用人工繁育的围生期和幼年树鼠句感染人乙型肝炎病毒的初步研究

目的通过用人工繁育的围生期和幼年树鼩接种人乙型肝炎病毒(HBV),并优选感染指标的检测方法,提高树鼩对HBV的感染率及检出方法的敏感性和可靠性。方法用人HBV阳性血清接种42只人工繁育的围生期和幼年树鼩,选择合适的引物,经巢式PCR(nPCR)技术检测它们肝组织及血清的HBV DNA,并对扩增出的DNA片段进行测序验证,以及对活检肝组织作病理组织学观察。结果接种后动物的肝组织和血清HBV DNA的阳性率分别为47.6%(20/42)和71.4%(30/42),肝组织和血清共同阳性的为40.5%(17/42),总阳性率为78.6%(33/42);扩增的DNA片段经测序与人HBV DNA相应片段的同源性为98%和99%;肝组织病理改变以轻度炎性病变较多见。结论用人工繁育的围生期和幼年树鼩感染HBV,可提高树鼩对HBV的感染效率;用nPCR技术及选择合适的引物配对检测肝组织和血清标本的HBV DNA,是评价树鼩感染HBV状况的敏感、可靠方法。     

用人工繁育的围生期和幼年树鼩感染人乙型肝炎病毒的初步研究

目的通过用人工繁育的围生期和幼年树鼢接种人乙型肝炎病毒（HBV），并优选感染指标的检测方法，提高树鼢对HBV的感染率及检出方法的敏感性和可靠性。方法用人HBV阳性血清接种42只人工繁育的围生期和幼年树鼢，选择合适的引物，经巢式PCR（nPCR）技术检测它们肝组织及血清的HBVDNA，并对扩增出的DNA片段进行测序验证，以及对活检肝组织作病理组织学观察。结果接种后动物的肝组织和血清HBVDNA的阳性率分别为47．6％（20／42）和71．4％（30／42），肝组织和血清共同阳性的为40．5％（17／42），总阳性率为78．6％（33／42）；扩增的DNA片段经测序与人HBVDNA相应片段的同源性为98％和99％；肝组织病理改变以轻度炎性病变较多见。结论用人工繁育的围生期和幼年树鼢感染HBV，可提高树鼢对HBV的感染效率；用nPCR技术及选择合适的引物配对检测肝组织和血清标本的HBVDNA，是评价树曲庶婆HBV娃掰．曲齄戚、可靠方溃     

慢性乙型肝炎患者血清HBV复制标志物与肝组织HBsAg和HBcAg抗原表达的相关性研究

目的探讨血清HBV复制标志物与肝组织HBsAg和HBcAg抗原表达的相关性。方法用免疫组化法检测肝组织HBsAg、HBcAg,与血清HBeAg和/或HBV DNA进行相关性比较。结果血清HBeAg阳性与阴性组中肝组织HBsAg阳性率无显著性差异,而血清HBeAg阳性者肝组织HBcAg阳性率显著高于HBeAg阴性者;血清HBV DNA阳性与阴性组中肝组织HBsAg阳性率无显著性差异,但血清HBV DNA阳性者肝组织HBcAg阳性率显著高于HBV DNA阴性者。结论血清HBeAg和HBV DNA水平与肝组织HBcAg阳性率呈正相关。     

