乙肝病毒基因多态芯片酶联分析法及其临床应用

目的 :建立生物素—亲和素系统酶呈色方法用于DNA芯片检测乙型肝炎病毒基因多态性及临床应用。方法 :针对HBVDNA多个常见点突变位点 ,设计多条寡核苷酸探针 ,用点样仪将其固定于硅烷化芯片的特定位置上 ,经与PCR扩增的HBV基因相应区段杂交 ,杂交结果影印至硝酸纤维素膜 ,经BCIP/NBT避光显色 ,根据特定位置上杂交信号的有无和与之相应的探针序列来判定基因突变的类型。结果 :通过一次杂交反应可检测HBV前C/C区 (nt1896/1814 )、BCP区 (nt1762 /1764 )和P区 (aa5 2 8/5 5 2 )等多个位点的变异 ,与测序分析结果符合率 97% ,具有较好的检测灵敏度和重复性。 15 6例乙肝患者HBV基因前C/C及BCP区检出基因突变 70例 (阳性率 44 .9% ) ,在 12 7例慢性肝炎组检出突变 60例 ( 4 7.2 % )、2 2例肝炎硬化组检出突变 8例 ( 3 6.4% )。结论 :酶呈色法DNA芯片检测HBV基因常见突变位点多态性 ,操作简便易行 ,节省昂贵试剂与设备 ,具有临床推广应用价值     

芯片检测HBV DNA多态性的临床意义

目的：DNA芯片检测乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)基因前C／C区、C基因区启动子(BCP)和P区等多个位点多态性。方法：将多条寡核苷酸探针固定于芯片的特定位置，与PCR扩增的HBV基因相应区段杂交，酶呈色，根据特定位置上的杂交信号判定基因突变的类型。结果：HBeAg( )和抗HBe抗体( )两组患者中前C／C区变异的不同频率分别为慢性乙型肝炎患者(Chronic hepatitis B，CHB)25％和61％，HBV无症状携带者(Asymptomatic carrier，ASC)12％和55％，重症乙型肝炎(Severe hepatitis B，SHB)50％和58％；BCP区变异的不同频率分别为CHB20％和48％，ASC11％和45%，SH75％和75％。3例服用lamivudine的患者半年后有2例发生P区变异(YMDD→YIDD)。结论：DNA芯片检测HBV基因多态性具有较好的灵敏度和重复性，操作简便，易于临床推广应用；前C／C区和BCP区变异可能是HBeAg(—)患者HBV感染的两大主要原因，且与肝炎慢性化、重症化有密切关系。     

痘苗病毒寡核苷酸检测芯片的设计及研制

目的 对痘苗病毒进行寡核苷酸检测芯片的初步研究，为建立寡核苷酸芯片检测该类病毒提供初步研究依据。方法 根据痘苗病毒特异基因设计寡核苷酸探针，人工合成探针后制备寡核苷酸芯片。在病毒感染的不同阶段提取病毒样品DNA及阴性样品DNA，采用限制性显示技术标记，标记样品与芯片杂交后，用Agilent芯片扫描仪检测杂交结果。结果 芯片与病毒样品杂交有较强的杂交信号，而与阴性样品杂交除阳性探针外均无信号。结论 病毒样品与阴性样品杂交信号区别明显，在病毒感染的各个时段也都有明显的杂交信号，反映了寡核苷酸芯片具有较高的特异性和灵敏度。     

杭州地区部分乙型肝炎患者HBV基因型分析

目的了解浙江杭州地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布,初步评价基因芯片技术在HBV基因分型中的应用特点。方法设计多条寡核苷酸探针,用点样仪将探针固定于芯片特定位置上,并与PCR扩增的106例HBV感染者血清HBV基因相应区段杂交,经过显色反应,分析杂交结果,判定基因类型。结果106例HBV感染者中,基因型B者37例,占34.91%,基因型C者69例,占65.09%,未发现其他基因型。结论杭州地区存在HBV基因型B、C型,基因型A、D、E、F是否存在须扩大样本,进一步深入研究。基因芯片技术在同类检测方法中具有灵敏、准确、快速的优势,适用于临床。     

