苏州地区献血者血小板CD36抗原表型筛查及基因突变分析

目的 了解苏州地区血小板CD36抗原表达情况及其抗原缺失频率和基因多态性特征,为建立血小板CD36阴性表型资料库提供参考依据.方法 随机选取805例苏州市中心血站无偿献血者抗凝全血,流式细胞术筛查血小板和单核细胞表面CD36抗原的表达,分析抗原缺失类型,并结合基因组DNA测序,检测导致CD36抗原缺失的基因突变类型.结...     

重庆地区无偿献血者CD36抗原缺失的表型及基因型研究

目的探索CD36基因型与表型之间的关系。方法应用流式细胞技术对重庆地区400名献血者的CD36基因表达进行检测,并针对CD36抗原阴性的样本用聚合酶链式反应(PCR)为基础的基因测序对其外显子(exon)2—14进行测序和比对。结果重庆地区献血者CD36抗原缺失型频率为0.75%(3/400),均为Ⅱ型缺失,其频率为0.75%(3/400)。测序分析显示3个表型缺失样本在CD36基因编码区域内没有发生突变,但均在CD36基因起始密码子上游位于外显子2 nt-132(rs1049654)的位点发生了A>C突变。结论重庆地区CD36缺失型频率与中国其他地区存在一定差异,CD36基因的表达,除了编码区域外,还可能受到该基因非编码区域的影响。     

共信号分子CD40/CD40L质粒标准品的构建

背景:目前,对CD40/D40L的研究主要集中在可溶性和蛋白方面,对其在转录水平上的研究文献不多,可能与其无商品化质粒标准品有关.目的:构建检测CD40/CD40L mRNA表达水平差异的标准品.设计、时间及地点:单一样本实验,于2009-04在苏州大学附属第一医院检验科实验室完成.材料:取手术切除的子宫肌瘤组织,经患者知情同意.方法:以手术切除的子宫肌瘤组织细胞的总RNA为模板、Random 6mers为引物反转录合成cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人CD40/CD40L基因相应的cDNA片断,构建PMD-18-CD40/CD40L重组质粒,鉴定测序后,用荧光定量PCR制作标准曲线.主要观察指标:①RNA质量检测结果.②扩增的目的片段电泳结果.③CD40/CD40L基因测序结果.④标准品的扩增情况.结果:组织提取的总RNA完整性良好,构建的CD40/CD40L质粒经PCR扩增后分别得到136 bp,200 bp的清晰条带,测序结果与目的片段完全一致,且质粒的原始浓度为2.66×10~(13)、2.45×10~(13) copies/mL,倍比稀释至2.0×10~6 copies/mL均能得到良好的标准曲线(R~2=1).结论:实验成功构建了CD40/CD40L基因荧光定量PCR标准质粒.     

CD36抗原缺失与输血相关免疫的研究进展

CD36抗原作为一种模式识别受体,参与机体一系列的病理生理过程,其在输血医学中也一直备受关注.本文将从CD36的发现、结构及其表达情况,CD36抗原缺失的类型及频率,抗-CD36与输血相关免疫性疾病的关系等作一简要综述.     

2种重叠延伸PCR技术构建5种立克次体融合基因的方法学比较

摘要:目的?采用2种重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术将5种立克次体目的基因片段进行融合，同时对2种方法进行比较。方法?采用一步法及两步法融合基因技术，对5种立克次体融合基因进行构建，并优化一步法中重叠引物浓度以及两步法中各靶基因产物加入量，以提高2种方法的融合效率。结果?成功建立5种立克次体融合基因。一步法基因融合过程中重叠引物浓度在0.1～0.01 μmol/L时，912 bp的融合基因条带亮度较高，且杂带较少；两步法基因融合过程中各靶基因产物加入量为0.1～0.25 μL时，912 bp的融合基因条带亮度较高，且杂带较少。结论?一步法基因融合技术操作简单、耗时短且耗材少，在掌控好退火时的温度及时间的情况下是一种经济、方便且高效的融合技术。为后续进行立克次体融合基因表达载体构建以及立克次体分子生物学多重检测提供实验模板。     

