气质联用技术检测尿琥珀酰丙酮及其在酪氨酸血症诊断中的应用

目的建立气相色谱质谱用技术(GC-MS)测定尿琥珀酰丙酮(SA)的方法,用于临床上鉴别诊断酪氨酸血症Ⅰ型患者。方法尿SA先用盐酸羟胺进行污化反应,然后用乙酰乙酸2次萃取,双三甲基硅烷-三氟乙酰胺(BSTFA-TMCS)衍生化,衍生化后的SA用气相色谱质谱仪进行测定分析。质谱分析模式采用选择离子监测(SIM)模式进行检测,SA选择212/182 m/z,内标丙二酸选择233/248 m/z。分析该法的精确性、稳定性、样本回收率、残留分析和实测浓度与加入浓度之间的相关性。用该法检测肝肿大伴酪氨酸升高的13例患者。结果SA批内变异系数(CV)为6.8%;批间CV为7.8%;回收率为94.0%~102.0%;前处理CV为12.4%;残留分析<1%。在5~120 mg/mL之间,实测浓度与加入浓度之间的相关系数(r)为0.997。内标丙二酸回收率为95.0%~103.0%。确诊酪氨酸血症Ⅰ型患儿2例,尿SA浓度分别为26、54 mmol/mol肌酐。结论GC-MS测定尿SA具有较高的回收率、精确性和准确性,为临床上鉴别诊断酪氨酸血症Ⅰ型提供了新的方法。     

气-质联用技术测定尿有机酸方法的建立及在遗传代谢病诊断中的应用

目的 利用气-质联用技术测定尿液中有机酸种类及含量的变化,为先天性遗传代谢病,特别是有机酸代谢紊乱提供新的诊断依据.方法 收集临床高度怀疑为有机酸代谢紊乱的195例患儿的尿液标本,根据肌酐含量取相应体积的尿样和内标,加盐酸羟胺对带羟基的有机酸进行圬化反应生成酮体后,用乙酸乙酯和乙醚萃取有机酸,三甲基硅烷衍生;测定采用Agilent GC/MS 6890/5973i气相质谱仪,选择扫描模式检测,测定质荷比(m/z)范围在50～550 m/z的所有有机酸,数据处理采用Agilent GCMSD ChemStationGl701DA软件.用健康对照样本中加人的内标和阳性对照样本中加入的阳性有机酸进行分析方法的线性范围、精密度、准确性、样本回收率和残留分析.结果 该方法可测定尿液中100余种有机酸,以健康对照者尿样中加入的二甲基丙二酸(MMA)和2-苯基丁酸(2-PA)内标为参考,最低检测极限为2.5～2.8μmol/L;批内和批间变异系数均<10%,样本前处理批间变异系数为11.4%;样品回收率为95%～105%,残留分析<1%,所有参数均符合临床检测的要求.用该方法检测的临床患儿尿样中,发现诊断阳性病例12例,包括6例甲基丙二酸血症、1例丙酸血症、3例酪氨酸血症Ⅰ型、1例枫糖尿病和1例Ketosis病(酮症病).结论本研究建立了气-质联用技术分析测定尿液中有机酸的方法,可用于先天性遗传代谢性疾病的筛查诊断.     

同位素稀释液相色谱串联质谱法测定人血清尿酸

目的建立一种使用同位素稀释液相色谱串联质谱（ID-LC/MS/MS）测定人血清尿酸的候选参考方法。方法用[1,3]1-5N2尿酸作内标,与一定量的血清充分混匀,加入等量乙腈沉淀血清蛋白并提取尿酸,氯仿纯化上清液后用液相色谱串联质谱（LC/MS/MS）分离测定。优化LC/MS/MS的色谱条件,评价该法的精密度、回收率和偏倚,并计算不确定度。结果对3个浓度水平的室间质量评价用质控血清测定3批,批内、批间和总变异系数（CV）的均值（范围）分别为0.54%（0.44%-0.69%）、0.66%（0.45%-0.79%）和0.86%（0.66%-1.02%）。加样回收试验回收率范围为98.38%-102.64%。美国国家标准与技术研究所（NIST）标准物质SRM 909b-Ⅰ、Ⅱ的测定均值与靶值的偏倚分别为0.04%和0.25%。3种质控血清的相对扩展不确定度分别为1.80%、2.19%和2.04%。结论建立的ID-LC/MS/MS测定血清尿酸的方法精密、准确,有望作为血清尿酸测定的参考方法。     

