TWEAK蛋白对肝癌细胞增殖的影响

目的 观察TWEAK蛋白对肝癌细胞系增殖的影响,探讨TWEAK对肝癌细胞增殖的作用.方法构建PAVU6-TWEAK siRNA干涉质粒,转染HepG2和QGY7703肝癌细胞株,MTT法检测抑制TWEAK蛋白表达对肝癌细胞增殖的影响,并于培养体系中加入TWEAK蛋白,检测肝癌细胞增殖活性.结果成功构建PAVU6-TWEAK siRNA干涉质粒,转化肝癌细胞后肝癌细胞增殖受抑.肝癌培养体系中加入TWEAK蛋白后,肝癌细胞增殖活性有所增强.结论 TWEAK蛋白可促进肝癌细胞的增殖活性,抑制TWEAK表达,一定程度上可抑制肝癌细胞增殖.     

C-Jun蛋白对糖皮质激素受体表达及转录激活能力的影响

目的观察促进与抑制c-Jun蛋白表达对糖皮质激素受体(GR)表达和转录激活能力的影响，探索c-Jun与GR功能的相互关系。方法采用基因重组技术，构建PAVU6-c Jun siRNA干涉质粒，电穿孔法分别转染U937细胞c-Jun蛋白表达真核载体与：PAVU6-c Jun siRNA干涉质粒，观察c-Jun表达对GR表达和转录激活能力的影响。结果成功构建PAVU6-c Jun siRNA干涉质粒，转化U937细胞后GR的表达和转录激活活性有增强，而转染c-Jun表达载体pCMV-c JunGR的表达和转录激活活性有所减弱。结论c-Jun蛋白表达水平对GR的表达和转录激活活性有影响，抑制c-Jun蛋白表达，一定程度上可促进GR表达并增强其转录激活功能。     

C-Jun蛋白对糖皮质激素受体表达及转录激活能力的影响

目的观察促进与抑制c-Jun蛋白表达对糖皮质激素受体(GR)表达和转录激活能力的影响,探索c-Jun与GR功能的相互关系.方法采用基因重组技术,构建PAVU6-c Jun siRNA干涉质粒,电穿孔法分别转染U937细胞c-Jun蛋白表达真核载体与PAVU6-c Jun siRNA干涉质粒,观察c-Jun表达对GR表达和转录激活能力的影响.结果成功构建PAVU6-c JunsiRNA干涉质粒,转化U937细胞后GR的表达和转录激活活性有增强,而转染c-Jun表达载体pCMV-c JunGR的表达和转录激活活性有所减弱.结论c-Jun蛋白表达水平对GR的表达和转录激活活性有影响,抑制c-Jun蛋白表达,一定程度上可促进GR表达并增强其转录激活功能.     

RNA干扰EP—CAM基因表达对胆囊癌细胞增殖及凋亡的影响

目的：利用RNA干扰技术抑制人胆囊癌GBC-SD细胞中上皮细胞黏附分子（EP-CAM）基因的表达,探讨抑制EP-CAM基因后对GBC-SD细胞增殖、凋亡的影响.方法：构建靶向EP-CAM基因的miRNA重组质粒,转染GBC-SD细胞,用RT-PCR和Western Blot分别检测EP-CAM基因的mRNA及蛋白的表达情况,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化.结果：靶向EP-CAM的miRNA重组质粒pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1构建成功,重组质粒能显著抑制靶基因EP-CAM的mRNA及蛋白表达.与对照组比较,干扰后的细胞凋亡率无明显变化（P＞0.05）,但细胞增殖活性受到明显抑制（P＜0.05）.结论：靶向EP-CAM基因的miRNA重组质粒能有效抑制EP-CAM基因的表达,抑制GBC-SD细胞的增殖.     

针对AKT2的小分子干扰RNA抑制胶质瘤细胞的增殖

目的比较靶向性丝/苏氨酸激酶2(AKT2)不同的小分子干扰RNA构建体对脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用.方法选择大鼠AKT2的3个siRNA靶序列构建靶向AKT2的siRNA表达质粒,进行对C6细胞的AKT2表达及增殖抑制的研究,蛋白印迹检测AKT2的表达水平,TUNEL法分析细胞凋亡,流式细胞术分析细胞周期变化,3H-TdR掺入法分析细胞增殖.结果转染siRNA表达质粒组AKT2表达下调72%、88%和91%.各转染组的凋亡率明显增加(x2=34.218,P＜0.001),转染后S期指数较对照细胞明显减少,转染组细胞自第2天起存活率均明显下降(P＜0.01),且各个转染组之间存活率也有极显著性差异(P＜0.01),以尾部调节结构域转染组最显著.结论靶向AKT2的siRNA表达质粒可以特异性地抑制AKT2的表达,显著抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡.     