血型CD36基因在泛癌中的综合分析

目的 通过生物信息学方法研究血型CD36基因在人类恶性肿瘤的表达及其与预后、临床分期和免疫浸润的关系,阐明其对肿瘤的预后评估价值。方法 运用UALCAN数据库分析CD36蛋白在肿瘤组织和正常组织间的表达差异;运用GEPIA数据库分析CD36表达与泛癌分期之间的关系;运用SangerBox数据库分析CD36表达与泛癌患者生存预后的关系,分析泛癌中CD36蛋白表达与免疫浸润及TMB、MSI等的相关性,运用String数据库分析与CD36上下游相关的蛋白。结果 研究显示CD36基因在9种肿瘤中观察到了显著上调（P <0.05）,18种肿瘤中观察到了显著下调（P <0.05）,CD36表达的高低与不同类型肿瘤患者的分期和预后密切相关,CD36在不同的肿瘤中发挥着不同的作用。CD36基因在39个癌种中表达与免疫浸润显著正相关（P <0.05）,CD36可能在调节肿瘤免疫环境方面起到重要作用。KEGG和GO富集分析结果显示,候选基因主要参与了toll样受体信号通路、NF-κB信号通路和免疫相关通路免疫应答激活信号。结论 CD36基因在不同肿瘤中存在表达差异,CD36基因与多种肿瘤...     

深圳地区血小板捐献者CD36抗原缺失型的基因多态性研究

目的:分析58名CD36抗原缺失型血小板捐献者的CD36基因分子变异情况。方法:选取2019年9月至2020年12月本实验室筛查到的58名CD36抗原缺失型献血者,并将其作为研究组,其中男性39名,女性19名,均为汉族。另随机挑选2020年12月深圳市血液中心血小板无偿献血者120名,其中男性76名,女性44名,均为汉族,经流式细胞术检测CD36抗原阳性者作为对照组。采用PCR-SBT检测所有样本CD36基因的编码区,分析献血者CD36抗原缺失型的基因突变情况,并与抗原阳性对照者的基因突变类型进行比较。结果:58名CD36抗原缺失型献血者中,有32名检测出CD36基因突变,Ⅰ型71.43%(5/7),Ⅱ型52.94%(27/51)。120名CD36抗原阳性对照者中有12名检测出CD36基因突变,突变个体比例为10%。在CD36抗原缺失型献血者中发现16种基因突变,发生突变频率最高的为329-330 del AC(20.69%),其次为1228-1239 del ATTGTGCCTATT(15.52%)和1156 C>T(10.34%)。198-205 del GATCTTTG和2...     

干扰素γ对巨噬细胞CD36表达的影响

目的探讨干扰素γ对Ox-LDL刺激的巨噬细胞清道夫受体CD36表达的影响。方法收集小鼠腹腔巨噬细胞,培养后将贴壁细胞分为5组:1、正常对照组,用生理盐水刺激培养的巨噬细胞;2、Ox-LDL处理组,Ox-LDL 50mg/L刺激培养的巨噬细胞;3、4、5组为不同剂量的干扰素γ处理组,分别用不同剂量的重组INFγ(终末浓度分别为50、100、200ng/mL)刺激培养的巨噬细胞,然后加入Ox-LDL 50mg/L。24h后收集培养的细胞,用流式细胞仪测定巨噬细胞清道夫受体CD36的表达。结果Ox-LDL处理组与对照组比较,巨噬细胞清道夫受体CD36表达水平显著增高(P<0.01),干扰素γ各剂量组与Ox-LDL处理组比较,CD36表达显著减少(P<0.05)。结论Ox-LDL能明显刺激巨噬细胞清道夫受体CD36表达,干扰素γ抑制Ox-LDL引起的巨噬细胞清道夫受体CD36表达。     