同位素稀释气相色谱质谱法测定血清总胆固醇

目的建立一种新的同位素稀释-气相色谱-质谱（ID／GC／MS）测定人血清总胆固醇的方法。方法取一定量的血清样品与[3，4-^13 C2]-胆固醇内标溶液充分混匀，水解并提取溶液中的胆固醇后，用N，O-二-（甲基硅烷）三氟乙酰胺（BSTFA）衍生胆固醇为三甲基硅烷醚；气相色谱．四极杆质谱（GC/MS）选择检测目标离子。检测标准溶液和血清样品的m／z368和m／z370的离子强度并积分，校正标准溶液中天然同位素胆固醇对内标的影响，将校正后的胆固醇和内标的m／z368和m／z370面积比对胆固醇标准溶液浓度做线性回归。用拟合的回归方程定量血清样品胆固醇浓度。结果建立的ID／GC/MS测定胆固醇的方法平均批内变异系数0，04％～0．81％。分析美国国家标准物质与技术研究所（NIST）2个浓度水平的标准血清SRM1951a，相对偏差分别是0．19％和0．90％。结论建立的ID／GC/MS测定胆固醇的方法操作简单、精密，可以用做血清胆固醇的准确定量。     

气相色谱-质谱联用技术在遗传代谢性疾病诊断中的应用

目的探讨气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术在遗传代谢病诊断中的应用。方法收集5 778例疑似遗传代谢病患儿的尿液,经萃取、衍生后采用GC-MS技术检测132种代谢产物,通过遗传代谢病分析软件并结合实验室其他检测等进行诊断。结果 5 778例疑似患儿尿液样本中有1 100例(19%)有异常代谢产物,共有106例患儿被明确诊断出17种疾病,其中尿液中特征性指标异常的患儿80例、结合血串联质谱结果确诊26例患儿。80例尿液出现特征性指标异常的患儿中有机酸代谢障碍疾病患儿65例,确诊疾病11种;氨基酸代谢障碍疾病患儿15例,确诊疾病3种;包括甲基丙二酸血症33例、高苯丙氨酸血症12例、丙酸血症7例、戊二酸血症Ⅰ型7例、尿素循环障碍6例、β酮硫解酶缺乏症3例、乙基丙二酸血症2例、枫糖浆尿症2例、异戊酸血症2例、多种羧化酶缺乏症2例、酪氨酸血症Ⅰ型1例、2-羟基戊二酸血症1例、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症1例、3-羟基-3-甲基戊二酸尿症1例。结合血串联质谱结果确诊的26例患儿中希特林蛋白缺乏症19例、极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症5例、中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症2例。结论 GC-MS技术对有机酸代谢异常和部分氨基酸代谢异常诊断有特异性。GC-MS技术检测结果影响因素多,但对疾病最终诊断无影响。     

同位素稀释液相色谱串联质谱法测定血清总甘油

目的 建立同位素稀释液相色谱串联质谱测定血清总甘油的方法.方法 以[13C3]-甘油作内标,用氢氧化钾异丙醇溶液水解血清甘油酯为游离甘油,将游离甘油转化为苯甲酸酯,用同位素稀释液相色谱串联质谱(LC/MS/MS)分离检测,用标准曲线法定量.结果 甘油/内标峰面积比与甘油浓度(0.565～4.517 mmol/L)线性相关系数大于0.999 9;测定不同浓度血清总甘油批内变异系数(CV)平均为0.52%(范围0.21%～2.62%),总CV平均为1.15%(范围0.62%～2.00%);分析国际和国家标准物质,测定值与认证值的偏倚小于1%(-0.20%～1.06%).结论 建立同位素稀释液相色谱串联质谱测定血清总甘油方法,方法特异、精密、准确,可望用作血清总甘油测定参考方法.     