靶向XBP1S的RNA干扰质粒对细胞增殖的影响

目的 构建靶向人XBP1S的siRNA真核表达载体(pSUPER-XBP1S)并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.方法 设计并合成针对XBP1S基因的siRNA,退火成互补双链后克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒,并将其转染入HeLa细胞和HepG2细胞中.采用RT-PCR检测转染前后XBP1S在HeLa细胞和HepG2细胞中的转录,Western印迹检测转染前后XBP1S蛋白的表达;MTT法、细胞计数检测重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.结果 重组质粒能有效地抑制HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S基因的转录和表达;转染HeLa细胞和HepG2细胞后,细胞增殖抑制率及细胞增殖数与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了靶向人XBP1S的siRNA表达载体pSUPER-XBP1S,并且有效的抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S的转录和表达,有效抑制了细胞的增殖能力.     

卵巢癌细胞系C-JUN激活蛋白-1与P27kip1表达的相关性

目的 探讨c-Jun激活区结合蛋白-1（Jab1）与p27kip1在卵巢癌细胞株HO-8910中的表达变化及相互关系。 方法 用血清饥饿及饥饿后释放处理HO-8910细胞,分别用Western blot及核浆分离技术检测Jab1 、p27kip1表达及亚细胞定位;用免疫沉淀方法检测Jab1与p27kip1的结合情况;脂质体介导法将Jab1基因转染HO-8910细胞,Western blot及核浆分离检测p27kip1表达。结果 血清饥饿导致HO-8910细胞生长周期停滞,p27kip1蛋白总量增加,且主要集中于胞核分布;Jab1蛋白总量减少,主要表达于核浆;血清释放后两者呈现相反的表达变化,但是p27kip1主要集中在胞质分布;p27kip1与Jab1在HO-8910细胞中存在相互结合的情况。脂质体转染Jab1后,p27kip1表达下降且定位有明显的胞质改变。结论 Jab1可能通过与p27kip1结合来介导p27kip1出核并影响其表达,从而参与调控HO-8910细胞的生长。     

Ad-siRNA-FoxO1腺病毒载体的构建及对人肝癌细胞系增殖的影响

目的 利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制肝癌细胞系中FoxO1基因的表达,观察其受抑制后对细胞增殖能力的影响.方法 设计针对FoxO1基因的siRNA,构建于腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染包装细胞293细胞,获得含Ad-siRNA-FoxO1的重组腺病毒.体外感染人肝癌细胞系HepG2,Western印迹检测Ad-siRNA-FoxO1对FoxO1蛋白的抑制效率.与PEPCK.luc共转染HepG2细胞,检测FoxO1表达水平对PEPCK启动子活性的影响,并观察FoxO1表达水平的改变对肝癌细胞系增殖的影响.结果 成功构建3个针对FoxO1的siR-NA重组腺病毒载体,重组腺病毒均能显著抑制HepG2细胞中FoxO1蛋白的表达,并抑制PEPCK启动子的活性和显著促进细胞增殖.结论 肝癌细胞系中FoxO1参与了细胞增殖的调节.     

靶向PCNA基因的小干扰RNA对鼻咽癌CNE2细胞周期的影响

目的： 研究小干扰RNA抑制PCNA基因表达后对鼻咽癌CNE2细胞株增殖及细胞周期的影响。方法: 利用体外合成法合成针对PCNA基因的小干扰RNA(siRNA)序列,应用脂质体转染鼻咽癌CNE-2细胞,实时定量PCR(real-time PCR) 和免疫组织化学法观察siRNA干扰后细胞中PCNA mRNA水平和PCNA蛋白表达,倒置相差显微镜观察转染前后CNE2细胞的生长变化,流式细胞仪检测siRNA干扰后的细胞周期。结果: 在siRNA转染CNE2细胞后,细胞增殖受到抑制,蛋白表达不同程度降低,对PCNA mRNA水平的抑制达98.5%,细胞周期在G0/G1停滞。结论: siRNA可在鼻咽癌中有效发挥RNA干扰效应,抑制PCNA mRNA及蛋白表达,降低PCNA活性,抑制鼻咽癌细胞增殖,为鼻咽癌基因治疗提供了新的方法。     