痘苗病毒寡核苷酸检测芯片的设计及研制

目的对痘苗病毒进行寡核苷酸检测芯片的初步研究,为建立寡核苷酸芯片检测该类病毒提供初步研究依据。方法根据痘苗病毒特异基因设计寡核苷酸探针,人工合成探针后制备寡核苷酸芯片。在病毒感染的不同阶段提取病毒样品DNA及阴性样品DNA,采用限制性显示技术标记,标记样品与芯片杂交后,用Agilent芯片扫描仪检测杂交结果。结果芯片与病毒样品杂交有较强的杂交信号,而与阴性样品杂交除阳性探针外均无信号。结论病毒样品与阴性样品杂交信号区别明显,在病毒感染的各个时段也都有明显的杂交信号,反映了寡核苷酸芯片具有较高的特异性和灵敏度。     

基因芯片检测HBV DNA聚合酶区基因多态性

目的 :建立基因芯片检测HBVDNA聚合酶区基因多态性。方法 :PCR扩增HBVDNAP区nt45 5～ 796片断 ,与预制的基因芯片杂交 ,运用激光共聚焦荧光检测系统扫描芯片分析基因突变类型。结果 :芯片检测HBVDNAP区变异具有较好的特异性和准确性 ;初步应用显示 :慢性乙肝组nt5 2 8和nt5 5 2位点突变率分别为 8.6%和 9.6% ,而无症状肝炎组和重症肝炎组突变率均为 0 ;拉米夫定治疗组与非拉米夫定治疗组比较 ,nt5 2 8突变率分别为 10 .5 %和 8.1% ,nt5 5 2突变率分别为 15 .8%和 8.1%。结论 :HBVDNA聚合酶区基因多态性分布与病情轻重无关 ,而与病程慢性迁延有关 ;拉米夫定在耐药突变中发挥了重要作用 ;基因芯片检测乙肝患者耐药基因有其临床应用价值。     

乙型肝炎病毒基因多态性检测芯片的临床应用

目的:评价临床应用乙型肝炎病毒(HBV)基因多态性芯片(中科院上海微系统和信息技术研究所等研制),检测HBV基因前C区1896、1814,基本C区启动子(BCP)1762和1764,P区的YMDD基序552位等的点突变的效能。方法:以该芯片检测49例不同临床类型乙型肝炎病人血清,并对部分血清的PCR扩增产物进行测序分析。结果:HBV前C区1896位在血清HBeAg阳性病例中,野生株、混合(野生/突变)株、突变株和未确定(无杂交信号)的检出率,分别为57.7％,38.5％,0和3.8％;血清抗HBe阳性病例中,相应为33.3％,22.2％,33.3％和11％,后者突变株显著高于前者(P<0.01)。所有病例HBV前C区的1814位均为野生,未检出突变。BCP 1762和1764双突变在慢性重型肝炎和肝炎肝硬化的检出率分别为66.7％和69.2％,显著高于慢性肝炎的19%(P<0.01)。10例拉米夫定治疗6月以上,HBV DNA仍阳性者中,7例检出P区YIDD或YVDD突变,1例兼有YIDD和YVDD突变,余2例无杂交信号。7例1 896,4例BCP,6例YMDD的测序和芯片检测结果一致,6例无信号位点的测序结果显示,这些位点附近,出现了与杂交探针错配的突变。结论:初步结果提示,该芯片适用于临床检测HBV前C区、P区一些已知热点的突变,并可用于研究这些突变与疾病严重性,及产生抗HBV药物耐药间的相互关系。     

