脐带间质干细胞来源的外切体对顺铂诱导的人肾小管上皮细胞损伤的修复作用

［摘要］目的: 研究人脐带间质干细胞来源的外切体（hucMSC-Ex）对顺铂诱导的人肾小管上皮HK-2细胞损伤的修复作用,并探讨可能的作用机制。方法: 体外建立顺铂诱导的HK-2细胞损伤模型,实验组以16 μmol/L浓度的顺铂作用HK-2细胞16 h,再加入hucMSC-Ex共培养,同时选择人肺成纤维细胞的外切体（HFL1 Ex）为对照,8 h后采用蛋白质印迹法和FITC-Tunel技术检测hucMSC-Ex对损伤HK-2细胞的抗凋亡和促增殖情况。未经任何处理的HK-2细胞作为正常对照组,单纯顺铂损伤并加等量PBS为PBS对照组。结果： 成功建立了顺铂诱导的HK-2细胞损伤体外模型, 蛋白质印迹分析显示hucMSC-Ex处理改善了顺铂对HK 2细胞的损伤,凋亡蛋白Bax表达降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表达相应升高。FITC-Tunel检测也显示HK-2细胞的凋亡明显减弱。而MTT分析显示hucMSC Ex处理后,HK 2细胞的增殖能力显著增强。结论：HucMSC-Ex对顺铂诱导的HK-2细胞损伤有一定的修复效果,可能是通过促进HK 2细胞的增殖和抑制其凋亡来实现的。     

硫化氢对顺铂诱导近端肾小管上皮细胞凋亡的干预研究

目的 探讨硫化氢H2S 对顺铂（DDP）诱导近端肾小管上皮细胞凋亡的干预作用。方法 研究分为阴性对照组、DDP 组、DDP+ 硫氢化钠NaHS 组。DDP 组：DDP 浓度为0、1、2、5、10、20 和40 mg/L ;DDP+NaHS 组：NaHS 浓度分别为0、0.2、0.4、0.5、0.8、1.0 和2.0 mmol/L,加DDP（20 mg/L）共同作用。噻唑蓝（MTT）实验：DDP 组、DDP+NaHS 组与人近端肾小管上皮细胞株（HK-2 细胞）共同培养,24 h 后测光密度（OD）值。NaHS（0.5 和1.0 mmol/L）加DDP（20 mg/L）与HK-2 细胞共同培养24 h。4,6- 联脒-2- 苯基吲哚（DAPI）,Annexin V-FITC/PI 染色通过显微镜观察各组细胞的形态学改变。Annexin V-FITC/PI 流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果 MTT 实验：0、1、2、5、10 和20 mg/L DDP 浓度的OD 值分别为（0.270±0.064）、（0.229±0.022）、（0.198±0.024）、（0.189±0.069）、（0.188±0.030） 和（0.165±0.012）,OD 值随DDP 浓度上升逐渐下降, 在20 mg/L 低于阴性对照组（P <0.05）。20 mg/L DDP 加浓度分别为0.2、0.4、0.5、0.8 和1.0 mmol/L NaHS的OD 值分别为（0.173±0.051）、（0.186±0.023）、（0.259±0.050）、（0.263±0.033） 和（0.268±0.098）, 以上与浓度为20 mg/L DDP 的OD 值（0.153±0.017）比较,差异有统计学意义（P <0.05）。DAPI、Annexin VFITC/PI 染色荧光显微镜显示,对照组HK-2 细胞平均凋亡细胞数为（4.230±1.015）,20 mg/L DDP 影响下为（35.020±6.079）,两者差异有统计学意义（P <0.05）,DDP 组高于阴性对照组。DDP+NaHS 组在0.5 和1.0 mmol/L 的平均凋亡细胞分别为（22.550±2.912） 和（9.780±2.063）,差异有统计学意义（P <0.05）,DDP+NaHS 组低于DDP 组。Annexin V-FITC/PI 流式细胞术检测,阴性对照组HK-2 细胞凋亡率（5.167±0.612）%,在20 mg/L DDP 影响下,为（31.598±1.014）%,细胞凋亡率增加（P <0.05）。合用NaHS 凋亡减少,在0.5 和1.0 mmol/L 的凋亡率为（18.375±2.239）% 和（11.636±1.233）%,差异有统计学意义（P <0.05）,DDP+NaHS 组低于DDP 组。结论 NaHS 对DDP 导致的近端肾小管上皮细胞的凋亡有保护作用。     