血清铁测量参考方法的建立及方法学评价

目的建立血清铁测定亚铁嗪分光光度比色法的参考方法,对此方法进行性能验证,评价其是否可以作为参考方法用于临床实验室。方法按照美国临床和实验室标准协会（CLSI）的推荐方法,建立参考方法,通过测定标准参考物质（SRM）以及回收实验,来验证参考方法的准确性。测定3个不同浓度的混合血清样本,观察该方法的精密度。结果用亚铁嗪分光光度比色法测定SRM3126a,偏倚为0.04%-0.74%,回收率为101.33%-101.47%。3个不同浓度的混合血清样本批内变异系数（CV）为0.20%-0.28%,批间CV为0.26%-0.70%,总CV为0.33%-0.75%。基质中已知的其它成分对血清铁的测定结果无干扰。结论亚铁嗪分光光度比色法测定血清铁精密度高、准确度好,建议其作为测定血清铁的候选参考方法。     

串联质谱技术筛查新生儿甲基丙二酸血症回顾性分析

目的回顾性分析串联质谱技术在新生儿甲基丙二酸血症筛查中的应用。方法利用液相串联质谱技术筛查2015年10月至2017年12月在该院进行48项遗传代谢病检测的样本近10万例,对初筛为阳性的样本做召回复查,对复查仍为阳性的样本通过气相色谱质谱技术进行尿有机酸分析,并采用基因测序作进一步确诊。结果通过对近10万例样本进行筛查,发现132例疑似甲基丙二酸血症、丙酸血症样本,确诊甲基丙二酸血症1例,丙酸血症1例。结论串联质谱技术对甲基丙二酸血症的诊断有重要的提示作用,需密切结合气相色谱质谱和测序技术鉴别诊断丙酸血症。     

西酞普兰血药浓度测定方法改进及其在血浆中稳定性观察

目的 建立测定人血浆中西酞普兰浓度的超高效液相串联质谱法,观察西酞普兰在血浆中的稳定性。方法 流动相为体积分数0.05%甲酸溶液-乙腈（30∶70）,流速为0.1mL/min,进样量为5L,柱温为35℃,样品室温度为4℃。采用Agela公司Venusil MP C18色谱柱（2.1mm×50mm,3μm）分离,通过电喷雾离子化四极杆串联质谱,以多反应监测方式进行检测。用于定量分析的离子反应分别为m/z 325.22→109.25（西酞普兰）和m/z 265.23→167.37（内标盐酸苯海拉明）。结果 西酞普兰的线性范围为0.55~137.04μg/L,日内、日间精密度相对标准差均〈10%;血浆中西酞普兰低、中、高浓度水平的提取回收率分别为（89.6±2.1）%、（72.4±0.6）%、（86.3±2.5）%,内标为（77.2±0.7）%,相对回收率分别为（92.6±7.0）%、（100.7±7.3）%、（106.4±4.4）%;西酞普兰血样长期冷冻稳定性、标准品溶液及内标贮备液长期稳定性、多次冻融稳定性、室温稳定性均较佳。结论 本研究建立的分析方法快速、准确、灵敏、简便,适用于西酞普兰血浆药物浓度测定。     

串联质谱和高效液相色谱-串联质谱二次筛查联合应用于新生儿MMA筛查

目的探讨串联质谱和高效液相色谱-串联质谱二次筛查联合应用在甲基丙二酸血症(MMA)中的筛查价值。方法收集新生儿串联质谱初筛结果中C3、C3/C2、C3/C0单一或多个指标异常的新生儿干血滤纸片标本,用高效液相色谱-串联质谱的方法定量检测原始血片中甲基丙二酸、甲基枸橼酸和高半胱氨酸,对二次筛查后疑似阳性的新生儿进行召回复查,并进行尿气相色谱/质谱检测。临床诊断患儿进一步予以基因检测进行确诊。结果共收集423例C3、C3/C2、C3/C0单一或多个指标异常的新生儿筛查标本,初筛阳性率约为1%,行联合筛查检测结果发现8例标本中甲基丙二酸和同型半胱氨酸表达水平明显升高,召回复查尿气相色谱质谱提示甲基丙二酸轻度升高。结论串联质谱和高效液相色谱-串联质谱联合应用可以提高新生儿MMA筛查的阳性预测值、降低假阳性率,在新生儿遗传代谢病筛查中具有重要价值。     

