通用型免疫—聚合酶链反应系统的建立及应用

目的 构建基因探针，建立通用型免疫－聚合酶链反应（ＰＣＲ）系统，检测极微量抗原抗体方法 以聚乙烯亚胺（ＰＥＩ）作交联剂，构建成ＳＰＡ－ＤＮＡ基因探针，直接把生物素（Ｂｉｏ）与ＤＮＡ连接构建成Ｂｉｏ－ＤＮＡ基因探针，应用于免疫－ＰＣＲ中，分别对抗原抗体进行检测分析。结果 建立了通用型抗体抗原免疫－ＰＣＲ检测系统，分别用于人血清蛋白（ＨＳＡ）抗体抗原检测，ＨＳＡ抗体检测的最高稀释度可达１：１０＾９。Ｈ     

免疫聚合酶链反应检测方法初探

为了提高抗原抗体检测的灵敏度，利用生物素亲和素系统对免疫聚合酶链反应（免疫－ＰＣＲ）检测方法的建立做了初步探索，结果表明，免疫－ＰＣＲ可检测到少至１００ｆｇ的抗原，比酶联免疫吸附试验平行对照高１０００倍，该法仅限于实验模型的建立，其实际应用价值还有待于深入研究。     

单链DNA标记免疫探针的构建用于免疫聚合酶链反应的初步研究

免疫聚合酶链反应 (免疫ＰＣＲ)是近年出现的全新的标记免疫分析技术。它以一段ＤＮＡ作为标记物来代替酶等常规标记物 ,标记在抗体或抗原上 ,在抗原抗体反应完成后 ,用ＰＣＲ技术对标记的ＤＮＡ进行扩增将信号放大 ,然后 ,根据ＰＣＲ产物的有无及量的多少测定待测抗原或抗体。本研究以碳化二亚胺为连接分子构建单链ＤＮＡ标记的免疫探针 ,并将其用于免疫ＰＣＲ中 ,现将结果报道如下 :一、材料和方法1 .ｓｓＤＮＡ标记的羊抗人ＩｇＧ免疫探针的构建 :(1 )以 5′ ＴＴＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＧＴＧ (ＧＣＡ )ＴＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＧＣＡ 3′…     

免疫聚合酶链反应检测方法初探

为了提高抗原抗体检测的灵敏度，利用生物素亲和素系统对免疫聚合酶链反应（免疫－ＰＣＲ）检测方法的建立做了初步探索。结果表明，免疫－ＰＣＲ可检测到少至１００ｆｇ的抗原，比酶联免疫吸附试验平行对照高１０００倍。该法仅限于实验模型的建立，其实际应用价值还有侍于深入研究。     

炭疽芽孢杆菌特异性基因序列双重TaqMan聚合酶链反应快速检测体系的建立

目的 以炭疽芽孢杆菌的主基因和致病毒素基因pagA特异性序列为检测标志，建立高敏感、高特异的荧光双重实时TaqMan聚合酶链反应快速检测体系。方法 根据炭疽杆菌主基因组特异性序列（Gs）和特异的毒力岛pagA基因序列（Pag）设计引物及探针，通过构建目的质粒获得标准模板，利用TaqMan标记探针和便携式Smartcycle实时聚合酶链反应检测平台探讨该检测体系的检测敏感性和特异性。结果该体系炭疽芽孢杆菌的检测敏感度为10^2拷贝每反应体系，与其他蜡样杆菌群细菌未出现非特异性扩增，具有较高的特异性。整个反应在1h内完成，适合于实验室或野外环境下炭疽芽孢杆菌的快速检测。结论 本研究建立的双重TaqMan实时聚合酶链反应检测体系可作为炭疽芽孢杆菌快速、准确、特异、敏感的检测手段。     

长聚合酶链反应（LPCR）的进展

聚合酶键反应（PCR）是一种体外扩增DNA的有效技术。目前该技术主要用于扩增数百个到上千个碱基对（kb）的DNA片段。但是在许多分子遗传学研究中，如基因图谱分析，则需扩增更长的DNA片段才有价值。长片段DNA的PCR扩增近年已有报道[1]，例如选择不同的耐热DNA聚合酶、改过缓冲浪成份及循环条件等，可以扩增出10～15kb的片段，但产量低，多数实际应用仍限制于5kb以内。直到1994年，Barnes［2］和Cheng［3］等对DNA合成中碱基错配现象和模板DNA的损伤两个问题进行了研究并探讨了解决办法，其结果使PCR扩增）噬菌体DNA达42kb，扩…     

