HPLC-ESI-ITMS在药品质量控制中确证胰岛素和胰岛素B链C端氨基酸序列的应用研究

在药品质量控制中应用HPLC-ESI-IT (Ion Trap) MS分别确证胰岛素和胰岛素B链的C端氨基酸序列。取胰岛素标准品溶液或者胰岛素B链溶液适量，加入羧肽酶P及羧肽酶Y溶液适量降解胰岛素或者胰岛素B链C端，在预定的时间点取出酶降解反应液适量，加入等体积1%甲酸停止反应，混旋均匀后制成供试液，供HPLC-ESI-IT MS分析测定。采用Zorbax Prosphere C₁₈柱(2.1 mm×150 mm，300A，5 μm)分离，以流动相进行梯度洗脱［A相：水-乙腈-三氟乙酸(98∶2∶0.02)，B相：乙腈-水-三氟乙酸(98∶2∶0.02)］。柱后修饰“TFAfix”溶液为丙酸-异丙醇(2∶8)的混合溶液。ESI-ITMS测定供试液中梯度多肽系列(彼此相差1个C端氨基酸残基)的分子质量，计算出分子质量最相近的相邻两肽段的系列分子质量差值，即可得到待测样品C端系列氨基酸残基质量的实验值。胰岛素的B链C端的第1个氨基酸残基丙氨酸残基可以被准确地确证；同样还原修饰的胰岛素B链C端的第1个氨基酸残基丙氨酸残基也能被准确地确证。本研究在nmol样品水平准确地确证胰岛素和胰岛素B链各一个C端氨基酸，符合重组DNA制品中试产品的质量控制要求。本实验方法不必将胰岛素经还原修饰将A链从B链裂解，直接确证胰岛素的C端氨基酸残基，避免还原修饰和纯化的烦琐操作，方法简便。     

胰岛素的种类及特点

胰岛素最初是由加拿大学者班廷(Banting)和拜斯特(Best)在1921年从狗的胰腺中提取出来的,从此开辟了糖尿病治疗的新时代。目前胰岛素制剂的研制开发进展迅速,临床上胰岛素的种类繁多,现结合我院胰岛素品种,按来源,制备工艺,胰岛素作用时间,胰岛素给药装置等几方面对胰岛素进行分类阐述。1根据胰岛素的来源,胰岛素分类为1.1人胰岛素,是一种小分子蛋白质,分子量为5808,是由胰腺胰岛的β细胞分泌的激素物质,由A、B两条氨基酸肽链组成[1]。1.2猪胰岛素,与人胰岛素结构类似,只有一个氨基酸不同,即将人胰岛素的B链30位上的苏氨酸换成了丙氨酸[1]。1.3牛胰岛素,与人胰岛素有3个氨基酸不同,一个是人胰岛     

速效胰岛素类似物研究进展

速效胰岛素类似物与正规人胰岛素（RHI）相比起效快,常规胰岛素含有引起分子间聚合的氨基酸,通过改变或删除A和B链上部分氨基酸,去除引起聚合的因素,达到形成单体胰岛素的目的,模拟胰岛素的生理性分泌,应用于糖尿病的治疗,且耐受性良好,这样可以消除使用常规胰岛素所引起的并发症,比如：眼病、腿病等。本文综述了速效胰岛素类似物近年来的研究进展,为进一步研究速效胰岛素类似物奠定基础。     

人胰岛素的酶促聚乙二醇修饰

为开发一种新的胰岛素聚乙二醇修饰方法,以人胰岛素为原料,用羧肽酶A切掉其B链C末端的苏氨酸残基,得到去掉B30的胰岛素(des-B30-insulin),然后在有机相中,使用胰蛋白酶做催化剂,将一个连有聚乙二醇链的苏氨酸衍生物链接到des-B30-insulin上,得到一种新的聚乙二醇-胰岛素轭合物。该方法的特点是聚乙二醇通过酶促反应被定位连接在人胰岛素的B链C末端氨基酸上,形成了一种新型的聚乙二醇-胰岛素轭合物。生物活性的测定表明该轭合物具有极好的胰岛素活性保留,并具有潜在的长效功能。     

胰岛素类似物--Aspart 30

未修饰的人胰岛素分子之间由于自我联合形成六聚体，导致胰岛素从皮下注射部位吸收进入血循环的时间延迟。速效胰岛素类似物Aspart，因其B链的28位上的氨基酸被天门冬氨酸所取代，至使胰岛素分子彼此排斥，而降低了胰岛素分子的耦联生成6聚体，从而使之经皮快速吸收。Aspan30是由30％可溶性门冬氨酸胰岛素和70％鱼精蛋白结晶体门冬氨酸胰岛素组成。因此本文对Aspart30药代动力学及临床研究做一综述。     

