两段法培养适合临床移植应用的黑素细胞的安全性研究

目的:探讨使用两段法培养黑素细胞,以消除佛波醇酯(TPA)的致瘤危险,增加培养细胞的安全性,从而适合临床移植的需要。方法:两段法培养黑素细胞:先用含TPA培养液培养纯化黑素细胞,然后用不含TPA的培养基继续扩增传代。通过细胞形态、生长特性、细胞周期等检测观察有无TPA时培养细胞的特性。接种裸鼠检测培养细胞的致瘤性。结果:用含TPA培养液容易获得纯化的黑素细胞;扩增传代时改用不含TPA的培养基,黑素细胞由细长的多分支逐渐变成两极的宽梭形。生长速度略微减慢,细胞周期显示增殖减缓。裸鼠致瘤实验阴性。结论:两段法培养黑细胞成功率高,和以往培养基中含TPA的培养方法相比,所培养黑素细胞形状变化明显,生长减慢,用于临床移植时更加安全。     

梯度血清递减体外培养人脐带间充质干细胞

背景：人脐带间充质干细胞的扩增与培养条件密切相关,而含体积分数10%-20%胎牛血清的培养基可促进细胞生长。目的：建立梯度血清递减扩增培养脐带间充质干细胞的培养技术。方法：采用胶原酶Ⅱ消化分离获得脐带间充质干细胞悬液,并通过贴壁培养进行纯化,细胞贴壁后采用梯度血清递减方法,即第1代80%含血清培养基,20%无血清培养基;第2代50%含血清培养基,50%无血清培养基;第3代20%含血清培养基,80%无血清培养基;第4代100%无血清培养基。另一种传代中始终采用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM完全培养液。用流式细胞仪检测细胞的表面标记,进行成骨诱导试验,同时与经典的含10%胎牛血清的α-MEM培养体系进行比较。结果与结论：梯度血清递减培养法与经典α-MEM培养体系所获得的细胞在扩增能力、细胞形态、免疫表型等方面相似。细胞在两种培养体系中均能保持良好的分化潜能。但梯度血清浓度法培养间充质干细胞可使用更少量胎牛血清,提高临床应用安全性。     

兔结膜上皮细胞组织块培养

目的研究结膜上皮细胞体外培养的方法，并进一步探索无血清培养系统用于结膜上皮细胞培养的可行性。方法分别用含胎牛血清培养液和不含血清培养液进行组织块培养，观察两种培养方法在细胞形态、细胞生长情况和增殖及细胞分化方面的差异。结果无血清培养系统中结膜上皮细胞的增殖、克隆形成及细胞传代能力均较含血清培养系统高，而且具备结膜上皮细胞全部组织结构及功能特点。结论无血清培养系统的组织块培养法可为结膜上皮细胞的疾病、药理毒理研究及培养移植的结膜上皮细胞提供更为安全有效的细胞模型。     

经裸鼠体内多次传代所致的高致瘤HL-60细胞模型的建立及其细胞生物学特征

本研究探讨裸鼠体内多次传代的高致瘤性HL-60细胞的生物特性的变化,探索高致瘤性HL-60细胞致瘤率提高的机制。用裸鼠体内和体外传代方法建立高致瘤性白血病细胞系HL-60模型,并对其生物特性改变进行比较。用台盼蓝染色法检测HL-60细胞生长水平,流式细胞术分析细胞周期,电子显微镜观察HL-60细胞的超微结构和荧光水平。结果表明:细胞生长速度加快,细胞群体倍增时间缩短;S期细胞比率有上升的超势。细胞线粒体数目显著下降(p0.01),且多数内室扩张,嵴数目减少,有的空泡化;细胞微丝荧光减弱,差异显著(p0.01);克隆形成率有明显的增加。结论:裸鼠体内多次传代的HL-60细胞高致瘤性与致瘤细胞增殖能力增强,细胞中线粒体数目与结构的改变和细胞骨架微丝的变化有关。     