多重聚合酶链反应-微流芯片检测人血小板抗原系统基因型方法的建立与应用

目的建立人血小板抗原（HPA）-2、4、5系统基因型的检测方法。方法用多重聚合酶链反应和微流芯片检测方法，通过设计9条特异性引物、优化反应体系和反应条件，在一个体系中同时扩增HPA-2、4、5系统特异性的目的基因片段，利用微流芯片快速检测HPA-2、4、5系统基因型；并把分型结果与采用聚合酶链反应．序列特异性引物（PCR-SSP）获得的结果进行比较。结果对35名健康单采血小板者进行HPA-2、4、5系统分型的结果为：33名为2a／2a型，2名为2a／2b型；34名为4a／4a型，1名为4a／4b型；29名为5a／5a型，6名为5a／5b型。未发现2b／2b、4b／4b及5b／5b纯合子个体。该结果与PCR．SSP方法获得的结果完全一致。结论该方法可快速、准确地用于血小板血型抗原基因分型，尤其适合于大样本检测。     

聚合酶链反应结合探针杂交检测幽门螺杆菌

建立特异，灵敏的聚合酶链反应结合长臂光敏生物素探针杂交检测幽门螺杆菌的方法。用ＰＣＲ产物直接克隆并测序，以含ＨＰ ＤＮＡ序列的重组质粒外源片段为探针。用细菌培养，单纯ＰＣＲ和ＰＣＲ结合杂交检测经胃镜诊断为慢性炎，胃溃疡，十二指肠球部溃疡的胃活检组织，唾液和粪便标本中的ＨＰ。     

荧光探针杂交-聚合酶链反应检测沙门菌的研究及应用

目的建立一种快速检测沙门菌的荧光探针杂交-聚合酶链反应(PCR)方法.方法利用Taq DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性降解特异性杂交于模板上的荧光标记探针,导致荧光强度的改变,通过检测荧光强度分析PCR扩增产物.结果选用13株常见致病性沙门菌和7株非沙门菌进行特异性分析,所有沙门菌的荧光△RQ值介于3～8之间,而所有非沙门菌的荧光△RQ值均小于1;在敏感性分析中,采用菌落CFU计数法,最低限度可检测到每PCR扩增体系中含2.25 CFU的沙门菌;与传统细菌培养鉴定方法对照,对40份各种标本进行沙门菌的检测,结果该方法的特异性为100%,敏感性为93.1%,两种方法的符合率为95%.结论用荧光探针杂交-PCR检测沙门菌,是一种快速、敏感的方法.     

人类血小板抗原全套基因分型方法的建立与应用

目的 建立一种基于DNA扩增和测序分型(PCR sequencing-based typing,PCR-SBT)的人类血小板抗原HPA-1～HPA-16w的基因分型方法.方法 从免疫多态性数据库中下载HPA-1～HPA-16w的全套HPA核酸序列,以Primer Premier 5.0软件设计引物,特异性扩增包含HPA-1a/lb到HPA-16aw/16bw多态性的核酸片段.通过调整引物序列和PCR条件获得单一的特异性扩增产物.PCR产物纯化后直接进行DNA序列分析并确定HPA基因型.通过对2份标准样本的HPA分型验证PCR-SBT方法的准确性;并利用PCR-SBT法对2008年度国际输血协会(ISBT)第14届国际血小板免疫学工作组提供的16份比对样本(包括6个含有基因突变的干扰样本)进行HPA基因分型.结果 设计11对引物扩增和测序16个HPA系统.2份标准样本的HPA基因型分别为HPA:1aa/2aa/3ab/4aa/5ab/6aa/7aa/8aa/9aa/10aa/11aa/12aa/13aa/14aa/15aa/16aa和HPA:1aa/2aa/3aa/4aa/5aa/6aa/7aa/8aa/9aa/10aa/11aa/12aa/13aa/14aa/15as/16an.16份ISBT考核样本的256个HPA基因型结果清晰,其中HPA-1～HPA-6w、HPA-9w和HPA-15共8个系统的128个基因型结果与ISBT参考结果完全一致.结论 建立了HPA-1～HPA-16w的PCR-SBT分型方法,结合高通量的DNA序列分析仪,具有简单、快速和准确的优点,适合于临床HPA全套基因分型,具有良好的应用前景.     