甘精胰岛素的不良反应和合理应用

甘精胰岛素是一种超长效胰岛素类似物，通过DNA重组技术，用大肠埃希杆菌的非病原性菌株生产的。其分子结构是将人体胰岛素的A链上21位上的天冬酰胺用甘氨酸取代，B链30位苏氨酸后增加两个精氨酸，等电点为7．0左右，在酸性注射液中完全溶解，呈无色透明溶液，可用于注射。在生理条件下，其溶解度低，形成细微的胰岛素沉淀物，并缓慢由六聚体分解为二聚体、单聚体后被人体吸收。作为一种基础胰岛素在持续给药后药效能持续24h，     

小C肽人胰岛素原类似物(B-Arg-Arg-A)和人胰岛素原(B-C-A)A、B链重组条件的研究

目的 :获得更佳的变复性条件和提高人胰岛素原的重组率。方法 :采用特有的重组方法 ,将小C肽人胰岛素原类似物 (B Arg Arg A)与人胰岛素原 (B C A)进行重组条件的比较。 结果 :发现二者在 pH10 .6左右处重组率达到最大 ,且在相同的条件下B Arg Arg A蛋白质的重组率 (94% )较B C A蛋白质 (82 % )的高。结论 :进一步验证了“胰岛素的A、B链含有足够使二硫键正确配对的结构信息”的论点。     

利用LC-MS/MS法解析化学修饰型胰岛素类似物的氨基酸序列

目的:德谷胰岛素和地特胰岛素是以长链脂肪酸化学修饰为代表的第3代胰岛素类似物,有必要建立专属性强、灵敏度高的LC-MS/MS法测定化学修饰型胰岛素类似物的氨基酸序列。方法:氨基酸序列测定方法的色谱参数为ACQUITY UPLC peptide BEH C₁₈色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7μm, 300?),流动相A为0.1%甲酸/水溶液,流动相B为0.1%甲酸/乙腈溶液,梯度洗脱,流速0.3 mL·min^-1;质谱参数为MS^E采集模式,碰撞能量为30～40 eV。结果:德谷胰岛素和地特胰岛素序列覆盖率良好,化学修饰位点的碎片离子y1&可检出,中高强度离子的离子强度RSD在15%之内,可有效区分与其他未修饰胰岛素的序列。结论:建立了重复性好、专属性强和耐用性好的脂肪侧链修饰型胰岛素类似物氨基酸序列LC-MS/MS方法,为该类产品序列结构的研究方法提供了借鉴意义。     

赖脯胰岛素（insulin lispro）

赖脯胰岛素(insulin lispro,IL,商品名Humalog)为人胰岛素(human insulin,HI)脯赖换位的重组类似物,是美国礼来(Lilly)公司于1996年首次在瑞士上市的。迄今已获得瑞典、德、英、俄等不少欧洲国家,美国、加拿大和一些拉美国家,以及日本、澳大利亚、新西兰和南非等国的批准并广泛用于临床,普遍反映良好。 顾名思义,此种脯赖换位重组胰岛素类似物是指在HI分子结构中,其B链C-末端28位上的脯氨酸(proline)与29位上的赖氨酸(lysine)相互换位而成的。除上述两个氨基酸换位外,IL和HI的基本结构完全相同。不过,一经换位为     

胰岛素类似物的研究与其在临床治疗糖尿病中的应用进展

近年来，科学家利用基因脱氧核糖核酸（DNA）重组技术，改变胰岛素肽链上某些部位的氨基酸组合和等电点，并增加六聚体的强度；或对胰岛素氨基酸的序列进行修饰，或在分子上增加脂肪酸链，加大与白蛋白的结合，均改变了普通胰岛素的理化和生物学特征，从而研制出较常规人胰岛素更适合人体生理需要以控制血糖的胰岛素，并合成了一系列胰岛素类似物（Insulin similitude），亦被称为“速效胰岛素”或餐时胰岛素（Mealtime insulin）。目前，已上市用于临床的有赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素等。其中，前三者为短效胰岛素类似物，后二者为长效胰岛素类似物。     

11032 Lilly／Alkermes公司开始Ⅲ期胰岛素研究

美国Eli Lilly公司和Alkermes公司称，他们已经开始进行他们共同研发的AIR吸入性胰岛素系统（Ⅰ）的Ⅲ期注册试验，该药用于治疗2型糖尿病。该研究比较了（Ⅰ）与可注射餐前胰岛素用药3个月后的平均糖化血红蛋白（A1C，血糖）水平。     