HBV变异对乙肝病毒标志物和DNA定量的影响

目的：了解无锡地区HBV前C／C基因变异情况,探讨基因变异对乙肝病毒标志物（HBVM）及HBV DNA定量的影响。方法：HBVM用时间分辨荧光定量试剂检测;HBV DNA定量PCR以德国Roche Lightcycler荧光定量扩增仪检测;HBV DNA前C／C测序使用①德国Roche Mag NA Pure LC全自动核酸提取,加样系统;②美国Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analysis System。结果：92例乙肝患者血清中有41例（44．6％）发生前C／C区nt1896位变异,41例中有34例HbeAg阴性,7例HbeAg仍为阳性;以nt1896位是否变异分组,变异组和未变异组HBV DNA定量无显著性差异。结论：nt1896位变异导致HBeAg转阴,HBV病毒变异对HBVM有决定性的影响,但该变异对HBV复制无影响。     

DNA芯片分析乙型肝炎病毒基因多态性简便方法研究

目的 建立一种简便方法,用于乙型肝炎病毒基因(HBV DNA)多态性分析.方法 将标记生物素的dUTP在双重聚合酶链反应(PCR)时掺入DNA样品目的断片,并将目的断片杂交于含HBV核苷酸序列(1896、1814、1762、1764、P区552)的野生型及突变型探针的DNA芯片上,用亲和素-碱性磷酸酶进行显色,并转印于尼龙膜上,再用光学扫描仪读取结果.结果 42例乙型肝炎患者HBV核苷酸序列1896、1814、1762、1764、P区552位点突变率分别为40%、31%、50%、50%、10%;该法检测敏感度为5.6×102病毒拷贝数/毫升;特异性高;强、弱阳性批内变异系数(CV)分别为15.1%和19.8%.结论 生物素-亲和素系统用于HBV DNA多态性芯片显色,该法简便,不需特殊设备,易于推广应用.     

梅毒螺旋体寡核苷酸芯片探针的设计及筛选

【目的】设计梅毒螺旋体寡核苷酸探针,筛选出适合芯片检测的高敏感性和特异性寡核苷酸探针。【方法】根据梅毒螺旋体特异基因设计寡核苷酸探针,人工合成探针后制备寡核苷酸芯片。提取梅毒螺旋体的DNA,采用通用引物联合标记法进行标记,标记样品与芯片杂交,用芯片扫描仪检测杂交结果。【结果】设计出23条50 mer梅毒螺旋体寡核苷酸探针。标记样品与芯片杂交部分探针有较强的杂交信号,并筛选出符合要求的9条梅毒螺旋体寡核苷酸探针。【结论】以上方法能设计和筛选出敏感性和特异性较高的梅毒螺旋体寡核苷酸探针,可用于制备梅毒螺旋体寡核苷酸芯片。     

寡核苷酸芯片在细胞因子及其受体单核苷酸多态性检测中的应用

目的建立检测细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-10、转化生长因子(TGF)-β1、IL-4、IL-6及其受体单核苷酸多态性位点的寡核苷酸芯片,通过测序等方法评价其性能。方法根据相关文献、参照NCBI的SNP数据库和NCI的SNP 500 Cancer数据库,选取临床上有意义的细胞因子及其相应受体单核苷酸多态性位点基因和相应序列,设计寡核苷酸探针59条,基因组DNA通过多重多聚酶链反应(PCR)扩增,Cy5标记。标记后的产物与芯片上探针杂交,激光扫描,荧光信号值分析,判断各位点的基因型,并通过测序验证。结果130份外周血样,除10份因时间过久,没有PCR产物外,余120份均检测成功,3次重复检验无差异,测序验证无位点错误。结论寡核苷酸芯片技术检测细胞因子及其受体单核苷酸多态性位点,具有特异性高、敏感性高、重复性好、高通量、操作简便等优点,是一种较为理想的方法。     

荧光偏振检测HBV DNA C区BCP双突变

目的：建立简便、灵敏的HBV DNA序列中BCP双突变点的检测方法．方法：采用终点终止法和偏振光检测技术进行点突变的检测．首先对HBV C区基因进行PCR扩增，然后用特异探针与扩增产物中待测核苷酸的下游序列杂交，使探针的3’端可以在DNA聚合酶的催化下，依据其互补链上的待测核苷酸连接上一个标有特定荧光素的ddNTP，然后检测该3’端带有荧光素的探针，根据检测到的荧光素种类和偏振光的强度可以判定待测点是何种核苷酸．结果：该方法可以检测出HBV基因序列中BCP双突变核苷酸类型以及检测1个拷贝的模板，并且可以从BCP野性株DNA序列中检出5％BCP双突变DNA序列．结论：该技术可以检测血清中HBV DNA C区BCP双突变．     

