定量聚合酶链反应技术及在临床实验室应用的价值

随着分子生物学技术的发展 ,聚合酶链反应 (ＰＣＲ)技术已逐渐应用于遗传性疾病、肿瘤及感染性疾病等方面的诊断 ,如检测临床标本中病原体核酸序列、肿瘤基因突变情况、遗传性疾病的基因序列、人类白细胞表面抗原 (ＨＬＡ)配型、法医学方面的鉴定工作等。目前基因芯片的问世 ,将分子生物学技术又推向一个新的高潮。现就临床实验室开展ＰＣＲ技术及ＰＣＲ技术检测病原微生物及肿瘤基因的临床意义和定量ＰＣＲ技术 ,谈谈我们的看法。1.目前国内临床实验室应用ＰＣＲ技术存在的问题 :在设施方面 ,如仪器显示的温度与孔内的温度不一致 ,有孔内差…     

聚合酶链反应方法学进展及临床价值的评估

聚合酶链反应方法学进展及临床价值的评估张正聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法为１９８４年美国ｃｅｔｕｓ公司人类遗传研究室Ｍｕｌｌｉｓ等创建的ＤＮＡ体外扩增技术。次年，Ｓａｉｋｉ等将其完善成一套实验室技术￣［１］，３年后完成了自动操作检测。ＰＣＲ技术在遗传病诊...     

套式聚合酶链反应单管法检测单纯疱疹病毒

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法、套式ＰＣＲ双管法及套式ＰＣＲ单管法分别检测１３０份散发性脑炎患者脑脊液（ＣＳＦ）中单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）的ＤＮＡ，阳性率依次为１８．５％（２４／１３０）、２９．２％（３８／１３０）、２９．２％（３８／１３０）；６０份非中枢神经系统感染者ＣＳＦ标本的检测阳性率分别为０、３．３％（２／６０）、０。结果显示：套式ＰＣＲ虽然提高了检测的敏感性，但假阳性也大大增加。改良的套式ＰＣＲ单管法则大大减少了污染机会，使操作更方便、省时，适于临床推广应用。     

套式聚合酶链反应结合直接荧光法检测女性生殖道沙眼衣原体

目的建立一种敏感、特异、快速诊断女性生殖道沙眼衣原体（ＣＴ）感染的方法。方法应用套式聚合酶链反应（ＮＰＣＲ）技术和直接荧光（ＤＦＡ）法检测女性生殖道沙眼衣原体。对两者结果不符的标本用细胞培养法验证。结果３００份受检标本，ＤＦＡ法阳性７１份，阴性２２９份，ＮＰＣＲ法阳性９０份，阴性２１０份；其中ＮＰＣＲ和ＤＦＡ均为阳性者６８份，另有２２份ＮＰＣＲ阳性，而ＤＦＡ为阴性，再经细胞培养证实系阳性。但另有３份ＤＦＡ阳性，ＮＰＣＲ却为阴性，再经细胞培养证实亦属阳性。综合ＮＰＣＲ与ＤＦＡ并对照细胞培养，结果显示ＮＰＣＲ的敏感性为９６７％（９０／９３），特异性为１００％（２０７／２０７），ＤＦＡ的敏感性为７６３％（７１／９３），特异性为１００％（２０７／２０７）。结论ＮＰＣＲ技术与ＤＦＡ法检测ＣＴ感染，均具有高度特异性、操作简便等优势；ＮＰＣＲ的敏感性优于ＤＦＡ法；ＤＦＡ法具有费用低、重复好的特点。两法结合起来检测ＣＴ，将获得理想的检测效果。     

PCR在常规实验室中应适当降温

ＰＣＲ在常规实验室中应适当降温童明庆（江苏省人民医院检验科，南京２１００２９）聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术是近年来发展起来的ＤＮＡ体外扩增技术。应该承认，该技术的创建在分子生物学研究和基因实验诊断方面提供了一个较为先进的手段。最近，江苏省临床检验中心在...     