重组人血小板CD36基因真核表达载体的构建及蛋白表达

目的制备具有功能活性的重组人血小板表面CD36抗原的纯化表达蛋白胞外区30～439氨基酸残基段。方法提取人肝细胞组织总RNA,经RT-PCR扩增编码人血小板CD36抗原胞外区(Gly30～Asn439)氨基酸残基cDNA,构建于原核表达载体pMD18并转化大肠杆菌DH5α,筛选获得阳性重组子pMD18-CD36,提取质粒。经序列测定后,将该基因插入到真核细胞瞬时表达载体pTE2上,构建成为pTE2-s-CD36-10 his真核瞬时表达载体。采用lipofectamine 2000(invitrogen)转染法,将重组质粒转染HEK-293细胞,表达产物经Ni2+2NTA柱层析纯化。结果 RT-PCR扩增获得了1.4 kb的片段。invitrogen测序,该序列分析结果与Genebank中的NM_001001547.2完全一致。SDS-PAGE证实转染的HEK-293细胞表达了人CD36抗原胞外区蛋白片段。结论利用构建的真核载体pTE2-s-CD36转染人胚肾细胞(HEK293)可高效表达CD36 Gly30～Asn439,得到纯化蛋白,为人血小板CD36表面抗原对血小板输注无效影响的深入研究奠定基础。     

合肥地区无偿献血人群CD36抗原缺失的调查

目的 研究合肥地区无偿献血人群CD36抗原的缺失频率.方法 随机留取合肥市中心血站2020年3月～2020年7月血小板无偿捐献者血样973例,流式细胞术检测CD36抗原.EDTA抗凝全血离心制备富血小板血浆,进行血小板CD36抗原检测,下层细胞经红细胞裂解液处理后,进行单核细胞CD36抗原检测.结果 973例血小板无偿...     

人血小板表面CD36糖蛋白检测方法的建立及初步应用

个体血小板表面CD36抗原缺乏在随机输注时有产生抗-CD36免疫反应的风险,是血小板输注无效的原因之一。本研究应用流式细胞术检测杭州地区单采血小板供者的血小板表面CD36抗原表达情况,并分析个体血小板上CD36缺失表型的频率。留取献血者新鲜抗凝血样,经离心获取富血小板血浆,洗涤并调整血小板计数至1×106。采用CD36-FITC、CD41-PE单克隆抗体和血小板孵育反应,然后用流式细胞仪检测和分析血小板表面糖蛋白CD36抗原表达情况。对于血小板表面CD36抗原阴性的标本,进一步筛查其单核细胞表面CD36的表达情况。结果表明:192例无偿献血者筛查出7例血小板表面CD36抗原阴性,CD36缺失型频率为3.6%,均为Ⅱ型缺失。人群中个体CD36抗原表达强度存在差异,参照CD36几何平均荧光强度数值大小,59例为低表达,126例为高表达。结论:人群中存在CD36Ⅱ型缺失表型,这些数据将为研究CD36抗原分布提供参考,有助于解决血小板输注无效问题。     

血小板CD36抗原Ⅱ型缺失与内含子序列多态性的相关性

目的 研究分析血小板CD36抗原Ⅱ型缺失与内含子序列多态性的相关性。方法 随机抽取辽宁省血液中心健康血小板捐献者516名,其中241例分别进行CD36抗原检测和CD36基因序列分析;剩余275例只进行CD36基因序列分析。CD36抗原检测采用流式细胞术法,基因序列分析采用PCR-SBT法。结果 在241例标本中检测到Ⅰ型缺失1例和Ⅱ型缺失4例,频率分别为0.41%和1.66%。3例Ⅱ型缺失者编码区无突变。所有Ⅱ型缺失个体在内含子3区域具有共同的多态性特征,即同时携带(TG)11和12个串联突变,且两者位于同一等位基因。(TG)11在516例随机人群中的基因频率仅为11.72%,远低于(TG)13的30.43%。12个串联突变在516例随机人群中的基因频率为8.81%。96.7%的12个串联突变都与(TG)11同时出现,但只有72.7%的(TG)11携带12个串联突变。流式细胞术检测发现,只携带(TG)11的标本,其血小板CD36抗原表达水平与正常标本相当,而93.1%的同时携带(TG)11和12个串联突变的标本血小板CD36抗原水平明显降低。结论 内含子3区域内的(TG)11不是血小板...     