CD147-shRNA重组质粒对裸鼠肝癌细胞SMMC-7721皮下移植瘤的抑制作用

目的研究CD147-shRNA重组质粒对裸鼠肝癌细胞SMMC-7721皮下移植瘤生长的抑制作用。方法将SMM@7721细胞、转染空载质粒的SMMC7721／pBS／U6以及转染本室前期构建的靶向肝癌细胞CD147的重组质粒的肝癌细胞SMMC-7721／pBS／U6／CD147-shRNA3接种到裸鼠皮下,观察移植肿瘤的生长情况。结果转染CD147-shRNA重组质粒的肝癌细胞移植瘤生长速度明显减慢;瘤块平均体积减小,重量减小,移植瘤生长明显减缓,抑瘤率为64．8％。结论转染CD147-shRNA重组质粒的SMMC-7721细胞致瘤性明显降低。     

人羊膜间充质干细胞移植对荷瘤鼠C6胶质瘤生长的抑制

背景:实验室前期课题成果显示,脐血或羊膜间充质干细胞具有亲肿瘤及抑瘤特性。目的:探讨人羊膜间充质干细胞对C6胶质瘤细胞生长的抑制作用。设计、时间及地点:细胞学体内对照观察,于2008-06/09在郑州大学微生物与免疫教研室完成。材料:胎盘来源于郑州大学一附院妇产科健康剖宫产产妇,C6胶质瘤细胞株由北京神经外科研究所惠赠,10只BALR/c裸鼠由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。方法:无菌条件下取胎盘,分离部分羊膜,体外分离培养人羊膜间充质干细胞,传至第3代用于实验。10只裸鼠背部双侧皮下注射含3×106个C6胶质瘤细胞的DMEM/F12培养基,建立双侧荷瘤鼠模型。成功造模后,模型对照组于裸鼠左侧皮下注射DMEM/F12培养基50μL,细胞移植组于同一裸鼠右侧皮下注射含2×106个羊膜间充质干细胞的等量DMEM/F12培养基。主要观察指标:肿瘤生长情况,周围组织浸润及新生血管形成等病理学观察,免疫组化法检测肿瘤中细胞周期素D1的表达。结果:细胞移植后14,21d,细胞移植组肿块体积明显小于模型对照组(F=54.127,P<0.05)。模型对照组瘤体呈结节状,部分肿瘤组织中心有坏死现象,内部有新生血管形成,肌层及皮肤浸润较明显,已达腹膜;细胞移植组瘤体分叶较少,无新生血管形成,仅有局部的皮肤浸润,未见肌层浸润。模型对照组细胞周期素D1蛋白呈阳性表达,而细胞移植组表达阳性率较低。结论:人羊膜间充质干细胞可明显抑制荷瘤鼠C6胶质瘤细胞的生长,同时可抑制细胞周期素D1蛋白的异常表达。     

不同培养基和不同体积分数小牛血清对许旺细胞生长状态的影响

背景：许旺细胞目前正越来越多地被运用于神经修复、构建载体细胞等,但如何高效快速地培养扶取大量许旺细胞尤为关键。传统方法存在细胞培养周期长、污染率高、生长状况不稳定等不足。 目的：观察比较不同培养基和培养基中不同体积分数血清对许旺细胞的生长、增殖能力的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2008—01／07在昆明医学院神经科学研究所完成。材料：SPF级新生一两天龄ICR小鼠30只,由昆明医学院动物科提供。DMEM／F12培养液、RPMJ1640培养液、L-DMEM培养液为Gibco公司产品,小牛血清为Hyclone公司产品。 方法：取ICR新生小鼠,无菌条件下取出坐骨神经,组织块消化法体外分离培养许旺细胞,设立4组：DMEM／F12培养液组、RPMI1640培养液组、L-DMEM培养液组、生理盐水组。每组又分为4个亚组：不含血清、含体积分数为10％,15％,20％小牛血清。各组细胞接种后进行传代培养。使用差速贴壁和阿糖胞苷处理的综合法对许旺细胞进行纯化。 主要观察指标：传代培养后1,3,5,7,9,11,13d,相差显微镜下观察细胞形态及生长情况,免疫细胞化学染包检测细胞纯度。MTT法绘制细胞生长曲线。结果：①不含血清时,各组许旺细胞生长状态均较差：添加血清后各组许旺细胞消化传代后6h即大量贴壁,48h后出现聚合增殖现象。②含血清的DMEM／F12培养液组、RPMI1640培养液组、L—DMEM培养液组许旺细胞能较好地生长,纯度均达到90％以上,且DMEM／F12培养液组在细胞纯度、细胞总数方面均略优于RPMI1640培养液组及L—DMEM培养液组;生理盐水组许旺细胞生长欠佳,纯度也不甚理想。③与生理盐水组比较,DMEM／F12、RPM／1640及L—DMEM培养液组MTT吸光度值均显著升高（F=92．814,P〈0．05）,但此3种基础培养基之间比较无明显差异（F=0．909,P〉0．05）。培养1,3,5,7,9,11,13d,DMEM／F12、RPM11640及L．DMEM培养液组在含不同体积分数小牛血清的条件下MTT吸光度值均存在明显差异（F=50．850,P〈0．05）,体积分数为15％时许旺细胞数量最多,且纯度也相列最高。 结论：血清体积分数的变化是许旺细胞培养过程中是主要因素,含体积分数为15％小牛血清血清的DMEM／F12培养液培养许旺细胞效率最高。     