双温PCR法检测淋巴细胞白血病微小残留病

免疫球蛋白重链（ＩｇＨ）重排可作为Ｂ淋巴系肿瘤的基因标志，应用ＰＣＲ方法检测此重排可进行淋巴细胞白血病微小残留病（ＭＲＤ）的研究。我们通过基因释放剂提取ＤＮＡ及双温ＰＣＲ循环，建立一种快速可靠ＰＣＲ方法检测３８例淋巴细胞白血病ＩｇＨ重排基因，２８／３８（７３．７％）阳性，敏感度为１０￣（－４）～１０￣（－５）水平。此方法简便、快捷且成本低，更适于临床检测实际需要。     

改进聚合酶链反应检测方法提高结核分枝杆菌检出率

改进聚合酶链反应检测方法提高结核分枝杆菌检出率张捷，李小英，寇丽筠各种聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测临床标本的结核分枝杆菌（ＭＴＢ）已被国内外公认是一个快速可靠的检测方法。我们应用ＰＣＲ方法和杂交技术期间发现尚有许多问题有待探讨。如应用该法对临床１８２份...     

结核分枝杆菌的检测及分子生物学技术应用评价

文中分析了几种传统的结核杆菌检测方法及分子生物学技术在结核分枝杆菌检测中的应用。ＰＣＲ技术具有快速、敏感和特异性高的优点，但结果的精确性在各实验室之间仍存在着差异，尽管如何，ＰＣＲ技术对结构分枝杆菌早期感染和ＭＤＲ结核病的直接检测，仍具有其独特的优势。同时，指出了影响ＰＣＲ结果精确性的因素，以及对新暴露的人群，在ＰＣＲ检测阳性、结核菌素试验和结核杆菌培养结果阴性的情况下，阴性预测值（ＮＰＶ）的研究     

样品处理与临床PCR检测

样品处理与临床ＰＣＲ检测江凌晓综述冯永清审校（第一军医大学附属珠江医院分子生物学实验室，广州５１０２８２）关键词聚合酶链反应样品处理聚合酶链反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）是检测特异性核酸片断的最敏感的方法之一。现已用于...     

应用PCR－SSP对异基因骨髓移植供受者HLA－DQA1位点的基因分型

为探索一种可靠性和灵敏性高的ＨＬＡⅡ类基因的配型方法，根据Ｏｌｅｒｕｐ提出的１６个特异性引物序列，用多聚酶链反应－序列特异性引物（ＰＣＲ－ＳＳＰ）方法，对ＤＱＡ＿１基因位点的多态性进行检测和分型，并与多聚酶链反应－序列特异性寡核苷酸探针杂交（ＰＣＲ－ＳＳＯＰＨ）及多聚酶链反应－单链构型多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）检测结果进行比较，获得了一致的分型结果。ＰＣＲ－ＳＳＰ可分辨出ＤＱＡ＿１位点的纯合体和杂合体等位基因，并能检测出单一碱基的点突变；它将ＰＣＲ扩增和检测两个步骤合并为一次完成，操作更简便、快速。并已将ＰＣＲ－ＳＳＰ方法成功地用于１５对异基因骨髓移植的供、受者的分型。ＰＣＲ－ＳＳＰ作为基因分型的有效技术，可为骨髓来源提供直接的科学依据。     

荧光信号引物PCR定量测定血清HCV—RNA的实验室评价

目的对Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ荧光标记ＨＣＶ定量ＰＣＲ方法进行实验室考核。方法２８例抗ＨＣＶ（＋）、定性ＰＣＲ（＋）的血清标本，用于重复性测定；２０例健康人血清用于正常值测定；５例定性ＰＣＲ（＋）和５例定性ＰＣＲ（－）标本用于Ａｍｐｌｉｓｅｍｓｏｒ和ｂｒａｎｃｈ－ＤＮＡ两种方法的比较。结果孔间变异系数（ＣＶ）为 ２０．６％，操作者间ＣＶ为 ４３．８％，批内 ＣＶ为 ６１．９％，批间ＣＶ为８５．１％。２０例健康人血清测定值均小于最小检测浓度，即１０２拷贝／ｍｌ。用Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ和ｂｒａｎｃｈ－ＤＮＡ两种方法对５ 例定性ＰＣＲ（－）标本测定，Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ和ｂｒａｎｃｈ－ＤＮＡ均为阴性；对５ Ｎ定性ＰＣＲ（＋）标本测定，Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ均为阳性，ＨＣＶ－ＲＮＡ的浓度为 ２． ５ × １０５拷贝 ／ｍｌ～ １． ７ ×１０６拷贝 ／ｍｌ， ｂｒａｎｃｈ－ＤＮＡ方法有 ２例未能检出。结论 Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ ＨＣＶ定量 ＰＣＲ方法特异性和灵敏度均好，可用于临床疾病的研究和抗病毒药物疗效的评估。由于批内、批间变异系数较大，试验与操作均应严格规范。     