胶乳增强免疫比浊法测定胃蛋白酶原Ⅱ的不精密度和线性观察

目的对胶乳增强免疫比浊法测定胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)进行初步方法学评价,为临床应用提供依据。方法依据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)EP5-A及EP10-A2文件提供的方法,对胶乳增强免疫比浊法测定PGⅡ进行初步的评价。结果 PGⅡ的低值样本批内变异系数(CV)为2.05%、批间CV为1.60%、日间CV为3.92%、总CV为4.70%;高值样本批内CV为1.70%、批间CV为1.21%、日间CV为3.79%、总CV为4.32%。当PGⅡ浓度分别为9.6、24.7、39.8μg/L时,相对偏倚分别为-0.18、-0.47、-0.39μg/L,总不精密度分别为4.98%、2.39%、2.71%。测试间的携带污染差异无统计学意义(P>0.05)。线性回归方程为Y=0.975 7X-0.016 8,决定系数(R2)=0.998 7。结论胶乳增强免疫比浊法测定PGⅡ的精密度符合EP5-A文件标准,具有良好的重复性。线性、偏倚、总不精密度及抗交叉污染能力均达到EP10-A2文件标准,符合临床应用要求,适用于实验室常规测定。     

尿α-L-岩藻糖苷酶对糖尿病早期肾损害的诊断价值

目的探讨尿α-L-岩藻糖苷酶(AFU)测定在筛查糖尿病(DM)早期肾损害中的临床应用价值。方法将178例2型DM患者按24 h尿微量白蛋白(mAlb)排泄率分为DM无肾病组(79例)、DM早期肾病组(54例)和DM临床肾病组(45例)。应用本室建立的连续监测法检测178例2型DM患者和320名正常对照者尿AFU、mAlb、尿β2-微球蛋白(β2-MG)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)含量,并进行比较。结果采用连续监测法检测尿AFU在300 U/L以下线性良好;高、低浓度样本批内变异系数(CV)分别为1.69%、1.26%,批间CV分别为4.51%、3.52%。维生素C、胆红素和血红蛋白分别为50 mg/L、136.8μmol/L和1 g/L时对尿AFU不产生干扰。DM组尿AFU、mAlb、β2-MG、NAG分别为(2.87±0.91)U/g.Cr、(67.62±21.27)mg/g.Cr、(0.48±0.32)mg/g.Cr、(29.23±8.29)U/g.Cr,均明显高于正常对照组[(0.82±0.45)U/g.Cr、(11.54±8.81)mg/g.Cr、(0.11±0.07)mg/g.Cr、(9.08±5.21)U/g.Cr](P<0.01)。DM 3个亚组之间尿AFU、mAlb、β2-MG、NAG差异均有统计学意义(P<0.01)。DM患者尿AFU与NAG呈高度正相关(r=0.859,P<0.01)。79例DM无肾病组尿AFU阳性率高达19.0%,特异性为85.7%,敏感性为91.8%,Youden指数为0.77,诊断效率89.9%。99例DM肾病患者治疗后AFU水平为(2.7±1.26)U/g.Cr,明显低于治疗前[(4.6±1.72)U/g.Cr](P<0.01)。结论尿AFU测定是筛查DM早期肾损害的一项有价值的指标。     

酮胺氧化酶法测定糖化白蛋白的评价

目的对酮胺氧化酶法测定糖化白蛋白（GA）进行方法学评价。方法分析及评价Lucica GA-L试剂盒的精密度、稀释线性、回收率、干扰因素以及试剂稳定性。比较GA与糖化血红蛋白（HbA1c）的相关性,GA与果糖胺（GSP,NBT法）的相关性。比较溴甲酚绿法（BCG）和溴甲酚紫法（BCP）测定白蛋白的相关性。结果该试剂精密度高,批内CV〈1.4%,批间CV〈2.4%;稀释线性良好;GA的平均回收率为96.74%,ALB的平均回收率为96.73%;葡萄糖、乳糜、胆红素对酶法检测GA无明显干扰,但是血红蛋白浓度在1.82 g/L以上时,对结果的影响超过10%。试剂可稳定4周以上。GA与HbA1c相关性良好（r=0.8940,P〈0.001）。BCG法测定白蛋白的值（-x±s,37.1±8.4 g/L）较BCP法（-x±s,33.3±10.0 g/L）高,二者相关性良好（r=0.9908,P〈0.001）。当ALB〉30 g/L时,GA与GSP相关良好（r=0.8474,P〈0.001）;当ALB〈30 g/L时,GA与GSP相关性差（r=0.5697,P〈0.05）。结论该方法分析性能良好,能定量分析糖化白蛋白,并计算其与白蛋白的比值,受到的影响因素较少,能较好的监测短期内平均血糖水平。     