大鼠骨髓间质干细胞来源的外切体抑制顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡

目的:观察大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)来源的外切体(exosome)对顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法:原代培养大鼠骨髓MSC并提取外切体鉴定。构建顺铂损伤NRK-52E细胞模型,损伤组为5μmol/L顺铂处理6 h后正常营养液培养48 h,处理组为顺铂损伤后以100μg/m L外切体共培养48 h。未经任何处理的NRK-52E细胞为对照组。TUNEL-FITC,凋亡双染流式细胞术,蛋白质免疫印迹技术检测各组细胞凋亡情况。结果:与对照组比较,损伤组NRK-52E细胞肿大,胞核不规则样改变,凋亡细胞增多,凋亡相关蛋白Bax上调而Bcl-2下调;处理组NRK-52E细胞肿大较损伤组缓解,胞核形态改善,凋亡细胞减少,Bax下调且Bcl-2上调。结论:大鼠骨髓MSC来源的外切体对顺铂诱导的NRK-52E细胞凋亡有一定的抑制作用。     

谷胱甘肽对顺铂所致肾小管上皮细胞毒性的保护作用

目的 探讨谷胱甘肽（GSH）对顺铂所致不同性别大鼠肾小管上皮细胞毒性的影响。方法 从不同性别的大鼠分离的肾小管上皮细胞接种于96孔培养液，培养24h后加入一系列浓度的顺铂，或在加入顺铂前的16和4h，分别加入GSH合成抑制剂BSO和GSH合成前体物半胱氨酸，再培养24h后用MTT方法检测细胞存活率。结果：顺铂对雌雄大鼠肾小管上皮细胞具有形状相似的剂量－反应关系曲线，半数抑制浓度（IC50）分别为0.178mmol/L和0.182mmol/L；BSO能使2组IC50均2降低为0.001mmol/L，可使剂量－反应曲线左移，而半胱氨酸则可使2组IC50均升高，均大于5mmol/L，使剂量－反应曲线下沉。结论 顺铂对雌雄大鼠肾小管上皮细胞同样具有明显的毒性；BSO和半胱氨酸可分别增强和降低顺铂的毒性，间接证明细胞内GSH对顺铂所致大鼠肾小管上皮细胞毒性有保护作用，且与性别无前。     

促红素新型环性衍生肽 对顺铂诱导肾小管上皮细胞损伤的保护作用

目的：探讨促红素新型环性衍生肽（cyclic helix B peptide,CHBP）对顺铂诱导肾小管上皮细胞（NRK-52E）损伤的保护作用及可能机制。方法：体外培养NRK-52E细胞,分为（1）对照组：NRK-52E细胞（4×105个）单独培养;（2）顺铂组：10 μmol/L顺铂处理NRK-52E细胞;（3）CHBP干预组：顺铂处理NRK-52E细胞加入不同浓度CHBP干预,低浓度亚组为16 nmol/L CHBP,中浓度亚组为32 nmol/L CHBP,高浓度亚组为64 nmol/L CHBP。每个亚组分别干预12 h、24 h。采用流式细胞术及Annexin V-FITC-PI法检测NRK-52E细胞凋亡率。结果：顺铂组处理24 h凋亡率较12 h增高,差异具有统计学意义（P＜0.05）;在处理12 h和24 h两个时间点,顺铂组凋亡率高于对照组,差异均具有统计学意义（P＜0.05）;在处理12 h后,低浓度亚组凋亡率与顺铂组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）,中、高浓度亚组的凋亡率低于顺铂组,差异均具有统计学意义（P＜0.05）;在处理24 h时间点,各干预组凋亡率低于顺铂组,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论：CHBP对顺铂诱导NRK-52E细胞损伤具有保护作用。     