慢性肝病患者血清和肝组织乙,丙型肝炎标志物的检测及意义

目的:探讨血清免疫学标志物与血清、肝组织HBV DNA、HCV RNA的关系。方法:对病理诊断为慢性肝炎、肝炎后肝硬化的22例患者进行了血清免疫学标志物、斑点杂交HBV DNA的检测,并采用PCR技术对血清、肝组织的HBV DNA、HCV RNA分别进行了检测。结果:8例病理诊断为慢性肝炎的患者血清HBsAg、抗-HBc、HBeAg、抗-HBe、抗-HBs、抗-HCV阳性者分别为3例、4例、0例、1例、2例、0例,斑点杂交HBV DNA阳性1例,血清、肝组织PCR HBV DNA阳性分别为4例、6例,HCV RNA阳性分别为3例、4例,14例病理诊断为肝炎后肝硬化的患者血清HBsAg\抗-HBc、HBeAg、抗-HBe、抗-HBs、抗-HCV阳性数分别为14例、4例、2例、7例、0例、3例,斑点杂交 HBV DNA阳性7例,血清、肝组织PCR HBV DNA阳性分别为10例、10例,PCR HCV RNA阳性4例、4例。结论:对乙、丙肝免疫学标志物的分析应结合PCR检测结果;慢性肝病病理学改变与感染HBV和/或HCV有关,以HBV感染为多见,少数为HCV感染;血清和肝组织PCR HBV DNA、HCV RNA具有一致性,血清检测结果基本可反映肝内病毒复制状况。     

慢性乙型肝炎患者肝组织乙型肝炎病毒cccDNA和血清病毒学标志物相关性的研究

目的探讨CHB患者血清病毒学标志物及肝组织、血清HBV DNA与肝组织HBVcccDNA的关系。方法应用实时荧光定量法进行20例CHB患者肝组织HBVcccDNA、肝组织及血清HBV DNA定量的测定,时间分辨荧光免疫分析法进行HBsAg、HBeAg、HBcAb等血清学标志物的测定,分析肝组织HBVcccDNA与肝组织HBV DNA、血清HBV DNA、HBsAg及HBeAg定量水平之间的关系。相关性分析采用Spearman相关性检验。结果所有患者肝组织中均能检测到HBVcccDNA,含量在7.63×10~4拷贝数/mg~9.46×10~8拷贝数/mg(对数值:7.55±1.08)之间;肝组织HBVcccDNA与肝组织HBV DNA呈显著正相关关系(r=0.859,P0.01),与血清HBV DNA呈显著正相关关系(r=0.640,P0.01);肝组织HBVcccDNA与HBeAg呈显著正相关(r=0.676,P0.01),与血清HBsAg无相关性(r=0.195,P0.05),与HBcAb呈显著负相关(r=-0.624,P0.01)。结论 CHB患者肝组织内HBVcccDNA呈稳定的中等水平复制;血清HBsAg定量尚不能作为反映肝组织中HBVcccDNA水平的指标,结合肝组织HBV DNA、血清HBV DNA等定量检测可以更全面反映HBV复制水平及患者病情评估。     

树鼩实验感染丁型肝炎病毒后肝内抗原表达状态

目的 研究树鼩实验感染人丁型肝炎病毒的可能性。方法 用免疫组化方法,检测树鼩肝组织丁型肝炎病毒抗原(HDAg),乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg),采用原位杂交方法检测部分动物肝内HDV RNA。结果 35只动物,HDV/HBV同时感染组和重叠感染组HDAg阳性率分别为94.5％(21╱22)和84.6％(11/13);HDAg在肝内主要定位于肝细胞,在肝小叶呈灶状或片状分布,肝内持续时间在同时感染组和重叠感染组稍有不同,前者多持续3～4周,后者则可长达12周以上;部分动物肝组织细胞浆或细胞核HDV RNA阳性。结论 人HDV可感染树鼩,树鼩可成为丁型肝炎研究的动物模型。     

