重组粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞对大鼠脑出血后脑水肿的影响

目的:国内外研究报道,重组粒细胞集落刺激因子可以动员骨髓干细胞向脑梗死病损部位迁徙,减轻脑缺血后的脑水肿和脑损伤,但是,国内关于该类药物对脑出血后脑水肿影响的报道鲜见.观察重组粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞对大鼠脑出血后脑水肿及血肿周边区脑组织基质金属蛋白酶9表达的影响.方法:实验于2006-03/11在泸州医学院中心实验室进行.①实验材料:健康雄性SD大鼠144只,体质量(300±20)g,由泸州医学院动物科提供.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:将大鼠随机分为假手术组、脑出血组、治疗组,48只/组.脑出血组和治疗组参照Yang的方法,采用断尾取自体血方式制备大鼠脑出血模型.假手术组用生理盐水代替自体血,其余条件与脑出血组一致.治疗组于造模1h后腹腔注射重组粒细胞集落刺激因子 60μg/kg.③实验评估:检测大鼠脑组织含水量,并采用免疫组织化学法检测大鼠脑组织基质金属蛋白酶9的表达.结果:144只大鼠中共有16只大鼠脱落,其中7只大鼠术后模型评价为0级,9只死亡.均在实验过程中予以补足.①脑出血组大鼠脑组织含水量明显高于假手术组(P < 0.05),脑出血组含水量在造模后48,72 h最明显,且与造模后6 h、12 h、24 h、7 d相比差异显著(P < 0.05).治疗组大鼠脑组织含水量明显低于脑出血组 (P < 0.05).②脑出血组大鼠脑组织基质金属蛋白酶9的表达明显高于假手术组(P < 0.05),在造模后48 h、72 h最明显,且与6 h、12 h、24 h 、7 d相比差异显著(P < 0.05).治疗组造模后各时间点基质金属蛋白酶9的表达低于脑出血组(P < 0.05).结论:重组粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞能下调脑出血后血肿周边组织基质金属蛋白酶9的表达,并减轻脑水肿的程度.     

人重组粒细胞集落刺激因子对大鼠脑出血周围区新生血管的影响

背景：研究表明人重组粒细胞集落刺激因子可动员内皮前体细胞，增加脑缺血区域新生血管生成。目的：观察人重组粒细胞集落刺激因子对大鼠脑出血周围区新生血管的影响。设计、时间及地点：随机分组设计的动物对照实验，于2006-03／11在泸州医学院中心实验室完成。材料：健康雄性SD大鼠72只，人重组粒细胞集落刺激凼子。方法：72只大鼠按随机数字表法分为3组，假手术组、脑出血组、治疗组，每组24只。断尾取自体血通过鼠脑立体定向仪注入鼠脑内制备脑出血模型，似于术组用生理盐水代替自体血。治疗组于制模后1h腹腔注射人重组粒细胞集落刺激因子60μg／kg。假于术组、脑出血组不做任何处理。主要观察指标：于6，12，24，48，72h，7d6个时间点检测血肿周围区CD34^＋血管的表达，母个时间点检测4只。利用内皮细胞的标志性抗原CD34变化了解微血管的生成情况，CD34抗原也越多，新生血管越多。结果：脑出血组CD34^＋血管数明显高于假手术组（P〈0．05）；治疗组CD34^＋血管数明显高于脑出血组（P〈0．05），且在72h增多明湿，与7d比较差异无显著性意义（P〉0.05），但与6，12，24，48h比较差异有显著性意义（P〈0．05）。结论：人重组粒细胞集落刺激因子能够促进脑出血后血肿周围新生血管生成。     

养心通脉有效部位方与急性心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞的动员及定向归巢

背景:急性梗死心肌修复过程中,寻找可有效提高外周血骨髓间充质干细胞的数量、并动员其定向归巢于损伤心肌的骨髓间充质干细胞动员剂尤为关键.目的:探讨养心通脉有效部位方对急性心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞动员入血及定向归巢于梗死心肌的影响.方法:养心通脉有效部位方主要成分包括人参皂苷、丹参酮ⅡA、总生物碱、人参多糖等,由中南大学药学院依课题组稳定的制作工艺制作提供.SD大鼠70只,取8只大鼠作为正常对照组,剩余62只大鼠建立急性心肌梗死模型.取造模成功的32只大鼠,随机分为养心通脉有效部位方组、复方丹参注射液组、重组人粒细胞集落刺激因子组、模型对照组,各组均于造模3 h后给与对应药物,连续5 d.流式细胞仪检测外周血CD34+细胞数,免疫组化染色检测梗死心肌边缘区CD34+细胞数.结果与结论:与模型对照组比较,重组人粒细胞集落刺激因子组、养心通脉有效部位方组外周血CD34+细胞数均明显增加(P < 0.01);心肌梗死边缘区胞浆CD34+细胞数均显著增加(P < 0.01).与重组人粒细胞集落刺激因子组比较,养心通脉有效部位方组心肌梗死边缘区胞浆CD34+细胞数显著增加(P < 0.01).养心通脉有效部位方能促进骨髓干细胞动员入血,并定向归巢于梗死心肌,其作用与重组人粒细胞集落刺激因子大体相当,在归巢CD34+细胞方面甚至强于重组人粒细胞集落刺激因子,是一种良好的骨髓间充质干细胞动员剂.     