甘草查尔酮A制备方法及药理作用研究进展

该文概述了甘草查尔酮A的不同制备方法,包括柱色谱法、制备色谱法、高速逆流法和生物合成法,以及国内外对甘草查尔酮A在抗炎、抗癌、抗肿瘤、抑菌、体内代谢和抗疟抗寄生虫等药理方向的研究进展。     

马兜铃酸对人肾小管上皮细胞损伤的体外实验研究

目的 研究马兜铃酸(aristoloehie acid,AA)对人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞)的损伤及可能机制.方法 将细胞分为4组:正常对照组与AA30、60、120 μmol/L组(n=6),分别作用于HK-2细胞培养48 h后,倒置相差显微镜观察细胞形态,CCK8试剂盒(Cell Counting Kit-8)检测增殖,流式细胞仪检测凋亡,Western blot分析激活型Caspase-3的表达,全自动生化检测仪测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)和B-N-乙酰氨基匍萄糖苷酶(NAG酶)的含量,激光共聚焦扫描荧光显微镜(Laser scanning eonfocal microscope,LSCM)观察α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle aetin,α-SMA)和E-钙黏连蛋白(E-cadherin)的表达,ELISA测定上清液中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和Ⅲ型胶原的分泌.结果 HK-2分别在30、60、120 μmoi/L AA作用48 h后,出现增殖抑制,凋亡增加,激活型Caspase-3表达增多,LDH和NAG酶升高,均旱剂量依赖性.60μmol/1.浓度的AA还表现E-cadherin表达减弱,α-SMA表达增强,TGF-β1和Ⅲ型胶原分泌明显增加(P<0.05).结论 AA可引起HK-2细胞明显的增殖抑制、凋亡和上皮-间允质转分化呈一定的浓度依赖性.     

游离脂肪酸对人近曲肾小管上皮细胞HK-2的影响及作用机制

目的探讨游离脂肪酸（Free Fatty Acids,FFAs）对人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）的影响及作用机制。方法用含有不同浓度（0、125、250、500μmol／L）软脂酸的DMEM—F12培养人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）在0h、24h、48h三个时段：MTT法检测不同环境下FFAs对HK-2细胞增殖的影响,流式细胞术检测FFAs对细胞凋亡的影响,免疫细胞化学法检测处理前后HK-2细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及凋亡相关蛋白caspase8蛋白表达的变化。结果FFAs呈剂量和时间依赖性抑制HK-2细胞的增殖（P〈0．05）,并可诱导细胞凋亡（P〈0．05）。经FFAs作用后,iNOS及Caspase8的表达增加。结论游离脂肪酸有抑制HK-2细胞增殖,促进其凋亡的作用,FFAs可能通过激活肾小管上皮细胞内的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）,加剧肾小管上皮细胞的凋亡,而caspase8参与了其发生和发展的过程。     

甘草查尔酮B对人非小细胞肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨甘草查尔酮B(LCB)对于人非小细胞肺癌A549细胞增殖、周期及凋亡的影响。方法：采用CCK-8法和平板克隆形成法检测LCB对A549细胞的增殖抑制作用;采用流式细胞技术检测对细胞周期、凋亡的影响;采用Western blotting法检测线粒体凋亡蛋白表达。结果：LCB可显著抑制A549细胞的增殖。LCB经处理后将A549细胞阻滞在G0/G1期（P<0.05）,同时细胞凋亡率也明显增加（P<0.05）。Bax/Bcl-2比值及Caspase-3蛋白表达明显上升（P<0.05）。结论：LCB可通过阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡,从而抑制非小细胞肺癌A549的增殖。     