复合聚合酶链反应检测恶性疟原虫及混合感染

目的应用一种简易、快速的复合ＰＣＲ扩增系统检测恶性疟原虫及混合感染。方法以间日疟原虫（Ｐｖ）和恶性疟原虫（Ｐ．ｆ）小亚单位核糖体核糖核酸基因（ＳＳＵｒＤＮＡ）特定片段为靶基因，设计并合成引物，建立复合ＰＣＲ扩增系统。采用煮沸法快速制备ＤＮＡ模板研究本系统的敏感性和特异性，并用于临床血样的检测。结果从Ｐ．ｖ和Ｐ．ｆ感染血样中分别扩增出分子量大小为７０５ｂｐ和５７５ｂｐ的特定扩增带。而食蟹猴疟原虫、诺氏疟原虫及正常人血样均无扩增带出现。单独检测Ｐ．ｆ敏感度达到０４７×１０－６（约２虫／μｌ全血），在Ｐ．ｖ存在的情况下，检测Ｐ．ｆ敏感度为０４７×１０－５。检测１０４例疟区门诊患者冻存血标本，８４例与镜检法结果相同，并发现２４例混合感染和２例为镜检虫种鉴别失误。结论本系统敏感性高，特异性强，操作简单，并可在一次扩增中同时检出Ｐ．ｖ和Ｐ．ｆ，具有一定的推广应用价值。     

单引物二次PCR法对重组质粒中HBV前C-C基因进行点突变的研究

目的建立单引物二次PCR法对重组质粒中HBV前C-C基因进行4处点突变，并与传统环状突变法进行对比。方法将变异点合成在一对互补引物中，先加入单条引物行PCR扩增，再以产物为模板，加入另一单条引物行PCR扩增。PCR产物加入DpnⅠ酶，切除其中变异前的模板质粒，转化入大肠埃希菌DH5α，卡那霉素培养基筛选阳性菌落增菌测序。结果对该质粒而言，采用单引物二次PCR法预期位点均发生变异，成功率高于传统环状突变法。4个变异后质粒与模板条带位置基本一致，4个质粒的拟变异位点均如预期变异成功，而其他氨基酸无变异。结论单引物二次PCR法进行重组质粒基因突变较传统环状突变法成功率有所提高。     

荧光定量PCR技术检测结核分支杆菌DNA的应用价值

目的评价荧光定量PCR技术检测临床标本中结核分支杆菌的应用价值。方法应用荧光定量PCR法及抗酸染色、结核杆菌培养法,对179例活动性肺结核患者晨痰、123例活动性肺结核患者外周血、34例结核性胸膜炎患者胸水、20例非结核性呼吸系统疾病患者的晨痰标本进行检测。结果179例活动性肺结核患者晨痰、123例活动性肺结核患者外周血、34例结核性胸膜炎患者胸水,涂片抗酸染色阳性率分别为20．67％（37／179）、0．00％、0．00％;细菌培养阳性率分别为41．34％（74／179）、0．00％、2．94％（1／34）;荧光定量PCR技术阳性率分别为64．25％（115／179）、38．21％（47／123）、44．12％（15／34）。3种标本荧光定量PCR技术阳性率高于抗酸染色和结核杆菌培养,经统计学处理发现,差异有统计学意义。用荧光定量PCR技术检测临床标本特异性为95．00％。结论荧光定量PCR技术将PCR扩增、荧光探针杂交及检测一体化,在单一管内完成,具有简便、快速、防污染、敏感性及特异性高等优点,是结核病诊断的有效方法之一。     

聚合酶链反应检测出血性大肠埃希菌

为建立一种针对出血性大肠埃希菌的特异性聚合酶链反应（ＰＣＲ）诊断方法，根据Ｏ１５７：Ｈ７血清型大肠埃希菌ｈｌｙＡＢ基因的ＤＮＡ序列，设计８个引物，使用３２株Ｏ１５７：Ｈ７血清型。结果表明，引物ＲＨ２８－ＲＨ３０和ＲＨ２６－ＲＨ３１敏感性和特异性好，达１００％。ＲＨ２６－ＲＨ３１产物的分子量较大，为２ｋｂ。ＲＨ２８－ＲＨ３０的产物为３３８ｂｐ，比较适合检验使用。研究还发现，使用煮沸法制备ＰＣＲ模板，方法简便、快速、实用，且对ＰＣＲ反应的特异性和敏感性无影响。ｈｌｙＡＢ基因片段作为出血性大肠埃希菌ＤＮＡ探针的特异性和敏感性是明显的，且实用性好。根据出血性大肠埃希菌独特的ｈｌｙＡＢ基因序列设计的ＰＣＲ引物，在理论和实际应用方面均有其优越性。     

聚合酶链反应-反向斑点杂交鉴定分枝杆菌菌种

目的 建立一种简便、快速、敏感和特异的分枝杆菌菌种鉴定方法。方法以１６ＳｒＤＮＡ为靶序列,采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）－反向斑点杂交检测２５种分枝杆菌１１种分枝杆菌标准株、１２０株分枝杆菌临床分离株和２６份痰标本。结果 分枝杆菌、非分枝杆菌标准株经ＤＮＡ扩增,分枝杆菌均出现５７８ｂｐＤＮＡ片段,非分枝杆菌除假白喉棒状杆菌可见同样片段外,其余菌种均未见扩增。敏感性试验可检测出１００ｆｇ结核分枝杆菌ＤＮ     