从人外毛根鞘细胞分离获取黑素母细胞

目的：毛囊黑素细胞是皮肤黑素细胞的储库，含有黑素母细胞甚至黑素干细胞，具有更强的增殖潜力。观察人毛囊外毛根鞘细胞中黑素细胞的分布特征，尝试分离获取黑素母细胞。方法：实验于2003—0412006—04在解放军第四军医大学组织工程实验中心和武警医学院附属医院皮肤科完成。消化游离流产胎儿头皮（产妇同意由医院处理流产胎儿）毛囊，用黑素细胞培养基接种，原代培养人外毛根鞘细胞，并观察外毛根鞘细胞和黑素细胞的分布。待原代外毛根鞘细胞融合时，加入胰酶消化，大约一半细胞漂浮时，加入含体积分数为0．10小牛血清的DMEM终止，轻柔吹打，弃去飘浮细胞。用DMEM清洗原瓶后加入黑素细胞培养基，继续培养，寻找黑素（母）细胞克隆。并采用胰酶消化法纯化培养黑素细胞。结果：在贴壁生长的毛根周围发现了外毛根鞘细胞团，以毛囊隆突部位为中心呈纺锤形排列。其中含有黑素细胞：临近毛囊漏斗部和毛球部的黑素细胞体积较大，有两个或者多个长一些的树突；隆突部位周围的黑素细胞体积偏小，树枝少而短。经纯化培养获得黑素（母）细胞集落，集落中心细胞呈短梭形，折光性很强，排列密集，增殖活跃；边缘细胞变大，树突延长；集落之间散在分布的黑素细胞体积更大，树突延长，数量增多至3个以上。结论：实验观察到人毛囊外毛根鞘细胞中有黑素细胞分布，并选择性培养获得黑素细胞克隆，分析克隆中心可能含有黑素母细胞。     

结肠癌干细胞样细胞的无血清法培养及特性鉴定

目的运用无血清细胞培养法培养出源于结肠癌细胞株SW620的细胞球,并实现其在体外的繁殖及传代,为深入研究结肠癌提供坚实的基础。方法逐步驯化人结肠癌细胞株SW620适应无血清培养条件,1周后,收集悬浮生长的细胞球。采用免疫荧光法检测胚胎干细胞标记物SSEA-4、TRA-1-60在SW620细胞及细胞球的表达情况;采用PI染色法检测2种细胞的细胞周期;采用脂肪诱导分化液对2种细胞进行体外诱导培养;采用裸鼠成瘤实验比较2种细胞的成瘤能力。结果 SW620细胞在无血清培养液中培养1周后,可生出悬浮生长的细胞球。胚胎干细胞标记物SSEA-4、TRA-1-61在所有细胞球细胞中均呈阳性表达;在SW620细胞中的表达率分别为(25.74±7.62)%、(27.74±4.31)%,两者相比,差异具有统计学意义(P0.05)。细胞球细胞有(7.18±1.35)%处于分裂期(S期),(84.19±2.52)%处于分列前期(G0/G1期);SW620细胞有(20.89±3.84)%处于S期,(63.02±6.73)%处于G0/G1期,两者相比差异有统计学意义(P0.05)。脂肪诱导液中培养7d后,油红特异性染色的脂肪颗粒在每100个细胞球细胞中为(583.80±77.69)个;在每100个SW620细胞中为(169.20±26.43)个,两者相比差异有统计学意义(P0.05)。2×104个细胞球细胞即可在裸鼠皮下成瘤,移植瘤体积为(2 279.98±346.27)mm3;2×105个SW620细胞才能形成裸鼠皮下移植瘤,移植瘤体积为(889.75±78.79)mm3,两者相比差异有统计学意义(P0.05)。结论人结肠癌细胞SW620经过无血清驯化,可培养出细胞球,并可进行体外的大量繁殖和稳定传代;细胞球表现出肿瘤干细胞样细胞的特性。     