iPLA2β通过调控铁死亡减轻高糖诱导的人肾小管上皮细胞损伤

目的 探讨钙离子非依赖型磷酸酯酶A2β(iPLA2β)在高糖诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)中的表达,iPLA2β与铁死亡的关系以及iPLA2β对高糖诱导的HK-2细胞损伤的保护机制。方法 用30 mmol/L葡萄糖刺激HK-2细胞,iPLA2β质粒转染构建过表达模型,铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)和铁死亡激活剂erastin作为铁死亡对照组。干预36 h后,试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、铁含量,DCF免疫荧光检测细胞内活性氧(ROS)水平。Western blot法检测铁死亡指标ACSL4、GPX4、LPCAT3、TFR1的表达。结果 高糖刺激可以降低HK-2细胞内iPLA2β的表达,HK-2细胞内ROS、MDA水平升高,GSH、SOD水平降低。Western blot结果显示ACSL4、LPCAT3、TFR1表达增高,GPX4表达降低。Fer-1干预后上述指标改善。过表达iPLA2β后,可降低KIM-1表达,减轻HK-2细胞损伤。进一步研究发现,过表达iPLA2β后可抑制高糖诱导的HK-2细胞的氧化应激和铁死亡。另外,era...     

马兜铃酸对体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞的损伤作用

目的:观察马兜铃酸(aristolochic acid,AA)对体外培养的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)的损伤作用。方法:体外培养NRK-52E,分别以不同浓度的AA-Na刺激细胞,每组设6个复孔,孵育24 h。透射电镜观察NRK-52E细胞的超微结构,MTT法检测不同浓度AA对NRK-52E细胞增殖的影响,流式细胞仪检测NRK-52E细胞的凋亡,免疫细胞化学法检测AA对NRK-52E细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响;检测不同时间段(12、24、48 h)马兜铃酸对NRK-52E细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)及内皮素-1(ET-1)mRNA和Ⅰ型胶原(ColⅠ)表达的影响。结果:①AA浓度低于10μg/ml时对NRK-52E的增殖无明显影响,20~40μg/ml浓度的AA可明显抑制NRK-52E细胞的增殖;②较高浓度的AA(40μg/ml)可明显刺激细胞凋亡;③AA5、10、20、40μg/ml均可刺激NRK-52E表达α-SMA,其中AA10μg/ml对α-SMA表达较强;④AA刺激NRK-52E细胞24 h后TGF-β1mRNA、ET-1 mRNA表达最多,48 h时表达水平下降,而COL-I的表达水平随时间的延长而上调,呈时间依赖性。结论:AA可直接损伤肾小管上皮细胞,促进其表达肌成纤维细胞标志蛋白α-SMA,即有促转分化作用,且其对NRK-52E细胞的损伤作用呈剂量及时间依赖性。     

氧化应激在碘海醇诱导人肾小管上皮细胞凋亡中的作用

目的观察碘海醇诱导的人肾小管上皮细胞（HK-2）凋亡及氧化应激所起的作用。方法将体外培养的HK-2细胞分为4组：①对照组;②碘海醇组（100mgI/ml）;③N-乙酰半胱氨酸（NAC 10mmol/L）组;④共作用组：NAC10mmol/L预处理1h＋碘海醇100mgI/ml。各组以相应药物孵育6h。采用细胞增殖/毒性检测法（CCK-8）测定细胞存活率,核染色、流式Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,DCFH-DA荧光结合流式细胞法检测细胞内活性氧（ROS）的产生,IF、Western blot检测相关信号转导途径。结果碘海醇降低HK-2细胞存活率至（63±5%）（P〈0.01）,细胞凋亡率升至24.41%（对照组0.9%,P〈0.05）,细胞内活性氧升高至对照组的1.3倍（P〈0.05）。NAC预处理与碘海醇共作用后,HK-2细胞存活率比碘海醇组明显增高（118%vs.63%,P〈0.05）,凋亡率比碘海醇组明显降低（13.46%vs.24.41%,P〈0.05）,活性氧降为对照组的0.93倍,比碘海醇组（1.3倍）明显降低（P〈0.05）。碘海醇作用于HK-2细胞,引起p53磷酸化,上调凋亡相关蛋白（Bax）,下调Bcl-2的表达,促进线粒体内细胞色素C（CytC）释放到胞质,进而引起Caspase-3活化,导致细胞凋亡。NAC降低细胞内活性氧浓度,下调Bax、上调Bcl-2、减少Caspase-3活化,从而减轻细胞损伤。结论碘海醇引起的氧化应激在其诱导的HK-2细胞凋亡中起重要作用。     