重组人粒细胞集落刺激因子对实验性脑出血大鼠星形胶质细胞表达的影响

背景:星形胶质细胞是中枢神经系统的主要成分之一,具有对各种损伤产生强烈反应的特性,脑出血后星形胶质细胞大量表达、活性增强,这种由常态转变为反应性状态的星形胶质细胞的病理生理学意义是目前研究热点.目的:探讨重组人粒细胞集落刺激因子对脑出血后星形胶质细胞表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-03/11在泸州医学院中心实验室完成.材料:清洁级健康榷性SD大鼠50只,随机分为3组:假手术组10只、模型组20只、实验组20只.重组人粒细胞集落刺激因子为深圳新鹏生物工程有限公司产品.方法:模型组、实验组利用鼠脑立体定向仪、采用断尾取自体血法制备脑出血动物模型,假手术组用等量生理盐水代替自体血,余干预措施与模型组一致.造模1 h后,实验组大鼠腹腔注射重组人粒细胞集落刺激因子60 μg/kg,余2组未注射任何物质.主要观察指标:分别于干预后6 h,24 h,48 h,72 h,7 d采用免疫组织化学ABC法检测胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的表达.结果:假手术组未见胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的表达.模型组干预6 h即有少量胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达,48 h后开始增多,至72 h胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数量达高峰(P＜0.05),7 d后仍有大量胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达,但较72 h时有所减少.实验组干预6 h时胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的表达与模型组相似,干预24 h,48 h,72 h,7 d时胶质纤维酸性蛋白阳性细胞较模型组明显减少(P＜0.05),细胞变形程度减轻.结论:重组人粒细胞集落刺激因子能够抑制脑出血后星形胶质细胞的过度活化,可能对损伤脑组织重建和功能恢复起重要作用.     

重组人粒细胞集落刺激因子修复大鼠动脉损伤

背景:有研究显示大鼠皮下注射粒细胞集落刺激因子后,外周血CD34 细胞明显增高。并发现运用粒细胞集落刺激因子不仅动员了骨髓干细胞,而且加速损伤血管段的再内皮化,抑制了新生内膜增生。目的:观察重组人粒细胞集落刺激因子对大鼠损伤动脉的再内皮化及抑制新生内膜增生作用。设计:随机对照动物实验。单位:南京医科大学附属南京第一医院。材料:实验于2005-12/2006-04于南京市第一医院完成。选用40只雄性SD大鼠,8～12周龄SPF级,体质量200～250g,购于国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心。重组人粒细胞集落刺激因子购于山东齐鲁制药有限公司,2F动脉取栓导管购于Edwards Lifesciences公司,CD34单克隆抗体、CD45单克隆抗体购于联科生物有限公司。方法:用Excel软件随机将大鼠分成治疗组及对照组,每组20只。治疗组给予皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(100μg/kg),1次/d,共8d。对照组皮下注射等量生理盐水,1次/d,共8d。治疗5d后,腹腔注射麻醉大鼠,颈外动脉做一切口,将2F动脉取栓导管插入至左颈总动脉分叉处,注入200μL空气使球囊扩张,然后回拉球囊至肩胛舌骨肌处,回抽空气后重新送回导管,反复3次后拔出导管,结扎颈外动脉。①治疗前和治疗5d后,所有大鼠均取1mL静脉血进行白细胞和CD34 细胞计数。②球囊损伤后14和28d,每组分别麻醉后处死大鼠10只,取左颈总动脉。每组各5只用于暴露动脉内膜腔,应用图形分析软件计算再内皮化面积,再内皮化面积=未被伊文氏蓝着色区域/损伤总面积;每组另有5只,取左颈总动脉,取血管横切面,经HE染色后用图像分析软件计算新生内膜与中膜比(I/M),评估新生内膜增生程度。③采用免疫组化方法检测血管内膜CD31 与vWF (Ⅷ因子)细胞,推测损伤后内皮修复程度。主要观察指标:①大鼠外周血白细胞及CD34 细胞表达。②球囊损伤后血管再内皮化程度。③新生内膜增生程度(新生内膜与中膜比)。④血管内膜CD31 与vWF (Ⅷ因子)细胞检测结果。结果:纳入SD大鼠40只均进入结果分析。①外周血白细胞及CD34 细胞表达:治疗5d后,治疗组大鼠白细胞总数高于对照组[(27.60±2.45)×109L-1,(10.11±1.81)×109L-1,P<0.01],CD34 细胞数量高于对照组(38.31×107L-1,3.14×107L-1,P<0.01)。②血管再内皮化程度:球囊损伤后14和28d,治疗组再内皮化面积分别为(68.3±8.3)%,(97.6±4.1)%,高于对照组[(33.8±6.3)%,(76.1±5.2)%,P<0.01]。③新生内膜增生程度:球囊损伤后14,28d,治疗组新生内膜与中膜比分别为0.39±0.11,0.45±0.09,均低于对照组(0.87±0.15,1.26±0.16,P<0.01),治疗组血管新生内膜增生程度被显著抑制。④血管内膜CD31 与vWF (Ⅷ因子)细胞检测:球囊损伤后28d,治疗组血管内膜被接近于连续完整的CD31 与vWF 细胞覆盖,对照组血管内膜仅见零星、分散的CD31 与vWF 细胞。结论:重组人粒细胞集落刺激因子可促进大鼠血管损伤后外周血中CD34 细胞表达及血管内膜再内皮化,抑制新生内膜增生。     