HBV DNA PreC/C和BCP片段基因多态性及临床意义

目的 :分析乙肝患者 HBV DNA前 C/ C区和基本核心启动子区部分 DNA片断突变。方法 :PCR扩增HBV DNA nt1735～ 196 5片段 ,将产物进行 HBV DNA测序。结果 :在 6 8例乙肝患者中 ,突变阳性率 4 8.5 % ,点突变16 8个 ,频率前 10位的是 nt176 4、176 2、1799、176 6、1896、175 4、1899、176 8、1814及 1913,还检出鲜见报道的 192 3、192 2、190 7等点突变。慢性肝炎 5 4例和肝炎肝硬化 10例 HBV DNA nt1896、176 4、176 2点突变阳性数分别为 9、19、19和 3、19、19,两者差异有极显著性 (P<0 .0 1)。结论 :前 C/ C区与基本 C区启动子区基因突变可能与肝实质纤维化相关 ,HBV DNA突变发生率较高 ,且位点众多 ,基因测序对芯片探针设计有着十分重要的指导价值和临床意义     

三种荧光标记法对寡核苷酸芯片杂交信号的影响

目的 观察标记引物法、随机渗入标记法、末端转移标记法三种荧光标记法对寡核苷酸芯片杂交信号的影响。方法 将淋球菌gyrA基因91位密码子突变型探针倍比稀释成终浓度为1000／μmol／L～0．25μmol／L的梯度浓度点样并制作寡核苷酸芯片，PCR扩增荧光标记包含gyrA基因突变的目的DNA片段，与芯片杂交，分别记录三种标记方法的杂交信号强度。结果 标记引物法的荧光信号最强，随机渗入标记法的荧光信号强度次之，其Cy5—duTP最佳浓度为0．1mmol／L(dTTP：Cy5—dUTP=10：1)，末端转移标记法反应时间在60min和120min时荧光信号值相近。点样的探针浓度达到31μmol／L，以上，荧光信号为平台期。结论 明确了三种荧光标记法对寡核苷酸芯片杂交信号的影响，有助于选择寡核苷酸芯片的荧光标记方法。     

乙肝病毒基因分型与HBV—DNA水平及HBeAg之间关系的探讨

目的：探讨HBV基因型与HBV—DNA水平及HBeAg之间关系。方法：对85例表面抗原阳性患者进行基因分型、HBV—DNA水平的检测及ELISA法检测HBeAg后进行分析。结果：基因分型为B型9例，C型70例，BC混合型1例，未分型5例。烟台地区HBV基因型以C型为主，占82．3％（70／85）。C型HBV—DNA水平及HBeAg阳性率分别为92．8％（65／70）、62．9％（44／70）.C型HBV—DNA水平显著高于B型，C型HBeAg阳性率明显高于B型。结论：烟台地区HBV基因型主要以C型为主，B型次之，在慢性乙型肝炎患者中性别不是基因型构成差别的因素。C基因型肝脏损害比B型重。     

利用寡核苷酸芯片检测SARS病毒

目的：利用寡核苷酸芯片检测SARS病毒。方法：根据序列Blast比对分析结果，设计逆转录不对称PCR扩增引物和寡核苷酸检测探针。采用Trizol试剂从人静脉血中提取总RNA，经过逆转录和不对称PCR扩增得到的PCR产物与排列有寡核苷酸探针的芯片杂交，杂交后的芯片经激光共聚焦扫描分析。结果：SARS阳性样品与寡核苷酸芯片杂交后出现阳性杂交信号，具有不同二级结构的寡核苷酸探针杂交信号强度不一。结论：寡核苷酸芯片适于快速准确、平行大量地检测SARS病毒。     