RNA干扰MAD2基因对细胞增殖的影响

目的:探讨MAD2对HepG2细胞周期的影响。方法:构建针对MAD2基因的shRNA表达载体,MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒pmad2-EGFP共转染HepG2细胞株,用Western印迹法检测shRNA的抑制效应;用MTT法测定细胞增殖率;用流式细胞仪检测细胞周期。结果:shRNA的重组质粒表达载体能明显抑制MAD2绿色荧光融合蛋白的表达。HepG2细胞转染有效干扰质粒48h后,细胞增殖抑制率达65%。有效干扰质粒引起G0/G1期和S期细胞的明显降低,G2/M期细胞增多。结论:在细胞水平,可通过RNA干扰特异性抑制MAD2基因来抑制细胞的增殖,为研究MAD2基因在细胞增殖中的作用机制奠定基础。     

小干扰RNA沉默hPTTG1基因对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

目的: 利用RNA干扰技术沉默人垂体瘤转化基因1( hPTTG1 )表达,观察卵巢癌细胞增殖能力和细胞凋亡的改变并探讨分子机制。方法: 化学合成靶定 hPTTG1 的小干扰RNA(siRNA)转染体外培养的A2780细胞,RT-PCR和Western blotting检测 hPTTG1 及c-myc表达水平;MTT法和 -TdR掺入实验检测 hPTTG1 对细胞增殖的影响;annexin V/PI染色流式细胞术和TUNEL法测定各组细胞凋亡情况。结果: hPTTG1 siRNA转染组 hPTTG1 mRNA和蛋白表达下降,抑制率分别为70.5%±3.9%和63.8%±4.5%;转染 hPTTG1 siRNA 24 h细胞吸光度值开始下降,48 h抑制效果最明显,抑制率为42.9%±5.2%;转染 hPTTG1 siRNA后细胞 -TdR放射性计数明显低于空白组和阴性对照组; hPTTG1 siRNA干扰组细胞存活率下降,细胞凋亡率和坏死率均增加;TUNEL染色分析结果可见 hPTTG1 siRNA干扰组凋亡指数明显高于空白组和阴性对照组; hPTTG1 干扰后c-myc mRNA和蛋白表达均下调。结论: hPTTG1 siRNA通过下调c-myc表达抑制A2780细胞增殖,诱导细胞凋亡, hPTTG1 可作为卵巢癌基因治疗的候选靶点。     

沉默NANOG表达对人肝癌细胞HepG2中cyclin D1表达及细胞增殖的影响

 目的:探讨RNA干扰沉默NANOG表达后对肝癌细胞HepG2中细胞周期素D1(cyclin D1)表达及细胞增殖的影响。方法:将以NANOG基因为靶点的NANOG-siRNA瞬时转染肝癌细胞HepG2,real-time PCR和Western boltting检测NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白的表达,CCK-8和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期情况。结果:与mock组比较,转染NANOG-siRNA后,肝癌细胞HepG2中NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白水平均下调(P＜0.05),细胞增殖能力下降(P＜0.05),进入G 0/G 1期的细胞比例增多(P＜0.05)。结论:沉默NANOG表达可引起肝癌细胞HepG2中cyclin D1的表达下降,导致细胞增殖能力下降。     

质粒介导的RNAi技术对截短HCMV IE2基因表达的抑制作用

目的 应用质粒介导的RNA干扰技术研究siRNA抑制截短HCMV IE2基因的表达的作用。方法 以pLL3．7质粒为模板，采用半套式PCR的方法扩增出含U6启动子的siRNA表达片段，连接pMD-T simple vector构建效应质粒表达重组体pMD-T-shRNARI和pMD-T-shRNAR2。同时采用RT-PCR方法从HCMV AD169株基因组中调取目的截短基因IE2，定向克隆到带有绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因的真核表达载体pEGFP-C1上，构建HCMVAD169株截短IE2基因重组表达质粒pEGFP-C1-IE2；用脂质体共转染效应质粒和靶基因表达重组体至Hep-2细胞中，荧光显微镜下观察效应质粒的RNA干涉作用，并观察RNA干扰的时效和量效改变。结果 三组质粒重组体构建成功，克隆到的2个shRNA表达载体对截短IE2基因的表达都有干涉作用。在与靶基因质粒量比为1：1和1：2时，其中pMD-T-shRNAR1 48～72h间干涉效应为100％，可完全封闭IE2的表达；pMD-T-shRNAR2使IE2处于极低水平表达，48～72h间干涉效应达到98．4％～99％。结论 通过质粒介导的RNAi技术能够有效地抑制HCMVIE2基因的表达，为治疗HCMV感染的药物开发提供了思路。     