两种方法建立人胃癌裸鼠移植瘤模型的比较

目的采用两种不同方法建立人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型。方法人胃癌细胞悬液直接注射法:将处于对数生长期的人胃癌细胞悬液接种于裸鼠皮下;胃癌裸鼠瘤转瘤法:将胃癌细胞悬液接种入裸鼠,待肿瘤生长直径在8 mm左右时,处死裸鼠并取其肿瘤组织边缘新鲜的组织,接种于裸鼠皮下,形成皮下移植瘤。观察并比较两种方法所建立的模型肿瘤移植成功率及瘤体生长速度,实验结束后MSP法检测移植瘤组织中Reprimo基因的甲基化水平并采用免疫组织化学法检测移植瘤的Ki-67和CD31分子表达。结果细胞悬液直接注射组的瘤体成瘤速度较瘤转瘤组慢(P<0.05);瘤转瘤组的Reprimo基因甲基化水平及Ki-67和CD31的表达均高于细胞悬液直接注射组(P<0.05)。结论胃癌裸鼠皮下瘤转瘤法的瘤体生长状况优于胃癌细胞悬液直接注射法。     

不同条件下人骨髓基质细胞体外培养及诱导分化中的影响因素

目的：体外培养人骨髓基质细胞(human mesenchymal stem cells．hMSCs)，传代、扩增、冻存复苏并诱导分化，为细胞移植及组织工程骨的构建奠定基础。方法：用酶消化-细胞单层培养法行细胞原代培养，传代扩增并冻存复苏，采用胰岛素和地塞米松进行诱导分化，碱性磷酸酶和钙化结节检测。结果：hMSCs可在体外培养，传代扩增并冻存复苏，并可诱导分化为成骨细胞。结论：可在体外分化为成骨细胞并钙化，可作为细胞移植及组织工程骨构建可靠的细胞来源。     

皮肤细胞悬液移植的基础研究：人黑素细胞膜片体外附着生长观察

目的：观察黑素细胞与BioFOLIE膜的亲和性，体外建立黑素细胞膜片，为改进细胞移植治疗白癜风做好准备。方法：把黑素细胞接种于BioFOLIE膜上，观察细胞生长形态，扫描和投射电镜观察黑素细胞和BioFOLIE膜的贴附状况。把接种黑素细胞的BioFOLIE膜按常规冻存到液氮中，复苏后观察黑素细胞的生长。结果：黑素细胞接种于BioFOLIE膜后很快贴壁。黑素细胞伸展充分，和六孔板中培养的黑素细胞形态类似。扫描电镜发现黑素细胞贴附很好，有长的树突形成。透射电镜可见细胞BioFOLIE膜粘贴紧密，膜表面形成小的裂隙，裂隙中有黑素颗粒。黑素细胞以膜片形式冻存复苏后大部分细胞存活，仍能培养传代。结论：黑素细胞在BioFOLIE膜上贴附快。伸展好。分泌黑素颗粒功能正常。两者亲和性好。用BioFOLIE膜制备的黑素细胞膜片观察容易，并能够冻存备用，使用方便。     