利用寡核苷酸芯片快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因突变

目的:开发快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB寡核苷酸突变的基因芯片。方法:根据结核杆菌rpoB基因序列设计探针和引物并制备基因芯片,从临床痰标本中提取结核菌的基因组DNA,PCR扩增含有rpoB基因突变位点的特异DNA片段,荧光标记后与芯片上的特异性寡核苷酸探针进行杂交,同时与DNA测序法比较。结果:22株临床痰标本有18株可用寡核苷酸芯片检测出来,正确率可达82%;患者痰液中少量DNA足够进行芯片检测,无须细菌培养。结论:利用寡核苷酸芯片检测结核菌对利福平的耐药性具有较高的准确性和敏感性,可以应用于临床耐药性诊断。     

宫内感染乙型肝炎病毒的新生儿及其母亲HBV基因结构分析

目的：探讨HBV基因变惜民宫内感染的关系。方法：扩增2对发生宫内感染的新生儿及母亲血清中2．5kb HBV DNA，克隆、测序并分析其基因结构。同时用免疫染色法检测孕妇胎盘组织HBsAg。结果：母婴HBV DNA序列中，前S1、前S2和S区都发生突变并且导致相应编码蛋白的氨基酸组成发生改变，其中以前S2区突变率为最高（P＜0．01）；而前C、C区基因只有少数核苷酸发生沉默突变、孕妇胎盘组织各层细胞中均有HBsAg阳性信号。结论：新生儿HBV的细胞源性宫内感染可能主要与HBV突变 有前S／S区的基因变异有关，而前C／C区相对比较保守，未见明显相关。     

用Taqman MGB探针研究中国人群TNF-α基因启动子区单核苷酸多态性

 【目的】了解中国人群肿瘤坏死因子α（the tumour necrosis factor α，TNF-α）基因启动子区多态性。【方法】 随机选取20名深圳地区汉族健康体检者，采用两对引物PCR扩增TNF-α基因启动子区（-1389nt～＋125nt），对PCR产物进行序列分析，寻找单核苷酸多态性位点（single nueleofide polymorphisms，SNPs）。采用Taqman MGB探针建立了-857nt（C／T）位点的实时定量PCR（thereal-time PCR）分型方法，并对中国汉族、壮族、布依族，水族及苗族群体共l108份样本进行了基因分型。【结果】在启动子区（-1322nt～＋67at），发现6个SNP位点，即-885（A／G）、-863（C／A）、-646（G／A）、-648（G/A）、-568（G／C）和-857（C/T），其中位点-646nt（G→A）为新发现SNP。-885、-648及-568nt位点碱基虽然与Genbank不同，但测序的20个个体基因分型相同。中国人群-857nt（C／T）位点基因型频率分别为0．79（CC），0．19（CT）和0．02（TT），中国汉族、壮族、布依族，水族及苗族群体间无显著性差异。中国人群-857T等位基因频率为0．116，与文献报道的韩国人群相同，但比日本人群低。【结论】中国人群TNF-α基因启动子区单核苷酸多态性可能较保守。采用Taqman MGB探针实时定量PCR技术对SNPs进行基因分型简便、快速及准确，易于自动化，为大规模的疾病相关性研究提供了有效的工具。     

应用错配PCR和限制性片段长度多态性分析技术检测HBV YMDD变异株

目的：建立简便易行的检测乙型肝炎病毒（HBV）多聚酶基因（P基因）上YMDD变异株的方法，评价运用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患对此变异的影响，方法：采用套式／错配聚合酶链反应（PCR）结合限制性片段长度多态性（RFLP）分析技术对108例治疗前HBV DNA（PCR）阳性正在拉米夫定治疗中的慢性乙型肝炎患者的HBV YMDD变异情况进行检测。结果：运用上述技术能有效区分HBV YMDD野生株和变异株，上述108例患者经拉米夫定治疗后，HBV DNA阴转者63例（58．3％），HBV YMDD野生株和变异株分别为23例（21．3％）和22例（20．4％），结论：建立的套式／错配PCR－RFLP分析技术可用于HBV YMDD变异株的临床监测，拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者可导致部分患者的HBV多聚酶基因上YMDD发生变异。