单核细胞CD36的表达在系统性红斑狼疮患者中与动脉粥样硬化斑块的关系

目的系统性红斑狼疮(SLE)是一种累及多系统、多器官的自身免疫性疾病,存在动脉粥样硬化的风险。单核细胞CD36的表达与动脉粥样硬化形成相关。因此,本研究探讨单核细胞CD36表达与SLE患者颈动脉斑块形成的关系。方法选取本院就诊的178例SLE患者,根据超声检查结果分为有动脉粥样硬化的SLE患者和无动脉粥样硬化的SLE患者。采用流式细胞术检测单核细胞CD36的表达。采用Logistic回归分析分析与患者动脉粥样硬化形成的关系,ROC曲线评价相关指标对于动脉粥样硬化斑块形成的评估价值。结果 SLE患者中,存在动脉粥样斑块和无动脉粥样斑块的SLE患者比较结果显示,两组患者病程、高血压、C反应蛋白(CRP)、总胆固醇(TC)以及CD36的平均荧光强度存在统计学差异(P<0.05)。在有动脉粥样硬化斑块形成的SLE患者中,单核细胞CD36的平均荧光强度和CRP和颈部动脉粥样硬化斑块厚度(c IMT)呈明显负相关(r=-0.378,P=0.001;r=-0.277,P=0.013)。在逐步Logistic回归分析中,病程、高血压、CRP和单核细胞CD36平均荧光强度与SLE患者动脉粥样硬化形成相关。ROC曲线分析结果显示,单核细胞CD36荧光强度对动脉粥样硬化患者评估价值的曲线下面积为0.840(95%CI:0.783~0.893;P<0.001),敏感度为83.7%,特异度为62.5%。结论本次研究证实,单核细胞CD36在伴有动脉粥样斑块的SLE患者中表达下调,且与c MIT负相关,外周血单核细胞CD36的低表达可能作为SLE患者动脉粥样硬化形成的风险因素。     

多发伤合并肺挫伤患者CD36和CD63水平及其与血管内皮损伤关系的研究

目的 探讨多发伤合并肺挫伤患者急性期和恢复期血小板CD36和CD63水平变化及其与内皮损伤的关系,并探讨其临床应用价值.方法 选择2008-06~2011-11收入我院急诊科的多发伤合并肺挫伤患者50例,包括男28例,女22例,年龄(32.3±11.5)岁.按创伤严重度评分(ISS)分为重伤组(ISS≥16分,29例)和轻伤组(ISS<16分,21例);按ARDS诊断标准,分为ARDS组(27例)和非ARDS组(23例);按预后分为生存组(36例)和死亡组(14例).同时取15例健康人作为对照组,其中男8例,女7例,年龄(33.5±10.6)岁.各组性别和年龄构成均具有可比性.患者到达急诊科后6 h内抽取外周静脉血2 mL.应用流式细胞仪检测血小板CD36和CD63双阳性率,同时采用ELISA技术检测外周静脉血血浆血管性血友病因子(vWF)的水平.结果 血小板CD36和CD63双阳性率、血浆vWF水平重伤组明显高于轻伤组(P<0.05),ARDS组明显高于非ARDS组,死亡组明显高于生存组(P<0.05).创伤后血小板CD36和CD63的水平与血管内皮损伤指标(vWF)有明显的相关性(P<0.05).结论 血小板CD36和CD63双阳性率在多发伤合并肺挫伤早期明显增高,和创伤严重程度相关,同时反映了患者肺损伤的程度,这对多发伤合并肺挫伤,特别是并发急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的诊断和预后预测具有重要的临床价值.     

CD45RO阳性的B细胞性淋巴瘤

目的 研究免疫表型异常淋巴瘤的起源。方法 从48例B细胞淋巴瘤中筛选出3例CD45RO、CD20和CD79a( )，CD3(-)的淋巴瘤。采用免疫组化、PCR和基因扫描技术对其免疫表型，免疫球蛋白重链基因重排(IgH)和T细胞受体基因重排(TCR)进行深入研究。结果 3例淋巴瘤均为结外淋巴瘤。1例为滤泡性淋巴瘤，2例为弥漫性大B细胞性淋巴瘤。PCR和基因扫描显示3例均有IgH克隆性扩增；PCR未显示TCR扩增；高敏感性基因扫描显示低峰值TCR克隆性扩增，提示可能为背景T细胞扩增。结论 CD45RO不是T细胞特异性抗原，CD45RO阳性细胞不能完全等同于T细胞，因此，在研究和临床病理诊断中应选用多种抗体配合使用。     