德IQWiG质疑短效胰岛素研究

德国药物评估机构IQWiG质疑短效胰岛素比正规人胰岛素优越的说法，且批评胰岛素产品研究的质量较差。 IQWiG没有做新的试验，而是应国家保健委员会GBA的要求对各种短效胰岛素产品所有研究的质量和可靠性进行评估。评估的药物是胰岛素aspart（Novo Nordisk公司的Novo Rapol）（Ⅰ）、胰岛素lispro（Lilly公司的Humabg）（Ⅱ）及胰岛素glalisin（Sanofi-Aventis公司的Apidra）（Ⅲ）。     

门冬胰岛素和生物合成人胰岛素治疗妊娠期糖尿病疗效观察

目的 观察门冬胰岛素和生物合成人胰岛素在治疗妊娠期糖尿病中的疗效和安全性.方法 在我院2015年3月至2016年8月收治的妊娠期糖尿病患者中选出135例随机分成A组和B组,A组患者给予门冬胰岛素治疗,B组患者给予生物合成人胰岛素治疗,对比两组患者的血糖水平、母婴结局等指标值.结果 A组患者治疗前和治疗3d时的空腹血糖、餐后2h血糖与对照组对比差异不明显(P＞0.05);治疗5d时,A组患者的空腹血糖、餐后2h血糖均低于B组,且A组患者的血糖达标时间更短,胰岛素日平均用量低于B组(P＜0.05);A组产妇并发症发生率与B组差异无统计学意义(P＞0.05);A组新生儿并发症发生率低于B组(P＜0.05).结论 在妊娠期糖尿病治疗中门冬胰岛素的降血糖效果更好,且有助于改善母婴结局,减少胰岛素用量.     

正确看待甘精胰岛素和肿瘤风险的关系

随着医疗卫生和科学技术的日益发展,通过对人胰岛素个别氨基酸进行修饰所产生的胰岛素类似物,可以在降糖效果、作用时间、低血糖风险、方便性等方面更好地改善糖尿病治疗效果。通常情况下,人体中的胰岛素和胰岛素受体结合发挥调节代谢作用,但在高生理浓度或特殊状态下,会有少量胰岛素和IGF-1受体结合,起到促有丝分裂的作用。研究者们在设计胰岛素类似物时,常常首选不影响胰岛素生理作用和与胰岛素受体结合的B26至B30的氨基酸位点进行修饰。     

胰岛素抵抗与非胰岛素抵抗多囊综合征的临床治疗探讨

目的研究胰岛素抵抗与非胰岛素抵抗多囊卵巢综合征（PCOS）的临床特点、治疗方法及效果。方法将我院近年收治的PCOS患者60例根据胰岛素抵抗情况分为A组（非胰岛素抵抗）、B组（胰岛素抵抗）各30例,A组对症进行常规治疗,B组在A组基础上加服二甲双胍,比较治疗后2组性激素水平、血脂及BMI水平。结果性激素水平上,2组E2、FSH水平无明显差异（P〉0.05）,但B组的LH水平则明显低于A组（P〈0.05）;血脂及BMI水平上,2组在TC、LDL-C上差异不大,但A组的TG、HDL-C水平明显高于B组,BMI水平则明显低于B组（P〈0.05）。结论胰岛素抵抗和非胰岛素抵抗患者的性激素、血脂水平、BMI指数存在明显差异,对胰岛素抵抗患者要进行积极的降糖、降胰岛素水平等对症治疗。     

甘精胰岛素与精蛋白胰岛素分别联用瑞格列奈治疗2型糖尿病临床观察

目的在长期口服二甲双胍、瑞格列奈血糖控制不良的情况下,分别每晚用一次甘精胰岛素或一次精蛋白胰岛素治疗,比较这两种方案的疗效和低血糖风险。方法选择59例经长期饮食控制及口服上述药物血糖控制不佳的2型糖尿病患者,睡前采用注射胰岛素治疗,随机分为A组（甘精胰岛素〈由赛诺菲安万特生产〉）和B组（精蛋白胰岛素〈由诺和诺德公司生产〉）,分别观察治疗前后空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（PG）、糖化血红蛋白（HbA1C）、瑞格列奈（由诺和诺德公司生产）用量的变化及低血糖情况。结果A（甘精胰岛素）组较B（精蛋白胰岛素）组能更好地控制餐后2 h血糖（PG）及糖化血红蛋白（HbA1C）,且低血糖风险更少,瑞格列奈用量更少。结论在长期口服降糖药失效的情况下联合甘精胰岛素治疗较精蛋白胰岛素降糖效果更好,低血糖风险更少,瑞格列奈用量更少。     