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定

目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征。方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养。进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原。结果 新分离的MSCs呈小圆形,形态规整。培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形。P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型。P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期。P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性。结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs。培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究。     

survivin基因RNA干涉对宫颈癌裸鼠移植瘤生长及凋亡和顺铂化疗敏感性的影响

目的观察survivin基因RNAi对宫颈癌裸鼠移植瘤生长、凋亡和化疗敏感性的影响。方法随机选择雌性BALB/C-nu/nu裸小鼠24只,细胞接种法建立4组人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,每天观察裸鼠一般状况及肿瘤生长情况,通过绘制肿瘤生长曲线并计算肿瘤生长抑制率,观察survivin基因RNAi对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响;通过免疫组化SP法检测各组移植瘤组织中survivin蛋白表达情况,TUNEL染色观察survivin基因RNAi对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤凋亡的影响;当肿瘤体积达0.2cm3时给予顺铂化疗以观察survivin基因RNAi对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤化疗敏感性的影响。结果成功建立4组人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,接种HeLa-s2组裸鼠肿瘤体积在每个检测点均明显小于接种HeLa组;观察结束时,接种HeLa-s2组裸鼠瘤重明显小于接种HeLa组,分别为：（0.369±0.043）g和（1.150±0.136）g（P〈0.05）;接种HeLa-s2组裸鼠肿瘤生长抑制率为67.9%。免疫组化结果显示：接种HeLa-s2组裸鼠survivin蛋白表达显著下降;TUNEL染色结果显示：接种HeLa-s2组裸鼠细胞凋亡明显增多,凋亡指数（AI）值达（22.73±1.37）%。顺铂化疗后不同检测点接种HeLa-s2组裸鼠肿瘤体积明显小于接种HeLa组,肿瘤生长明显受抑;观察结束后,接种HeLa-s2组裸鼠瘤重明显小于接种HeLa组,分别为：（0.323±0.058）g和（1.347±0.173）g（P〈0.05）;接种HeLa-s2组裸鼠肿瘤细胞凋亡明显增多,与接种HeLa组AI比较,接种HeLa-S2组AI明显升高,分别为：（37.38±1.01）%和（5.19±0.61）%（P〈0.05）。结论 survivin基因RNAi可通过下调移植瘤组织survivin蛋白表达抑制移植瘤生长并促进其凋亡,并通过增加顺铂化疗诱导的细胞凋亡,增强顺铂化疗对移植瘤的生长抑制,进而提高移植瘤对顺铂化疗的敏感性。     

Balb/c 裸鼠体内的干细胞致瘤实验简

背景：干细胞致瘤性研究是临床应用干细胞安全性所面临的实际问题。因此明确干细胞是否具有致瘤性尤为重要。裸鼠在肿瘤学、免疫学、药品及生物制品的安全性评价领域占据愈来愈重要的地位。目的：将神经干细胞、间充质干细胞移植在Balb/c免疫缺陷裸鼠皮下,检测其是否具有致瘤性。方法：将免疫缺陷Balb/c裸鼠随机分为5组,除空白组外,阳性对照组、阴性对照组、神经干细胞组和间充质干细胞组分别将肝癌细胞HepG2、人视网膜色素上皮细胞、传代至第4代的神经干细胞和间充质干细胞接种于裸鼠皮下,于注射后12周进行解剖检查,观察裸鼠移植部位肿瘤形成情况。同时进行软琼脂克隆形成实验,考察神经干细胞和间充质干细胞在体外软琼脂克隆形成情况。结果与结论：裸鼠致瘤性实验结果显示,空白组、阴性对照组、神经干细胞组、间充质干细胞组在接种12周后,未在裸鼠注射部位形成肿瘤,病理组织学检查未见异常。软琼脂克隆形成实验结果显示,神经干细胞和间充质干细胞在软琼脂阻力介质中未表现出细胞形成克隆的能力。提示短期传代后的神经干细胞、间充质干细胞不具有致瘤性。     