自噬在低氧诱导人肾小管上皮细胞凋亡中的作用

目的：探讨自噬在低氧诱导人肾小管上皮细胞株（HK-2）凋亡中的作用。方法：培养HK-2细胞,根据培养环境氧浓度不同分为对照组（21%O2）和低氧组（1%O2）;根据低氧培养时间不同,低氧处理细胞进一步分为：低氧6 h亚组、低氧12 h亚组、低氧18 h亚组和低氧24 h亚组。Western blot检测HK-2细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和凋亡相关蛋白活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cleaved-caspase3）表达水平,流式细胞仪检测HK-2细胞凋亡情况;采用低氧诱导稳定表达GFP-LC3的HK-2细胞18 h,在荧光显微镜下观察GFP-LC3自噬小体的变化;进一步采用低氧联合自噬诱导剂雷帕霉素（ra－pamycin,RP）或自噬抑制剂巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1,BAfA1）处理HK-2细胞,细胞分为常氧对照组、常氧+雷帕霉素/或巴弗洛霉素组、低氧对照组、低氧+雷帕霉素/或巴弗洛霉素组。Western blot检测Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和cleaved-caspase3表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：与对照组（0.161±0.043）相比较,低氧12 h[（0.315±0.060）,P=0.019]、18 h[（0.586±0.063）,P=0.000]、24 h[（0.698±0.085）,P=0.000]亚组HK-2细胞cleaved-caspase3蛋白表达明显增多;低氧12 h、18 h、24 h亚组HK-2细胞凋亡率分别为（23.633±5.346）%、（25.200±4.782）%、（38.567±8.046）%,较对照组（11.800±3.966）%明显增多（P=0.036,P=0.021,P=0.000）。同时,低氧18 h、24 h亚组HK-2细胞表达Beclin1蛋白[（0.557±0.071）,（0.897±0.074）[较对照组（0.249±0.040）明显上调（P=0.001,P=0.000）;低氧6 h、12 h、18 h、24 h亚组细胞表达LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白[（1.795±0.143）,（2.873±0.078）,（3.029±0.089）,（3.735±0.059）]较对照组（1.322±0.191）明显上调（P=0.036,P=0.000,P=0.000,P=0.000）;细胞表达自噬底物P62蛋白[（0.776±0.061）,（0.602±0.119）,（0.419±0.117）,（0.384±0.068）]较对照组（0.957±0.035）明显下调（P=0.028,P=0.001,P=0.000,P=0.000）;低氧组细胞GFP-LC3斑点计数相对值为（40.667±6.028）,较对照组（18.667±5.508）明显增加（P=0.010）。雷帕霉素增加自噬后,低氧诱导的HK-2细胞凋亡（26.433±3.402）及cleaved-caspase3蛋白表达（0.265±0.066）较低氧对照组[（36.133±5.856）,（0.358±0.060）]明显减少（P=0.012,P=0.000）;巴弗洛霉素A1抑制自噬后,低氧诱导的HK-2细胞凋亡增多（49.233±3.412）及cleaved-caspase3蛋白表达（1.242±0.110）较低氧对照组[（25.933±3.650）,（0.659 ± 0.060）]明显增加（P=0.000,P=0.000）。结论：自噬在低氧诱导的HK-2细胞凋亡中起保护作用。     