以酮症起病的肥胖型糖尿病患者胰岛素抵抗特征

目的评估酮症倾向的初发糖尿病（KPD）患者外周胰岛素敏感性和胰岛B细胞功能。方法对21例酮症起病、自身抗体阴性的糖尿病患者（A组）及24例无酮症的初诊2型糖尿病患者（B组）,应用胰岛素治疗3个月。计算治疗前后稳态模型评估的胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、胰岛素敏感性指数（HOMA-ISI）和胰岛素分泌指数（HOMA-IS）。结果治疗前A组HOMA-IS、HOMA-IR较B组低（分别P〈0.05和P〈0.01）;两组HOMA-IR均高于对照组（P〈0.01）。治疗3个月后,A组HOMA-IS仍低于B组（P〈0.01）,两组较治疗前均上升（均P〈0.01）,治疗前后ΔHOMA-IS两组无统计学差异;A、B两组HOMA-IR无统计学差异,A组ΔHOMA-IR小于B组（P〈0.05）。结论酮症起病的糖尿病患者胰岛素抵抗较普通2型糖尿病轻,酮症控制后胰岛素敏感性恢复程度小。     

门冬胰岛素与人正规胰岛素对不规律进食老年2型糖尿病患者血糖影响的研究

目的：研究门冬胰岛素与人正规胰岛素对不规律进食老年2型糖尿病患者血糖的影响。方法：2006年2月至2007年4月老年2型糖尿病患者共33例[男性18例，女性15例，平均年龄（65．82±2．85）岁]被纳入研究，先后用方案A和方案B治疗，各4个月。方案A：三餐前30min皮下注射人正规胰岛素＋睡前皮下注射人低精蛋白锌胰岛素；方案B：三餐后10～15min皮下注射门冬胰岛素＋睡前皮下注射人低精蛋白锌胰岛素。每周检测2次空腹血糖（FBG）和早、午、晚餐后2h血糖；并对患者低血糖发生次数及其严重程度、糖化血红蛋白（HbA1c）变化进行对比观察。结果：患者的FBG和早、午、晚餐后2h血糖，在方案A治疗期间分别为（7．37±4．22）mmol／L、（9．73±3．38）mmol／L、（10．23±3．96）mmol／L和（10．85±3．36）mmol／L，在方案B治疗期间分别为（7．01±1．74）mmol／L、（9．23±1．58）mmol／L、（9．22±1．28）mmol／L和（9．76±1．32）mmol／L，差异有统计学意义（均P〈0．01）；方案B较方案A的餐后血糖波动幅度明显降低；治疗前后HbA1c的差值在方案A、B分别为（3．08±0．96）％和（3．37±0．47）％（P〈0．01）；低血糖发生次数及中重度低血糖发生率，在方案A治疗中分别为68例次及36．7％，在方案B治疗中分别为21例次及19．05％，差异有统计学意义（P〈0．001）。结论：门冬胰岛素餐后皮下注射可有效降低老年2型糖尿病患者的血糖，减小餐后血糖波动幅度，减少低血糖的发作次数并降低其严重程度，对不规律进食的老年糖尿病患者安全有效。     

胰岛素类似物与人胰岛素在初诊2型糖尿病治疗中的价效比分析

目的：比较胰岛素类似物与人胰岛素在初诊2型糖尿病治疗中的价格-疗效。方法96例初诊为2型糖尿病的患者,随机分为优泌乐25治疗组（ A组）和优泌林70/30治疗组（ B组）,监测血糖水平,记录低血糖事件、治疗前后测HbA1 c、胰岛功能,计算住院期间及出院后治疗糖尿病的费用。结果 A组与B组的餐后血糖明显下降（ P ＜0 y．01）,且A组比B组的餐后血糖下降显著（ P ＜0．05）;治疗3个月后2组的HbA1c明显下降（ P ＜0．01）,A组比B组的下降显著（ P ＜0．05）;胰岛素及C-肽水平较治疗前有所上升（ P ＜0．05）,A组比B组的上升显著（ P ＜0．05）;A组较B组的低血糖事件少（ P ＜0．05）,且无严重低血糖事件发生。结论胰岛素类似物比人胰岛素具有更好的疗效,且安全、灵活、方便、患者依从性好,同时也比人胰岛素更为经济。     

甘精胰岛素与精蛋白锌重组赖脯胰岛素治疗老年糖尿病效果比较

目的比较甘精胰岛素和精蛋白锌重组赖脯胰岛素治疗老年糖尿病的疗效和安全性。方法选择在我院就诊的2型糖尿病患者1023例作为观察对象,应用甘精胰岛素治疗设为A组(572例),精蛋白锌重组赖脯胰岛素治疗设为B组(451例),比较两组患者疗效和安全性。结果 A组血糖达标时间明显较B组短,差异具有统计学意义;两组治疗后血糖均明显下降,A组较B组下降明显,差异具有统计学意义;A组较B组低血糖发生率低,差异具有统计学意义。结论与精蛋白锌重组赖脯胰岛素相比,甘精胰岛素治疗老年糖尿病效果较好,可以有效缩短血糖达标时间,低血糖发生率较低,值得进一步研究。