大鼠骨髓间充质干细胞的纯化、冻存及成瘤性分析

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量极低,体外的长期培养过程中易丧失干细胞潜能以及体内移植后安全性等问题的存在,限制了骨髓间充质干细胞在临床上的广泛应用。目的：探索体外分离纯化、冻存大鼠骨髓间充质干细胞的最适方法,并观察以此方法培养的骨髓间充质干细胞移植体内后是否具有成瘤性。方法：分别采用差速贴壁结合24h首次换液、24h首次换液、48h首次换液的方法纯化培养骨髓间充质干细胞,筛选最适纯化方法进行后续实验。配制含体积分数为10%,20%,30%,40%,50%胎牛血清的细胞冻存液冻存细胞,复苏后计算细胞存活率,测定复苏后细胞的生长曲线及成脂诱导能力。将第3,15代骨髓间充质干细胞进行裸鼠肌肉、肝脏局部注射体内移植,45d后取注射部位行病理组织标本检查。结果与结论：差速贴壁结合24h首次换液法所获得骨髓间充质干细胞纯度最高,而细胞增殖能力与其他两组无明显差别,因此选用该方法纯化骨髓间充质干细胞,然后进行传代培养;含体积分数为30%血清冻存液既可保证细胞活性与增殖能力,又可保证干细胞特性及多向分化潜能。骨髓间充质干细胞传至15代仍保持间充质干细胞特性,骨髓间充质干细胞移植入裸鼠肝脏45d后仍可在肝脏局部存活,生长状态与体外培养相似,无异型性及向周围浸润生长,提示体外长时间培养15代以内的骨髓间充质干细胞可在裸鼠体内存活且无成瘤性。     

大鼠骨髓基质干细胞的培养鉴定及向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的研究体外培养大鼠骨髓基质于细胞的方法及其生长特点和成骨能力。方法通过贴壁培养法和密度梯度离心法分离成年大鼠骨髓基质干细胞，应用含维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠的诱导分化培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化，检测碱性磷酸酶活性和细胞矿化作用。结果原代培养基质干细胞首先形成细胞集落，14d时集落间接近融合；传代细胞体积变大，约5～7d传代一次。诱导条件下，细胞碱性磷酸酶活性明显增高，并出现了矿化结节。结论骨髓基质干细胞易于体外分离培养及扩增，成骨能力较强，可作为骨组织工程的种子细胞。     

非诱导条件下犬骨髓基质干细胞的生物特性

背景：种子细胞的研究是组织工程众多研究领域中最重要的基础环节，骨髓基质干细胞以其诸多优点。成为理想的骨组织工程的种子细胞。 目的：观察骨髓基质干细胞在体外培养的生长特点和非诱导条件下的成骨特性。 设计：单一样本实验。单位：福建医科大学附属口腔医院种植中心。 材料：实验于2003-05／12在福建医科大学附属口腔医院中心实验室完成。骨髓基质干细胞来自4只1岁龄的杂交犬的原代～第3代传代细胞。 方法：无菌条件下在杂交犬两侧股骨大转子部做骨髓穿刺，抽取5mL肝素抗凝的骨髓，加入到含有50mL含双抗Dulbeeco’s改良的Eagle＇s培养液的离心管中分离单个核细胞，进行首次提纯获取骨髓基质干细胞单细胞，置培养箱中培养传代，培养48h后，吸除培养液，以后每3天换液1次。继续传代。采用倒置相差显微镜及苏木精一伊红染色观察骨髓基质干细胞形态；每天进行细胞计数，测定倍增时间，绘生长曲线；用钙钴法检测碱性磷酸酶；用茜素红法染色观察钙化结节生长情况。 主要观察指标：①犬骨髓基质干细胞光镜结构。②犬骨髓基质干细胞生长曲线。③成骨分化指标碱性磷酸酶及钙化结节的观察。 结果：①形态学观察表明，骨髓基质干细胞贴壁细胞呈集落生长。有成纤维样细胞外观，未加入成骨诱导剂，细胞形态发生变化。②碱性磷酸酶表达原代细胞呈强阳性，第1代细胞呈阳性，第2，3代细胞呈弱阳性。③钙沉积出现，原代细胞染色强于传代细胞。 结论：①骨髓基质干细胞在体外培养能大量扩增，具有自然向成骨细胞分化的能力，是骨组织工程理想的种子细胞。②3代内扩增的骨髓基质干细胞有成骨活性，但原代细胞传代活性优于传代后细胞。     