胎盘滋养层细胞的乙型肝炎病毒感染与宫内感染机制

目的：检测HBV对胎盘、胎肝和滋养层细胞的感染情况，探讨HBV的宫内感染机制。方法：研究对象包括20例孕妇胎盘组织、6例引产胎儿胎肝组织及体外培养的胎盘滋养层细胞。ELISA法检测孕妇外周血、胎儿脐血和6个月婴儿外周血HBV标志物；荧光定量PCR法检测血清和滋养层细胞中的HBV DNA；免疫组织化学法和免疫荧光法检测胎盘、胎肝组织及滋养层细胞中HBV标志物的表达；末端脱氧核糖核酸转移酶介导的缺口标记法（TUNEL）检测胎盘和滋养层细胞凋亡情况。结果：孕妇血清HBV DNA水平与胎儿脐血HBV DNA水平相关，脐血HBV DNA阳性者其母血HBV DNA〉1.0×10^7拷贝／mL；6例胎盘组织和3例引产胎儿胎肝组织中可见HBsAg免疫组织化学染色阳性细胞，其中1例胎肝组织中发现HBcAg阳性细胞；体外培养滋养层细胞与HBV DNA阳性血清共孵育后，可检测到HBsAg的表达，亦可检测到HBV DNA。体内和体外实验均检测到HBV感染后滋养层细胞凋亡呈增加趋势，且胎盘细胞的凋亡与脐血HBV DNA水平相关。体外实验结果显示，随感染时间的延长，滋养层细胞凋亡呈增加趋势。6个月后，12例新生儿有1例血清HBsAg、HBeAg和抗-HBc阳性，6例抗-HBs阳性。结论：HBV宫内感染的机制可能是通过HBV感染胎盘屏障而使胎儿发生HBV宫内感染。HBV在胎儿组织器官内的定位和复制可能是新生儿发生慢性HBV感染的重要因素。滋养层细胞凋亡可能是胎盘屏障阻断HBV宫内传播的一种保护性机制。     

隐匿性慢性乙型肝炎5例

隐匿性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是指血清学检测HBsAg阴性,而血清和（或）肝组织HBV DNA阳性的一种HBV感染状况[1],这种感染状态可发生于抗-HBc和（或）抗-HBs阳性的患者,也可见于HBV血清标志物均阴性的个体[2]。     

HBV感染恢复期血清标志物与肝细胞HBV cccDNA检测对照

目的:了解肝组织乙肝病毒共价闭合环状脱氧核糖核酸(HBV cccDNA)与血清HBV复制指标的关系,以探索判定抗HBV的疗程终结点的观察方法。方法:既往HBV感染者、乙型肝炎肝硬化肝癌及慢性乙型肝炎(CHB)患者各13例,将血清HBV DNA、HBV-M及肝组织HBV cccDNA检测结果进行对照。结果:肝硬化肝癌及CHB患者抗-HBe阳性分别为12例和9例,血HBV DNA阳性分别为6例和8例,肝细胞HBV cccDNA均阳性;既往HBV感染13例中,HBsAg阴性,抗-HBs和/或抗HBc阳性各7和6例,有3例肝细胞中HBV cccDNA阳性。抗-HBs阳性的7例肝细胞HBV cccDNA阴性,抗-HBe阳性及抗HBs合并抗-HBe阳性者,肝细胞HBV cccDNA分别为105拷贝/ml和103拷贝/ml,与抗-HBs阳性组对照,t=4.5、4.0(P均<0.01),差异有非常显著性意义。CHB患者核苷类治疗后全应答,肝组织HBV cccDNA仍均为阳性。结论:抗-HBs阳性HBV感染后恢复期血清,肝组织HBV cccDNA阳性比率明显低于CHB抗HBe阳性HBV DNA阴性病例。抗病毒治疗CHB的终点,应是血清抗-HBs阳性的出现。     

慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA、总HBV DNA与血清HBV DNA的相关性及其与临床的关系