沉默HIF-1α基因表达对大鼠肝癌细胞增殖的影响

 目的： 探讨沉默缺氧诱导因子　1α（HIF-1α）基因表达对缺氧状态下肝癌细胞增殖的影响。方法：选用大鼠CBRH-7919肝癌细胞株作为研究对象,利用氯化钴（CoCl2）建立缺氧模型。制备3组特异性较强的HIF-1α siRNA-脂质体复合物,转染于肝癌细胞。利用real-time RT-PCR、Western blotting等方法分别检测肝癌细胞HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)、p21和cyclin D1在mRNA和（或）蛋白水平的表达。MTT及BrdU 掺入实验检测细胞增殖的变化。结果：缺氧条件下,肝癌细胞的HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表达显著增多（P<0.05）。HIF-1α基因表达沉默后,HIF-1α、VEGF及cyclin D1 mRNA和（或）蛋白表达明显减少（P<0.05）,p21蛋白表达明显增加（P<0.05）。HIF-1α siRNA转染组的BrdU阳性细胞比例明显少于对照组(P<0.05)。结论：沉默HIF-1α基因表达对缺氧状态下肝癌细胞的增殖有显著抑制作用。     

携带甲胎蛋白基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对靶基因的沉默效率

目的构建携带甲胎蛋白（AFP）基因小干扰RNA（siRNA）的慢病毒载体并转染肝癌细胞,评价其对AFP基因的沉默效率。方法设计和构建针对AFP基因的阳性siRNA及不针对任何已知基因的阴性siRNA,将其分别插入携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组慢病毒载体,然后转染到表达AFP基因的人肝癌细胞HepG2并筛选阳性表达细胞株,分别为慢病毒转染阳性siRNA组和慢病毒转染阴性siRNA组。同时设立脂质体转染阳性siRNA组、脂质体转染阴性siRNA组以及加AFPsiRNA而未用转染试剂的siRNA组、空白对照组。荧光显微镜观察评估转染效率,荧光定量PCR和免疫印迹法检测各组HepG2细胞APFmRNA及蛋白的相对表达量,比较不同转染方法对AFP基因表达的抑制率。结果慢病毒能够有效地转染siRNA到HepG2细胞内。荧光定量PCR显示慢病毒转染siRNA对AFPmRNA表达的抑制率显著高于脂质体转染siRNA（92．1％比74．3％,P〈0．05）。免疫印迹亦显示慢病毒转染siRNA对AFP蛋白表达的抑制率显著高于脂质体转染siRNA（88．2％比63．7％,P〈0．05）。结论慢病毒转染AFPsiRNA能够更有效地抑制HepG2细胞内AFP基因表达。     

The effects of siRNA against RPL22 on ET-1-induced proliferation of human pulmonary arterial smooth muscle cells

The aim of this study was to investigate the effects of small interference RNA (siRNA) against ribosomal protein L22 (RPL22) on ET-1-induced proliferation of human pulmonary arterial smooth muscle cells (HPASMCs). HPASMCs were transfected with siRNA against RPL22, incubated in smooth muscle cell culture medium (SMCM) and ET-1. RPL22 gene expression and protein levels of HPASMCs were measured by real-time PCR and western blotting, respectively. PCNA, CCK-8 immunohistochemistry and flow cytometry analysis were used to evaluate HPASMC proliferation. Cyclin D1 (CCND1) expression was also assayed. Following transfection with siRNA against RPL22, RPL22 expression was significantly inhibited in the control and ET-1 groups. HPASMC proliferation was significantly suppressed by transfection with siRNA against RPL22. Moreover, CCND1 was also downregulated by inhibiting RPL22 expression. In conclusion, these data suggest that inhibition of RPL22 expression can suppress HPASMC proliferation and CCND1 expression. The effects of siRNA against RPL22 on HPASMC proliferation are considered to be mediated through inhibition of CCND1 expression.     