抑制MDC1基因蛋白表达对裸鼠食管癌细胞移植瘤大小及放疗敏感程度的影响

目的分析抑制MDC1基因蛋白表达对裸鼠食管癌细胞移植瘤大小及放疗敏感程度的影响。方法取54只SPF级BALB/C雄性裸鼠,构建食管癌动物模型。通过MDC1 mRNA序列,对有效的干扰序列与阴性对照序列进行设计并合成,且与载体p SIH1-H1-cop GFP生成重组质粒。裸鼠随机分为6组,分别为空白对照组(Eca109细胞未进行任何处理)、阴性转染组(转染阴性Eca109细胞)、单一照射组(Eca109细胞仅进行放射线照射)、阳性转染组(转染阳性ECA09细胞)、阴性转染+照射组(转染阴性Eca109细胞联合放射线照射)、阳性转染+照射组(转染阳性ECA09细胞联合放射线照射),每组各9只。采用蛋白印迹法与实时荧光定量PCR法对MDC1蛋白及mRNA表达量进行检测,取MDC1阳性转染Eca109细胞、阴性转染的Eca109细胞,分别将其接种于裸鼠。记录各组裸鼠移植瘤照射后1周、2周、3周、4周的体积变化情况,并用流式细胞仪对裸鼠移植瘤组织中细胞周期分布及细胞凋亡情况进行检测,且根据蛋白印迹法对各组裸鼠移植瘤组织中CHK2、CHK2-T68、CHK1表达情况进行检测,并将所得数据纳入统计学分析。结果p MDC1-shRNA质粒成功构建,且Eca109细胞得以转染,取得MDC1稳定转染的Eca109细胞。接种的裸鼠均成活,且于接种后7 d左右裸鼠爪下移植瘤形成。经15 Gy照射后,单一照射组、阴性转染+照射组裸鼠移植瘤生长速度较空白对照组明显减缓(P 0. 05),阳性转染+照射组裸鼠移植瘤生长速度较其它各组均明显减缓(P 0. 05),生长抑制率明显增高(P 0. 05)。照射前,各组裸鼠移植瘤体积的比较,并无显著差异(P 0. 05);照射后1周、2周、3周、4周,空白对照组裸鼠移植瘤增长较明显,阳性转染+照射组裸鼠移植瘤增长较缓慢,与单一照射组、阴性转染+照射组裸鼠移植瘤体积明显缩小(P 0. 05)。各组裸鼠移植瘤组织中细胞周期分布及细胞凋亡率的比较,并无显著差异(P 0. 05)。与对照组、单一照射组比较,阳性转染+照射组裸鼠移植瘤组织中CHK2-T68磷酸化水平显著下降(P 0. 05),而CHK2与CHK1蛋白表达水平较接近(P 0. 05)。结论 RNA干扰下调MDC1基因蛋白表达具有提高裸鼠食管癌细胞放疗敏感程度的作用,主要体现在阻滞放射线照射后裸鼠移植瘤的肿瘤体积增长方面。     

脑脊液体外培养骨髓间充质干细胞

背景：细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段,但目前尚缺乏脑脊液对细胞影响的实验依据。目的：动态观察体外脑脊液培养骨髓间充质干细胞的变化。方法：采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,并传代扩增。选择生长良好的第3,4代细胞接种于脑脊液中,通过细胞免疫化学染色法鉴定脑脊液对细胞表型的影响。取生长良好的第5代细胞,分别用含小牛血清的L-DMEM和脑脊液培养。结果与结论：运用密度梯度离心结合贴壁培养法能成功有效地分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,表型鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性。脑脊液培养后细胞仍为骨髓间充质干细胞形态,并可见少量小圆细胞,表现为神经样细胞,表形鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性,神经元特异性烯醇化酶呈弱阳性（〈1%）。细胞具有相似的S形生长曲线,生长曲线基本相似。提示骨髓间充质干细胞在脑脊液培养基中可继续生长和增殖,无诱导分化作用,且细胞对生长环境有高度的适应性。