总胆红素氧化酶法检测系统的性能评价

目的评价氧化酶法测定血清总胆红素（TBil）的性能。方法用氧化酶法测定血清TBil,探讨氧化酶法的精密度、线性、分析灵敏度、抗干扰性和回收率,并与改良J-G法进行比较。结果 TBil的高、低浓度样本批内CV分别为0.38%、0.78%,日间CV分别为1.78%、2.73%;平均回收率为101.2%;分析灵敏度为1.23μmol/L;线性范围为1.23～574.40μmol/L;2种方法相关性良好,直线回归方程为Y=1.105X-1.11,r=0.998。血红蛋白、维生素C和脂肪乳分别为4.8 g/L、500 mg/L和5%时对氧化酶法测定血清TBil不产生干扰。结论氧化酶法具有良好的精密度、线性范围和抗干扰能力,与改良J-G法具有很好的一致性,适用于临床常规检测。     

两种检测方法测定C反应蛋白的比较

目的评估速率散射比浊法和免疫透射比浊法检测C反应蛋白(CRP)的分析性能。方法分别采用速率散射比浊法(美国Siemens Healthcare Diagnostica公司BN-Ⅱ特定蛋白仪)和免疫透射比浊法(芬兰OrionDiagnostica公司CRP快速检测仪)对CRP进行测定,方法学评价指标为精密度、线性范围、抗干扰性、相关性及偏倚。结果 CRP浓度为2.0～80.0 mg/L时,BN-Ⅱ特定蛋白仪总变异系数(CV)<6%;CRP浓度为8.0～80.0 mg/L时,CRP快速检测仪总CV<7%;检测线性范围为8.0～70.0 mg/L。血红蛋白(Hb)<10 g/L、胆红素(Bil)<300 mg/L对2种方法检测干扰<10%,在可接受范围内。甘油三酯(TG)<20 mmoL/L时BN-Ⅱ特定蛋白仪不受影响(干扰<10%)。CRP快速检测仪在TG>15 mmol/L时低值血清干扰>10%,高值血清不受干扰。50份血样相关分析的结果显示2台仪器测定结果的相关性良好(r=0.98,P<0.01)。线性回归分析经Cusum检验显示2台仪器间偏倚差异无统计学意义(P>0.05),BN-Ⅱ特定蛋白仪测定结果较CRP快速检测仪结果偏低,Bland-Altman曲线显示2种方法的平均偏倚为-2.1。结论速率散射比浊法和免疫透射比浊法的精密度、抗干扰性、线性范围符合要求。虽然系统间测定结果存在一定偏倚,但也符合临床检测要求。     

迪瑞FUS-200全自动尿沉渣分析仪的应用评价

目的评价迪瑞FUS．200全自动尿沉渣分析仪的性能及临床应用价值。方法对FUS-200的精密度、线性、携带污染率等指标进行了评价,并用FastRead10尿沉渣定量分析板（简称FastRead10板）对红细胞、白细胞的检测进行比对分析,检测FUS．200自动混匀能力。结果低、中、高值尿液标本中批内精密度（CV）：红细胞分别为10．21％、5．18％、1．97％,白细胞分别为6．21％、2．35％、1．77％。FUS-200检测值与理论值具有良好的线性关系（红细胞：Y=1．005X＋397．280,r=0．994;白细胞：Y=1．018X＋133．458,r=0．992）。红细胞、白细胞携带污染率分别为0．05％．0．22％、0。0．15％。FUS．200和FastReadl0板手工镜检两种方法对低、中、高值3个量级的红细胞、白细胞的检测结果之间差异无统计学意义（P〉0．05）。即刻、放置lh、2h的尿液与放置1h、2h后加人工辅助混匀的尿液中红细胞、白细胞的计数结果差异无统计学意义（P〉O．05）。结论FUS-200性能优良,自动化程度高,可用于临床尿沉渣的定量分析。     