RNA干扰对宫颈癌细胞中E6AP基因的影响及其意义

目的 探讨RNA干扰(RNAi)对宫颈癌细胞系HeLa细胞E6AP基因表达及细胞增殖和凋亡的影响.方法 实验分为3组:空白对照组(未经转染的HeLa细胞)、转染阴性对照的小干扰RNA(siRNA)组及转染特异性E6AP siRNA组.采用半定量RT-PCR技术、Western blot方法 检测E6AP mRNA、蛋白表达水平,用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测细胞增殖状况,用流式细胞术检测细胞凋亡.结果 转染E6AP siRNA 24、48、72 h后,E6AP siRNA组E6AP mRNA表达水平与对照siRNA组比较下降33%、72%、70%.Western blot结果 显示,在转染48及72 h,E6AP蛋白表达下降38%、59%.MTT法检测显示,转染HeLa细胞24、48、72、96 h后细胞生长速度明显降低,E6AP siRNA组与空白对照组(F=101.38,P＜0.05)、对照siRNA组(F=38.64,P＜0.05)比较,差异均有统计学意义.E6AP siRNA作用24、48、72 h后E6AP siRNA组凋亡率明显高于对照siRNA组(F=41.48,P＜0.05)和空白对照组(F=86.36,P＜0.05),差异有统计学意义.结论 体外合成的siRNA能有效封闭宫颈癌细胞中E6AP基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞的凋亡,为宫颈癌的基因治疗提供理论依据.     

膜联蛋白A7低表达对人肝癌HepG2细胞增殖的影响

目的 探讨膜联蛋白A7低表达对人肝癌HepG2细胞的增殖产生的影响。方法 采用Western blotting法鉴定siRNA可有效抑制膜联蛋白A7表达,然后用脂质体转染法将siRNA转染入HepG2细胞,将细胞分为siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组,在转染后24h、48h、72h进行细胞计数以绘制细胞增殖曲线,转染后48h进行MTT实验以检测细胞增殖活力;免疫组织化学法检测cyclinD1和Ki67的表达,Western blotting法检测cyclinD1的表达情况。结果 转染了靶向膜联蛋白A7的siRNA后48h的HepG2细胞,细胞计数和MTT实验可见siRNA干扰组细胞增殖活力较阴性对照组和空白对照组显著降低（P<0.05）;cyclinD1和Ki67蛋白表达均为siRNA干扰组细胞表达显著低于两对照组（P<0.05）。 结论 膜联蛋白A7低表达可能对HepG2细胞的增殖具有一定的抑制作用。     

siRNA特异性抑制卵巢癌细胞葡萄糖调节蛋白78表达及其意义的研究

目的研究利用小分子干扰技术（RNAi）,构建Grp78靶向RNA干扰质粒载体,观察其对人类卵巢癌细胞SKOV3Grp78基因表达的抑制作用。初步探讨RNA干扰技术抑制Grp78的表达作为卵巢癌基因治疗的可行性。方法从GeneBank中选取人类卵巢癌细胞Grp78基因序列,采用siRNA Target Designer-Version 1.51设计软件设计Grp78基因发卡寡核苷酸,序列符合siRNA表达载体psiSTRIKETMU6的要求并与psiSTRIKETM质粒载体连接,采用脂质体转染法将含有特异性小分子干扰Grp78 mRNA的重组载体psiSTRIKETM/Grp78导入卵巢癌细胞系SKOV3中,分别在转染前、转染后24h、48h和72h通过RT-PCR和Western blot检测Grp78 mRNA及蛋白水平的表达情况,用流式细胞仪检测细胞凋亡。四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定细胞经梯度浓度紫杉醇处理后的细胞存活率。结果成功构建RNA干扰质粒载体,靶向Grp78 RNA干扰质粒载体命名为psiSTRIKETM/Grp78。将上述质粒转染到卵巢癌细胞后,观察到psiSTRIKETM/Grp78能够有效的抑制Grp78 mRNA及蛋白表达。转染psiSTRIKETM/Grp78基因后的卵巢癌细胞增殖受到抑制,出现凋亡征象,且对化疗药物的敏感性增加。结论构建的RNA干扰真核表达载体psiSTRIKETM/Grp78能明显抑制Grp78 mRNA及蛋白的表达,增加卵巢癌细胞的化疗敏感性。RNAi技术抑制Grp78表达为卵巢癌的基因治疗开辟了新的思路。