目的探讨慢性乙型肝炎患者肝组织HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）、肝组织总HBV DNA（HBV tDNA）与血清HBV DNA之间的相关性及其与临床的关系。方法 78例慢性乙型肝炎患者入选本研究。肝组织β- globinDNA、HBV cccDNA和HBV tDNA采用实时荧光定量PCR方法检测,平均每个肝细胞HBV cccDNA和HBV tDNA含量（拷贝/cell）=HBV cccDNA（实测值）/β-globin DNA（实测值）和HBV tDNA（实测值）/β3-globin DNA（实测值）,肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA含量的计算单位定义为log₁₀拷贝/10⁶cell;采用实时荧光定量PCR、ELISA法检测血清HBVDNA和HBV标志物;采用免疫组织化学方法检测肝细胞中HBsAg和HBcAg的表达。统计分析采用pearson相关分析及t检验。结果 （1）肝组织HBV cccDNA与HBV tDNA定量呈正相关（r=0.696,P<0.001）;肝组织HBV cccDNA与血清HBV DNA定量呈正相关（r=0.304,P<0.01）;肝组织HBV tDNA与血清HBV DNA定量呈正相关（r=0.341,P<0.01）;（2）肝细胞内HBcAg定性检测阳性患者的血清HBV DNA定量明显高于阴性患者,且差异有统计学意义（P<0.05）;肝细胞内HBcAg定性检测阳性患者与阴性患者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量差异均无统计学意义和（P均>0.05）;（3）肝细胞内HBsAg定性检测阳性患者的血清HBV DNA定量明显高于阴性患者,且差异有统计学意义（P<0.05）;肝细胞内HBsAg定性检测阳性患者与阴性患者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量差异均无统计学意义（P>0.05）;（4）HBeAg（+）/抗-HBe（-）患者血清HBV DNA定量明显高于HBeAg（-）/抗-HBe（+）患者,且差异有统计学意义（P<0.05）;HBeAg（+）/抗-HBe（-）患者肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量与HBeAg（-）/抗-HBe（+）患者比较差异均无统计学意义（均P>0.05）;（5）肝组织HBV cccDNA、HBV tDNA以及血清HBV DNA三者与肝脏炎症活动度及纤维化程度均无显著相关性（P>0.05）。结论 （1）血清HBV DNA定量结果并不一定能完全反映患者肝组织中HBV cccDNA和HBV tDNA含量,尤其在血清HBV DNA<500拷贝/mL时,肝组织中仍存在HBV cccDNA和HBV tDNA,且含量大小不等。（2）肝细胞内HBcAg定性检测阳性或者HBsAg定性检测阳性患者的血清HBV DNA定量均明显高于阴性患者;而两者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量均没有显著差异;（3）HBeAg（+）/抗-HBe（-）患者血清HBV DNA定量明显高于HBeAg（-）/抗-HBe（+）患者,而两者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA均没有显著差异;（4）肝组织HBV cccDNA、HBV tDNA及血清HBV DNA与肝脏炎症活动度和纤维化程度均无显著相关性。     

HBV cccDNA in patients＇ sera as an indicator for HBV reactivation and an early signal of liver damage

AIM: To evaluate the covalently closed circle DNA (cccDNA)level of hepatitis B virus (HBV) in patients‘ liver and sera. METHODS: HBV DNA was isolated from patients‘ liver biopsies and sera. A sensitive real-time PCR method, which is capable of differentiation of HBV viral genomic DNA and cccDNA, was used to quantify the total HBV cccDNA. The total HBV viral DNA was quantitated by real-time PCR using a HBV diagnostic kit (PG Biotech, LTD, Shenzhen, China)described previously. RESULTS: For the first time, we measured the level of HBV DNA and cccDNA isolated from ten HBV patients‘ liver biopsies and sera. In the liver biopsies, cccDNA was detected from all the biopsy samples. The copy number of cccDNA ranged from from 0.03 to 173.1 per ceil, the copy number of total HBV DNA ranged from 0.08 to 3 717 per cell. The ratio of total HBV DNA to cccDNA ranged from 1 to 3 406. In the sera,cccDNA was only detected from six samples whereas HBV viral DNA was detected from all ten samples. The ratio of cccDNA to total HBV DNA ranged from 0 to 1.77%. To further investigate the reason why cccDNA could only be detected in some patients‘ sera, we performed longitudinal studies. The cccDNA was detected from the patients‘ sera with HBV reactivation but not from the patients‘ sera without HBV reactivation. The level of cccDNA in the sera was correlated with ALT and viral load in the HBV reactivation patients. CONCLUSION: HBV cccDNA is actively transcribed and replicated in some patients‘ hepatocytes, which is reflected by a high ratio of HBV total DNA vs cccDNA. Detection of cccDNA in the liver biopsy will provide an end-point for the anti-HBV therapy. The occurrence of cccDNA in the sera is an early signal of liver damage, which may be another important clinical parameter.     