抗-CD36单克隆抗体对人CD34~+造血干(祖)细胞增殖和分化的影响

目的探讨抗-CD36单克隆抗体对人CD34~+造血干(祖)细胞体外增殖和分化的影响。方法选择无各种产科并发症的健康足月产妇3名,取脐带血20 mL/(人)份,以Ficoll细胞分离液(1.077 g/mL)密度梯度800 g离心30 min后,流式细胞仪分选CD34~+造血干(祖)细胞,培养2—3代,四唑盐(MTT)比色法检测抗-CD36单克隆抗体对CD34~+细胞生长的影响;流式细胞术检测细胞凋亡,Annexin V/PI双染法和碘化丙啶(PI)单染法检测细胞周期。观察抗-CD36单克隆抗体对CD34~+造血干(祖)细胞凋亡和细胞周期的影响、对造血干(祖)细胞红系分化能力以及对红系集落形成单位(CFU-E)和红系爆式集落形成单位(BFU-E)生成的影响。结果流式细胞仪分选出经Ficoll分离脐带血获得的单个核细胞中约0.44%CD34~+造血干(祖)细胞。2、8、32、64、128μg/mL抗-CD36单克隆抗体分别与CD34~+造血干(祖)细胞体外共培养:单纯CD34~+造血干(祖)细胞培养(正常)组、抗-CD36单克隆抗体2及32μg/mL组,IgG(对照)组的OD值分别为1.05±0.12 vs 0.9±0.15 vs 0.81±0.11 vs 1.06±0.18(P0.01)。Annexin V流式检测凋亡率(%):正常组、对照组与2μg/mL抗-CD36单克隆抗体组分别为10.13SymbolqB@1.42 vs 10.51SymbolqB@1.75 vs 24.57SymbolqB@2.75(P0.05)。G_1/S值:正常组、对照组与2μL/mL抗-CD36单克隆抗体组分别为3.95±0.25 vs 4.36±0.55 vs 7.35±0.65(P0.05)。CD34~+造血干(祖)细胞定向分化红系(CFU-E/BFU-E克隆形成数):正常组、对照组与抗-CD36单克隆抗体组分别为169±12、172±12和85±6(P0.05)。结论抗-CD36单克隆抗体诱导人CD34~+造血干(祖)细胞凋亡,细胞增殖减少和红系CFU-E/BFU-E克隆能力降低。     

鼠抗人血小板CD36分子单克隆抗体的制备及活性分析

本研究旨在制备具有功能活性的重组人血小板表面CD36抗原的鼠抗人单克隆抗体。提取人肝细胞总RNA,经RT-PCR扩增编码人血小板CD36抗原胞外区（Gly30-Asn439）氨基酸残基cDNA,构建于原核表达载体pMDl8并转化大肠杆菌DH5α,筛选获得阳性重组子pMD18-CD36,提取质粒。经序列测定后,将该基因插入到真核细胞瞬时表达载体pTE2上,构建成为pTE2-s-CD36-10His真核瞬时表达载体。采用lipofectamine2000转染法,将重组质粒转染至HEK293细胞,表达产物经Ni^2＋2NTA柱层析纯化。以制备的重组CD36蛋白免疫BALB／c小鼠后,取脾与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选出阳性克隆,行Western blot检测抗体结合活性。结果显示：RT-PCR扩增获得了1．4kb的片段。经测序,该序列分析结果与GenBank中的NM_001001547．2完全一致。SDS-PAGE证实转染的HEK293细胞表达了人CD36抗原胞外区蛋白片段。鼠单克隆抗体在Westernblot中可以识别重组CD36蛋白,灵敏度达到8ng。结论：成功制备了抗人血小板CD36单克隆抗体,为临床筛选CD36阴性患者及献血员、深入研究人血小板CD36表面抗原对血小板输注无效的影响提供了实验基础。     