骨髓干细胞动员与缺血心肌血管再生

目的:探讨动员急性心肌梗死大鼠骨髓干细胞归巢于梗死心肌后实现血管再生的能力。方法:实验选用10～12周龄的雄性Wistar(清洁级)大鼠60只,随机分为3组:急性心肌梗死+动员组、急性心肌梗死组及对照组,每组20只。结扎Wistar大鼠左冠状动脉制作心肌梗死模型,用骨髓干细胞动员剂粒细胞集落刺激因子动员自体骨髓干细胞释放并归巢于心肌梗死灶,于造模后24,48h和4周杀死大鼠,取出心脏,通过免疫组化方法观察心肌梗死灶、边缘区和正常心肌组织CD34阳性细胞、血管内皮生长因子及其受体的表达,以及VIII因子表达,并应用流式细胞术比较动员前后外周血中CD34阳性细胞数量的变化。结果:急性心肌梗死+动员组大鼠造模24h,4周后外周血CD34细胞数量分别为(0.919±0.187)%,(0.834±0.110)%,明显高于造模前犤(0.043±0.023)%犦及心肌梗死组大鼠造模24h,4周后犤(0.071±0.104)%,(0.062±0.296)%犦(t=2.697,2.354,2.492,2.195,P<0.05)。急性心肌梗死+动员组大鼠心肌梗死区可见CD34阳性细胞浸润;制模后4周,急性心肌梗死+动员组微血管新生数明显多于急性心肌梗死组和对照组(t=3.125,3.308,P<0.01)。急性心肌梗死+动员组大鼠梗死灶及周围组织中血管内皮生长因子及其受体的表达量均明显高于急性心肌梗死组及假手术组(t=2.099～3.398,P<0.05)。结论:骨髓干细胞动员的方法在大鼠急性心肌梗死模型中,能通过动员内皮干细胞归巢于梗死灶内,有效促进微血管形成;还通过上调血管内皮生长因子及其受体的表达,促进血管再生,促进缺血心脏功能恢复。     

重组人粒细胞集落刺激因子动员急性心肌缺血大鼠自体骨髓干细胞归巢缺血心肌的短期安全性评价

背景:骨髓中存在多潜能干细胞,利用其多向分化和归巢的能力,已成为近年来多种疾病治疗的研究方向.目的:观察重组人粒细胞集落刺激因子动员急性心肌梗死大鼠骨髓干细胞归巢于缺血心肌的高度选择性,并评价其短期安全性.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-09/2007-04在占林大学基础医学院病理生理实验室完成.材料:选取清洁级SD大鼠82只,雌雄各半,体质量250～300g,62只大鼠结扎冠状动脉前降支制成急性心肌梗死模型,20只作为假手术组.方法:造模成功41只,分为模型组(n=20)和动员组(n=21).模型组:皮下注射生理盐水2mL/d,连续7d:动员组:皮下注射生理盐水稀释至浓度2.5 mg/L重组人粒细胞集落刺激因子15 μg/(kg·d),连续7 d.假手术组:在相应冠状动脉结扎部位穿线,不结扎,其余操作步骤相同,皮下注射生理盐水2 mL/d,连续7 d.主要观察指标:1周后计数3组大鼠外周血白细胞及单个核细胞百分比,4周后比较3组大鼠存体心功能.并取大鼠心脏、肺脏、肝脏、骨骼肌组织制切片行苏木精-伊红染色及CD34免疫组织化学染色观察心脏组织病理改变,毛细血管密度和CD34+细胞归巢情况.结果:①造模1周后动员组大鼠的外周血白细胞及单个核细胞百分比较动员前明显增加(P＜0.05),且动员组大鼠的外周血白细胞计数及微核细胞率明显高于模型组(P＜0.05).⑦造模1周时.动员组较模犁组大鼠心肌梗死区可见较多CD34+细胞(P＜0.05);4周时,动员组和模型组均末见CD34+细胞.各组大鼠肝脏、肺脏及骨骼肌各个时段则均无明显差异.造模后4周,动员组心功能各项指标均优于模型组(P＜0.05),梗死面积明显小于模型组(P＜0.05),毛细血管密度明显高于模型组(P＜0.05).结论:重组人粒细胞集落刺激因子动员心肌梗死后大鼠自体骨髓十细胞到外周血循环并归巢于梗死心肌,并可分化成心肌样细胞及毛细血管内皮细胞,减少心肌梗死范围,改善心功能.短期观察重组人粒细胞集落刺激因子对肺脏、肝脏、骨骼肌无明显组织学影响.     