糖尿病早期大鼠肾小管上皮细胞凋亡与增殖的观察

为了解糖尿病早期肾小管上皮细胞（ｒｅｎａｌｔｕｂｕｌａｒｅｐｉｔｈｌｉａｌｃｅｌｌｓ， 简称ＲＴＥＣｓ） 是否有损害，探讨微蛋白尿发生的机制。方法：四氧嘧啶（ａｌｌｏｘａｎ）尾静脉注射（５０ ｍｇ／ｋｇ）雄性Ｗｉｓｔａｒ 大鼠６０ 只，石蜡包埋肾切片经ＴＵＮＥＬ法和ＰＣＮＡ、ＢｒｄＵ免疫组化染色。结果：成模后２０～６０ ｄ 和９０～１４０ ｄ，ＴＵＮＥＬ法阳性ＲＴＥＣｓ 主要出现在远端小管、髓质肾小管、集合管。ＰＣＮＡ、ＢｒｄＵ 免疫组化染色阳性ＲＴＥＣｓ 主要见于注射后４０ ｄ、１３０ ～１４０ ｄ 皮质和髓质肾小管、集合管，其出现的部位、数量与凋亡基本一致。结论：本研究结果表明，高糖对ＲＴＥＣｓ 是一种亚坏死性损伤剂，导致其凋亡发生率增加，同时可能影响肾小管重吸收和分泌功能。ＲＴＥＣｓ 增殖发生略晚，但与凋亡发生率相匹配。笔者推测借此种机制糖尿病早期ＲＴＥＣｓ 的数目和肾小管的形态得以保护，造成一般组织学方法不能将ＲＴＥＣｓ 的损伤检测出来。     

草酸对大鼠肾小管上皮细胞脂质过氧化损伤的实验研究

目的通过研究草酸对体外培养的Wistar大鼠肾小管上皮细胞造成的脂质过氧化损伤及柠檬酸的保护作用,以探讨尿路结石的形成机制.方法分离、培养正常雄性Wistar大鼠的肾小管上皮细胞,在原代培养第5天时,将细胞分成3组(空白对照组、草酸组及柠檬酸组),分别加入正常培养液、含有草酸(5 mM)的培养液及含有草酸(5 mM)和柠檬酸(3 mg/mL)的培养液,分别于2 h后测定各组细胞培养基中丙二醛的及乳酸脱氢酶含量.结果①草酸组和柠檬酸组细胞培养基中乳酸脱氢酶含量均明显升高,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);②与柠檬酸组相比,草酸组细胞细胞培养基中乳酸脱氢酶含量更高,两者之间比较差异有统计学意义(P＜0.05);③草酸组和柠檬酸组细胞培养基中丙二醛的含量均明显增高,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);④与柠檬酸组相比,草酸组细培养基中丙二醛的含量更高,两者之间比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论草酸对体外培养的Wistar大鼠肾小管上皮细胞可以造成脂质过氧化损伤,而外源性柠檬酸能够减轻草酸对体外培养的Wistar大鼠肾小管上皮细胞造成的脂质过氧化损伤作用.     

牛磺酸和茵陈素对顺铂引起的原代培养肾小管上皮细胞内游离Ca2+浓度变化的影响

目的：研究牛碘酸，茵陈素对顺铂引起的原代培养肾小管上皮细胞（PTC）内游离Ca^2 浓度变化的影响，方法：在体外培养PTC，顺铂与PTC共同保温24h，牛磺酸，茵陈素分别提前与PTC作用24h，然后再加入顺铂（26umol.L^-1)，共同保温24h，采用Fura/-2/AM测细胞内游离Ca^2 浓度，结果：顺铂（13，26，52umol.L^-1)升高PTC细胞内游离Ca^2 浓度，牛碘酸（1，10g.L^-1)和茵陈素（4，8mg.L^-1)，可拮抗顺铂导致的PT细胞内游离Ca^2 浓度超载，结论：顺铂可引起原代培养肾小管上皮细胞内Ca^2 超载，牛磺酸，茵陈素能拮抗顺铂导致的细胞内C ^2 超载，起到细胞保护作用。