荧光定量PCR检测血清巨细胞病毒DNA的临床应用

目的建立一种区分巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)潜伏性感染与活动性感染并适于临床大量标本CMV DNA检测的常规检测方法。方法利用血清作为待检标本,通过优化实验方案,建立血清CMV DNA的荧光定量PCR(fluorogenic quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)检测方法;并利用FQ-PCR技术对54例疑似CMV感染的患儿(1个月～15岁,抗CMV IgM阳性或IgM与IgG双阳性)及32例患非感染性疾病的患儿(3个月～14岁,抗CMV IgM检查均阴性,部分患儿抗CMV IgG阳性)血清CMV DNA进行检测。结果54例CMV疑似感染患儿中,CMV DNA检测大于1×10~3拷贝/ml者占40.74%,而32例非感染性疾病患儿中,CMV DNA检测大于1×10~3拷贝/ml者只占18.75%,两者比较有显著性差异(P<0.05)。采用FQ-PCR技术,在LightCycler和Rotor-Gene检测仪上检测具有相同的灵敏度,且具有可比性。结论FQ-PCR定量检测血清CMV DNA的方法能够更灵敏地反映CMV活动性感染,假阴性率低,重复性好,结果可靠。FQ-PCR定量检测血清内CMV DNA的方法可作为临床CMV DNA的检测的常规方法。     

百日咳杆菌荧光定量PCR检测方法的建立和应用

目的 建立快速、准确、特异的定量检测百日咳杆菌的方法,并进行临床应用研究.方法 根据百日咳杆菌IS481基因序列,设计并合成引物和荧光探针,建立百日咳杆菌荧光定量PCR检测方法,并对方法的特异度、重复性和灵敏度进行评价,检测百日咳疑似患者咽拭子225份和健康者咽拭子30份.结果 该方法的标准曲线显示模板浓度在102～108拷贝/μl线性范围与其循环阈值(Ct)具有较好的线性关系,相关系数(r)为0.998,最小检出量为102拷贝.特异度较好,灵敏度较高,重复性实验结果显示在同一时间检测高低浓度阳性克隆质粒(2×107与3×103拷贝/μ1)10次,连续检测5次,变异系数(CV)为5.78%～16.7%.在不同时间检测高低浓度阳性克隆质粒(2×107与3×103拷贝/μl),连续7次,CV为8.25%～14.9%.经检测,疑似患者的咽拭子有41份样本为阳性,30份健康人咽拭子均为阴性.结论 由于本实验建立的荧光定量PCR方法快速、灵敏度高、特异度好,适合临床实验室进行临床标本的百日咳杆菌的定量检测,有较大的应用前景.     

终点法荧光定量PCR检测HBV-DNA的临床应用

目的运用终点法荧光定量PCR检测HBV-DNA,探讨其临床应用价值。方法运用本研究组制备的引物和荧光探针分别将HBV-DNA质粒及临床标本进行普通PCR和实时荧光定量PCR反应,再将普通PCR产物在荧光测定仪上测定荧光强度,与实时荧光定量PCR结果相比较,观察其符合程度。另外,运用相同方法比对本研究制备的PCR体系与市售荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的符合程度。结果终点法荧光定量PCR与实时荧光定量PCR检测HBV-DNA质粒及临床标本结果一致(P>0.05),与市售荧光定量PCR试剂比较,其符合程度较高(P>0.05)。结论终点法荧光定量PCR检测临床HBV-DNA标本稳定可靠,可作为荧光定量PCR的应用方法之一在基层医院推广应用。     

限制性片段长度多态性分析人血小板抗原5系统基因型

目的 建立人类血小板抗原（HPA）5系统限制性片段长度多态性（PCR－RFLP）分析方法。方法 采用PCR－RFLP方法对25名健康献血员的HPA－5系统进行基因分型。分型结果与采用等位基因特异性寡核苷酸点杂交（PCR－ASO）获得的结果进行比较。结果 以PCR－RFLP方法对25名献血员的HPA－5系统分型：24名为a/a型,1名为a/b型,未发现b/b纯合子个体,结果与PCR－ASO方法获得的结果完全一致。结论 使用PCR－RFLP方法对HPA－5系统进行基因分型,具有简便、快速、准确等优点,有利于新生儿同种免疫血小板减少性紫癜、输血后紫癜和血小板输注无效等疾病的诊断和治疗。