粒细胞集落刺激因子动员对大鼠内皮祖细胞体外扩增的影响

背景:内皮祖细胞在缺血性疾病治疗应用中存在数量低的问题,许多细胞因子影响其动员效果和功能。目的:观察粒细胞集落刺激因子动员对体外扩增骨髓源性内皮祖细胞数量及功能的影响。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-08/2008-03在北京大学人民医院肝病研究所完成。材料:SPF级健康成年SD雄性大鼠16只,随机分为动员组和对照组,8只/组。重组人粒细胞集落刺激因子为麒麟鲲鹏生物药业有限公司产品。方法:实验前动员组大鼠皮下注射经生理盐水稀释的重组人粒细胞集落刺激因子10μg/kg,2次/d,共5d。采用密度梯度离心法分别从两组大鼠骨髓获取单个核细胞,洗涤后按2×107/孔接种在包被大鼠纤连蛋白的6孔板上,采用贴壁法纯化得到内皮祖细胞。主要观察指标:骨髓单个核细胞集落数及细胞表型,骨髓源性内皮祖细胞贴壁情况及细胞表型,通过DiI-acLDL摄取、体外血管生成进行内皮祖细胞功能学鉴定,透射电镜观察细胞超微结构。结果:与对照组比较,动员组骨髓单个核细胞集落增多,CD45 /CD34 、CD133 和Flk-1 阳性率均明显升高(F=5.655~61.892,P<0.05)。培养第7,9天与对照组比较,动员组骨髓源性内皮祖细胞贴壁数、CD45 /CD34 、CD133 和Flk-1 阳性率均明显升高(F=5.694~38.879,P<0.05)。贴壁细胞F1TC-UEA-1/Dil-acLDL双荧光染色阳性率为90%,接种于Matrigel包被的培养板24h后形成毛细血管索样结构,胞质内有Weibel-Palade小体存在。结论:粒细胞集落刺激因子动员能增加骨髓源性内皮祖细胞的数量,并促进其分化、增殖功能。     

清开灵注射液联合血肿抽吸对家兔脑出血后脑水肿的影响

目的 探讨脑出血血肿抽吸术后的合理用药.方法 以二次注血法建立家兔脑出血模型,进行血肿抽吸术和清开灵干预,干、湿重法测定脑组织含水量.结果 手术组6 h的脑组织含水量与对照组及模型组相比均增高(t=5.72,3.23,P<0.05),24 h达到高峰,之后开始下降,3 d、7 d与模型组相比显著下降(t=16.55,8.81,P<0.05),治疗组脑组织含水量在24 h和3 d与手术组相比显著下降(t=3.93,5.05,P<0.05).结论 家兔脑出血血肿抽吸术后早期应用清开灵注射液能明显减少脑组织含水量,减轻脑水肿.     

超声破坏微泡联合粒细胞集落刺激因子促进大鼠心肌血管新生的实验研究

目的 探讨超声破坏微泡联合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)促进大鼠心肌血管新生的有效性.方法 40只健康成年Wistar大鼠随机分为4组.A组在超声微泡治疗前一天行G-CSF皮下注射预处理;B组仅行超声微泡治疗;C组仅行G-CSF皮下注射;D组为对照.于治疗后2周取材,HE染色光镜观察心肌结构变化,免疫组化法检测心肌组织中VEGF及CD34表达,评定心肌血管新生疗效.结果 A组心肌中有大量VEGF和CD34表达,新生血管较多;B组心肌中有部分VEGF和CD34表达,新生血管相对较少;C组及D组仅有极少量VEGF和CD34表达,未见明显新生血管.结论 超声微泡可刺激心肌内源性VEGF分泌,促进心肌血管新生,G-CSF能明显增强其血管新生作用.