 7月发生了一起无菌性脑膜脑炎流行 ,从病人脑脊液和粪便标本中分离到 17株柯萨奇 (Coxsackie ,Cox .)B5病毒 ,血清学实验证明所分离的病毒为此次无菌性脑膜脑炎流行的病因。对其中的 2株病毒 (MG/ 18/ 2 0 0 1和MG/ 39/ 2 0 0 1)测定了VP1区全基因核酸序列并做了比较分析。结果显示 :所测 2株病毒VP1区核苷酸长度均为 849bp ,两毒株之间仅有 1个核苷酸不同。这两株病毒与从 (GenBank)检索到的Cox B5病毒的核苷酸同源性约为 82 %,氨基酸序列亦有改变。从进化树上看 ,这两株病毒同在一个小分支上 ,与它们亲缘关系最近的是从一疑似脊髓灰质炎的儿童分离到的AF114383 -Cox B5病毒 ,而与从手足口病患者分离到的X6 770 6-Cox B5病毒相对较远。表明此次脑膜脑炎的病因病毒与同是侵犯中枢神经系统的Cox B5的原型株 -AF114383 -Cox B5病毒亲缘关系最近 ,但核苷酸已经发生了 >18%的变异 ,可以认为其是Cox B5新亚型病毒。     

Outbreak of echovirus 30 meningitis in Wingecarribee Shire, New South Wales

An outbreak of aseptic meningitis due to echovirus 30 occurred in the Wingecarribee Shire, NSW, during October to November 1994, with 30 cases fitting the clinical case definition. Cases were ascertained from attendees of the local hospital. Medical files were reviewed and a standard questionnaire administered. Viral cultures were performed on CSF, throat swabs and stool specimens. The clinical presentation and laboratory findings were typical of viral meningitis. Cases were aged 8 months to 51 years; 26 were admitted to hospital. Headache was present in 93%, photophobia in 86%, vomiting in 69%, fever in 72%, and neck stiffness in 62%. In spite of temporal clustering, the mode(s) of transmission in this outbreak remain speculative. Although the route of transmission was not established, general hygiene measures to stop transmission were implemented when a common water source was excluded on epidemiological grounds.     

2011年厦门市某医院十例无菌性脑炎暴发病例病原学分析

目的 对2011年5月11-17日厦门某医院收治的10例无菌性脑炎患者进行病原学鉴定.方法 采集10例患者的咽拭子、肛拭子及部分患者的脑脊液,进行总肠道病毒核酸检测.总肠道病毒核酸阳性的样本,分别用肠道病毒A、B、C基因型各自的VP1通用引物扩增,VP1区扩增阳性的标本测序后进行序列分析.同时,用Vero细胞进行病毒分离培养,对培养成功的病毒与原始临床标本进行VP1序列同源性分析,从而对引发本次脑炎的病原进行鉴定.结果 10例脑炎患者中,有7例患者的临床标本总肠道病毒核酸检测阳性.这7例患者的咽拭子和(或)肛拭子标本肠道病毒B基因型VP1通用引物扩增阳性,测序后分析表明均为肠道病毒B基因型埃可病毒30(Echo 30),且与浙江2004年流行毒株的同源性达95.3%～97.1%.其中编号为XM2、XM3、XM4、XM8的咽拭子和XM3、XM6的肛拭子相互间序列同源性为99.4%～100.0%,但与XM1的咽拭子序列存在差异,同源性为92.8%～93.4%.此外,XM1、XM2、XM3、XM4、XM8咽拭子标本Vero细胞分离培养病毒成功,其VP1区部分序列与相应的原始标本同源性大于99.9%.结论 导致这次无菌性脑炎的病原体为肠道病毒B基因型Echo 30,并提示可能存在多种不同遗传背景的Echo 30在流行.

Abstract：

Objective To identify the etiology of an aseptic encephalitis outbreak (ten cases) in a hospital of Xiamen city from 11 to 17 May, 2011.Methods A total of ten patients′ throat swabs, anal swabs and cerebrospinal fluid were collected and detected by RT-PCR for pan-enterovirus. The samples containing detectable pan-enterovirus were tested by PCR with genotype-specific general primers located in VP1 region of enterovirus genotype A, B and C (HEV-A, B and C). The PCR products of VP1 segment were purified and sequenced, and phylogenetic analysis was performed. Meanwhile, the pathogens in those samples were isolated in Vero cell culture. Homologous analysis of VP1 sequences were carried out for the cultured virus samples and the original clinical samples to identify the outbreak etiology.Results Among the ten cases, seven cases were positive for pan-enterovirus nucleic acid. When tested by genotype-specific PCR, the throat and anal swab samples from those 7 patients were positive with HEV-B VP1 primers. Meanwhile, the HEV-B VP1 segments were sequenced and phylogenetic analyzed, which indicated the seven cases were all infected by enterovirus Echo 30. The sequences from those samples had homology of 95.3%-97.1% with the epidemic strains in Zhejiang, 2004. Out of the seven cases, the sequences of XM2,XM3,XM4,XM8 throat swab samples and XM3,XM6 throat samples showed 99.4%-100.0% homology which were different from the sequence of XM1, and the homology was 92.8%-93.4%. Furthermore, the viruses were isolated using Vero cells from XM1,XM2,XM3,XM4 and XM8 throat swab samples,and the VP1 sequence showed more than 99.9% homology with the original specimens.Conclusion The local outbreak of aseptic encephalitis was caused by Echo 30 of enterovirus genotype B, and the epidemic strains may have different genetic background.