HBV cccDNA in patients′ sera as an indicator for HBV reactivation and an early signal of liver damage

AIM: To evaluate the covalently closed circle DNA (cccDNA)level of hepatitis B virus (HBV) in patients′ liver and sera.METHODS: HBV DNA was isolated from patients′liver biopsies and sera. A sensitive real-time PCR method, which is capable of differentiation of HBV viral genomic DNA and cccDNA, was used to quantify the total HBV cccDNA. The total HBV viral DNA was quantitated by real-time PCR using a HBV diagnostic kit (PG Biotech, LTD, Shenzhen, China)described previously.RESULTS: For the first time, we measured the level of HBV DNA and cccDNA isolated from ten HBV patients′liver biopsies and sera. In the liver biopsies, cccDNA was detected from all the biopsy samples. The copy number of cccDNA ranged from from 0.03 to 173.1 per cell, the copy number of total HBV DNA ranged from 0.08 to 3 717 per cell. The ratio of total HBV DNA to cccDNA ranged from 1 to 3 406. In the sera,cccDNA was only detected from six samples whereas HBV viral DNA was detected from all ten samples. The ratio of cccDNA to total HBV DNA ranged from 0 to 1.77%. To further investigate the reason why cccDNA could only be detected in some patients′sera, we performed longitudinal studies. The cccDNA was detected from the patients′sera with HBV reactivation but not from the patients′sera without HBV reactivation. The level of cccDNA in the sera was correlated with ALT and viral load in the HBV reactivation patients.CONCLUSION: HBV cccDNA is actively transcribed and replicated in some patients′hepatocytes, which is reflected by a high ratio of HBV total DNA vs cccDNA. Detection of cccDNA in the liver biopsy will provide an end-point for the anti-HBV therapy. The occurrence of cccDNA in the sera is an early signal of liver damage, which may be another important clinical parameter.     

乙型肝炎病毒cccDNA定量与乙型肝炎临床及病理关系

目的探讨慢性乙型肝炎（CHB）肝组织HBVcccDNA定量与乙型肝炎的关系。方法分别采用荧光定量PCR、酶联免疫吸附分析法（ELISA）检测48例CHB肝组织HBVcccDNA定量、肝组织和血清HB VDNA定量、乙型肝炎病毒标志物。同时用链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶连接法（SP）检测肝细胞中HBcAg表达。分析肝组织HBVcccDNA与组织和血清HBV DNA、HBeAg、肝细胞内HBcAg水平及肝脏炎症活动度的关系.结果1．肝组织HBVcccDNA定量与组织和血清HBV DNA定量呈正相关（r=0．837，P〈0．001；r=0．627，P〈0．005）；2．肝组织HBV cccDNA定量与肝细胞内HBcAg半定量呈正相关（r=0．618，P〈0．005）；3．肝组织HBV cccDNA定量与肝脏炎症活动度尤明显相关（P〉0．05）：4．HBeAg阳性较抗-HBe阳性患者肝组织HBV cccDNA定量、肝组织和血清HBV DNA定量高（P〈0．05）。结论荧光定量PCR法检测肝组织HBV cccDNA定量是评价HBV复制最直接可靠的指标，在CHB的诊断和抗病毒治疗中有重要意义。但与肝组织炎症无明显相关。     