超高效液相色谱快速检测万古霉素浓度方法的建立和性能评价

目的建立一种基于超高效液相色谱(UPLC)技术快速测定血清万古霉素浓度的方法并评价其性能。方法以去甲万古霉素为内标,以0.3 mol/L硫酸锌水溶液为蛋白沉淀剂,对血清样本进行前处理。色谱柱为Phenomenex Kinetex C18柱(100 mm×2.1 mm,2.6μm),流速为0.5 mL/min,检测波长为220 nm,柱温40℃。流动相A为25 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH值为2.5),流动相B为乙腈,进行梯度洗脱,并对方法的线性、准确度(加标回收率)、精密度、携带污染率、定量限和检测限等分析性能进行评价。分别采用UPLC和高效液相色谱(HPLC)测定50例患者血清万古霉素浓度,并对测定结果进行方法学比对和评价。结果UPLC测定万古霉素的线性范围为2.0~99.6μg/mL,定量限和检测限分别为1.0和0.1μg/mL。低、中、高浓度样本的平均批内变异系数(CV)分别为3.28%、2.21%、2.59%,批间CV分别为5.73%、2.75%、0.82%。低浓度(2.0μg/mL)、中浓度(19.9μg/mL)、高浓度(79.6μg/mL)加标样本的平均加标回收率分别为104.06%、99.80%、100.19%。中浓度样本的携带污染率为0.57%,高浓度样本的携带污染率为0.19%。UPLC和HPLC测定患者血清万古霉素浓度具有良好的相关性(r=0.9919)。结论建立了基于UPLC技术的万古霉素血药浓度监测方法,该方法的重现性好、快速、简便、灵敏度高、准确度高,适用于临床常规万古霉素药物浓度监测。     

胶乳增强免疫比浊法测定糖化血红蛋白的方法学评价

目的应用美国,旌床实验室标准化委员会的标准化评价方案对胶乳增强免疫比浊法测定HbAlc进行方法学评价。方法依据标准化文件要求,分析胶乳增强免疫比浊法测定HbAlc的精密度、线性范围、回收率和干扰因素,并考察其与高效液相色谱法的相关性。结果该法总变异系数为3．19％（低值）,3．53％（中值）和4．11％（高值）。平均回收率100．2％,在4．4％～13．5％范围内线性良好。胆红素在884μmol／L,三酰甘油在13．5mmol／L时对测定存在干扰。试剂和样本在低温保存时可稳定10天。该法与HPLC法结果明显相关,r=0．994,但整体略高于HPLC法的结果。结论胶乳增强免疫比浊法测定HbAlc方法符合NCCLS标准要求,适应临床需要。临床实验室在建立或引进新的检验项目时需要进行系统的方法学评价以验证检测的有效性和完整性。     

实时荧光定量PCR检测病毒核酸方法学性能验证程序的探讨

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测病毒核酸的方法学性能验证程序。方法参考美国国家临床实验室标准化协会（CLSI）颁布的相关文件对实验室开展PCR检测病毒核酸进行方法学性能验证;通过稀释标本直至低于检测下限进行定量检出限验证实验。结果乙型肝炎病毒核酸（HBV-DNA）检测的批内精密度（CV批内）分别为4.28%和2.08%;总精密度（CV总）为4.14%和2.69%;与比对方法回归方程为y=1.1082x-0.5225;线性相关系数为0.9976,回归方程为y=0.9771x-0.0062,线性范围为1.08E3~1.05E8;定量检出限为500IU/mL。丙型肝炎病毒核酸（HCV-RNA）检测的CV批内分别为4.11%和2.63%;CV总为5.15%和3.41%;与比对方法回归方程为y=1.0075x-0.0662;线性相关系数为0.9974,回归方程为y=1.0479x-0.2594,线性范围为1.50E3~2.53E7;定量检出限为1000IU/mL。结论实验室开展PCR检测项目前有必要进行方法学验证,根据实际情况选择实验方案和统计方法可减少人力和财力。