CD36多克隆抗体在M1和M2型巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白应答中的作用

目的探索大鼠CD36多克隆抗体在M1和M2型巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)应答中对巨噬细胞细胞因子分泌及表面标记物表达的影响。方法分离30只正常喂养的大鼠外周血单核细胞,体外用巨噬细胞集落刺激因子将单核细胞诱导为初始巨噬细胞,再用脂多糖联合γ-干扰素将巨噬细胞分化为M1型巨噬细胞,用白细胞介素(IL)-4诱导巨噬细胞为M2型巨噬细胞。M1和M2型巨噬细胞均给予ox-LDL刺激、先CD36抗体后ox-LDL刺激,用免疫荧光法对M1型巨噬细胞表面的CD86分子、M2型巨噬细胞表面的CD163分子进行检测,用Image-Pro Plus6.0图像分析软件对平均荧光密度进行分析;ELISA法检测两亚型巨噬细胞不同干预后培养液中TNF-α、IL-6、IL-10的浓度。两组间独立样本比较用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果 (1)CD36抗体阻断的M1和M2型巨噬细胞IL-10产生多于ox-LDL刺激的M1型和M2巨噬细胞,差异有统计学意义(均P<0.001)。(2)CD36被阻断后的M1型巨噬细胞TNF-α、IL-6产生及CD86表达低于ox-LDL刺激的M1型巨噬细胞,差异有统计学意义(均P<0.05)。(3)CD36被阻断后的M2型巨噬细胞TNF-α、IL-6产生低于ox-LDL刺激的M2型巨噬细胞,CD36阻断后的M2型巨噬细胞CD163表达高于ox-LDL刺激的M2型巨噬细胞,差异有统计学意义(均P<0.001)。结论 CD36多克隆抗体抑制ox-LDL对M1和M2型巨噬细胞产生促炎效应,M1和M2型巨噬细胞CD36被抗体阻断后增加了两亚型巨噬细胞IL-10产生。     

冠心病患者单核细胞CD36表达水平与冠状动脉病变程度的关系

目的探讨冠心病患者外周血单核细胞CD36表达水平与冠状动脉病变严重程度的关系。方法对46例可疑冠心病患者行冠状动脉造影检查,流式细胞仪检测其外周血单核细胞CD36表达水平,根据冠状动脉造影结果及冠状动脉病变的Gensini′s评分将患者进行分组,比较各组CD36水平的差异;用多重线性回归筛选冠状动脉病变严重程度的影响因素。结果冠心病患者外周血单核细胞CD36的阳性率,明显高于正常对照组[（75.8±8.1）%vs.（42.0±2.2）%,P〈0.01];CD36的阳性率随着Gensini′s评分的升高而升高（P〈0.01）;多重线性回归显示CD36和HDL-C是冠状动脉病变严重程度的独立影响因素（P〈0.01）。结论冠心病患者外周血单核细胞CD36表达水平升高,CD36水平能够在一定程度上反映冠状动脉病变的严重程度。     

雄激素受体基因第一外显子区CAG缺失的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的：构建雄激素受体基因第一外显子区CAG重复序列缺失的突变重组体，观察CAG重复序列的有，无对雄激素受体转录及表达的调控作用。方法：实验于2006—05／2007—05在解放军总医院老年医学研究所完成。按照重叠延伸反应的原理扩增CAG重复序列两端的基因片段，再将两片段混合，在加入一个引物的情况下进行8个PCR循环以有效完成重叠延伸，然后再加入另一引物进行22个循环，完成目的片段指数扩增，将目的片段克隆至真核表达载体PAR-IRES2-EGFP，转染HEK293细胞，采用Western blot法检测HEK293细胞雄激素受体蛋白。结果：构建的CAG重复序列缺失的突变重组体经酶切鉴定和DNA测序证实构建正确，转染真核细胞可检测到雄激素受体基因的表达。结论：重叠延伸PCR是进行体外基因拼接、体外缺失突变的简单、快速的基因重组技术；雄激素受体基因第一外显子区CAG重复序列缺失的突变重组体的成功构建可为今后的相关研究提供实验基础。