慢性HBV感染者肝脏HBV cccDNA含量相关因素分析

目的探讨慢性HBV感染者肝组织中HBV cccDNA含量与血清病毒标志物、HBV DNA及肝脏病理分级的关系,为临床评价抗病毒治疗效果及疗程确定提供理论依据。方法以2007年5月-2008年2月住院的30例慢性HBV感染者为研究对象,应用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测患者肝组织中HBV cccDNA、肝组织总HBV DNA（HBV tDNA）和血清HBVDNA,同时用化学发光免疫分析法检测HBsAg、HBeAg定量,分析感染者肝组织内HBV cccDNA与肝组织内HBV DNA、血清HBVDNA、HBsAg及HBeAg定量水平之间的关系,并比较肝组织中HBV cccDNA含量与肝脏病理炎症和纤维化分级的关系。采用Pear-son简单相关和Spearman等级相关法进行相关性分析。结果 30例慢性HBV感染者肝组织中均可检出HBV cccDNA,范围在3.15×103～1.06×107拷贝/mg;肝组织cccDNA定量与肝组织总HBV DNA定量呈正相关（r=0.375,P〈0.05）,与血清HBV DNA无相关性（r=0.174,P〉0.05）;肝组织中HBV cccDNA水平与血清HBsAg定量呈高度正相关（r=0.562,P〈0.001）,而与血清HBeAg定量无相关性（r=0.152,P〉0.05）。肝组织cccDNA定量与肝组织炎症活动度（G）及纤维化程度（S）无相关性（r=0.082,P〉0.05）。结论慢性HBV感染者肝组织内HBV cccDNA成稳定的中等水平复制;血清HBV DNA载量不能直接代表其肝组织中的HBV cccDNA水平;血清HBsAg定量可作为反映肝组织中HBV cccDNA水平的指标。     

联合检测HBV前S1抗原和核心抗原的临床意义

探讨联合检测血清HBV前s1抗原（preSl）和核心抗原（HBcAg）（均为HBV核酸相关抗原，nucleic acids related antigen，HBV NRAg）的意义及临床价值。方法：采用ELISA法对393份HBsAg、HBV DNA双阳性的血清和612份HBsAg阴性血清进行HBV NRAg检测，所有标本均采用多区段巢式PCR确认阳性、阴性，采用荧光定量PCR法进行HBV DNA定量分析。结果：393份HBsAg、HBV DNA双阳性血清中，HBV NRAg阳性为382份，其阳性率为97．2％；612份HBsAg阴性的血清标本中，609份确认为HBV DNA阴性，其中检出2份HBV NRAg阳性，607份为阴性，其HBV NRAg的阴性率为99．7％（607／609），另3份HBsAg阴性血清HBV DNA阳性者，其HBV NRAg均为阳性。结论：联合检测preSl和HBcAg的HBV NRAg可作为临床HBV感染的筛选及判断HBV复制的有意义的补充项目。     

替比夫定(素比伏)体外抑制乙型肝炎病毒复制的研究

目的观察替比夫定体外对乙型肝炎病毒（HBV）复制的抑制作用。方法HBV复制子pHBV1．3质粒转染Huh7细胞,在转染细胞培养液中加入不同浓度的替比夫定,然后在不同时间段观察替比夫定的抗病毒作用。用ELISA检测培养上清中HBsAg、HBeAg水平,用荧光定量PCR（FQ—PCR）检测培养上清中HBVDNA拷贝数,用Southern blot分析转染细胞中HBV复制中间体。结果替比夫定减少了培养上清中HBsAg、HBeAg的表达及HBVDNA拷贝数,抑制了转染细胞中HBV复制中间体的形成。替比夫定对HBV复制子体外复制的抑制作用依赖于药物浓度及作用时间。结论替比夫定在体外对HBV有较强的抑制作用。     

54例慢性乙型肝炎患者肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA与血清HBsAg定量检测结果分析

目的 检测慢性乙型肝炎患者肝组织HBV共价闭合环状DNA (cccDNA)和血清HBsAg,分析两种定量指标之间及其与血清HBV DNA载量的相关性.方法 应用PSAD消化+滚环扩增+跨缺口实时荧光PCR方法,定量检测54例慢性乙型肝炎患者甲醛固定石蜡包埋肝组织HBV cccDNA水平;用化学发光试剂定量检测患者血清HBsAg.用Pearson检验及直线回归分析方法 对数据进行分析.结果 患者肝组织HBV cccDNA与血清HBsAg定量水平之间呈正相关(r=0.459,P＜0.01),但与血清HBV DNA载量相关性无统计学意义;血清HBsAg定量水平与血清HBV DNA载量呈正相关(r=0.328,P＜ 0.05),与病毒复制效率呈负相关(r=-0.373,P＜0.05).结论 慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA载量与血清HBsAg定量水平相关,结合血清HBVDNA定量检测,可以更全面的反映HBV的复制水平,评价抗病毒疗效.