套式聚合酶链反应检测巨细胞病毒的初步研究

目的建立套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）加限制性酶切分析方法检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）。方法在ＨＣＭＶ直接早期蛋白ＥｃｏＲＩＪＤＮＡ片段内，自行设计两对引物，建立套式ＰＣＲ检测ＨＣＭＶＤＮＡ，同时结合病毒分离检测临床标本。结果２３例新生儿肝炎综合征患儿中，１０例病毒分离及套式ＰＣＲ均阳性；１例病毒分离阴性，但套式ＰＣＲ阳性。对５８例妊娠早期孕妇血标本进行检测，套式ＰＣＲ阳性率为９％，病毒分离阳性率则为７％。结论套式ＰＣＲ加限制性酶切分析是一种临床检测ＨＣＭＶ的快速有效手段，值得临床推广。     

PCR技术检测的质控问题经验谈

ＰＣＲ技术检测的质控问题经验谈丁柳秦山华西医科大学附属第一医院传染科聚合酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）是一种选择性体外扩增核酸片段的方法，自从１９８４年Ｍｕｌｉｓ发明该技术后，取得了突飞猛进的发展，已在临床检测如感...     

不同裂解液处理支原体肺炎临床标本对聚合酶链反应的影响

不同裂解液处理支原体肺炎临床标本对聚合酶链反应的影响黄庆华，卢强，孙利炜，林万明我们在聚合酶链反应（ＰＣＲ）用于检测肺炎支原体（ＭＰ）ＤＮＡ的实验室研究的基础上，将该技术直接用于临床标本的检测研究中，发现ＭＰ纯培养物及支气管肺泡灌洗液（ＢＡＬＡｓ）模...     

RT—PCR检测肿瘤标志物PGP9.5

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术，以神经内分泌蛋白基因产物９．５（ＰＧＰ９．５）为肿瘤标志物，评价了这一检测系统的效果。琼脂糖凝胶电泳分析ＲＴ－ＰＣＲ产物发现神经母细胞瘤细胞株均为阳性，正常人外周血阴性，其敏感度达１个瘤细胞／１０＾７外周血多形核细胞。临床上测定３９例患儿外周血、骨髓及组织标本证实ＲＴ－ＰＣＲ检测ＰＧＰ９．５为一敏感特异的测定方法。     

聚合酶链反应检测解脲脲原体的研究

鉴于临床迫切需要建立特异、敏感、快速的实验诊断方法，从解脲脲原体（ＵＵ）基因组保守区域选择一对寡聚核甘酸引物建立检测ＵＵ的聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，扩增产物片段为１８６ｂｐ，同时采用ＰＣＲ法和培养法对５２份孕妇宫颈分泌物检测。结果ＰＣＲ检出率（７５％）明显高于培养法检出率（２９％），经统计学配对计数资料χ￣２检验有显著性差异（Ｐ＜０．０２５）。研究表明：ＰＣＲ具有特异、敏感、快速等优点，是临床检测ＵＵ切实可行的方法。     

静脉及心脑血栓性疾病抗活化的蛋白C的研究

为探讨抗活化的蛋白Ｃ（ＡＰＣＲ）及其基因型在中国人血栓性疾病的发病情况，用活化的部分凝血活酶时间（ＡＰＴＴ）以加和不加活化的蛋白Ｃ（ＡＰＣ）的比值（ＡＰＣ－ＳＲ）检测ＡＰＣＲ；用多聚酶链反应扩增因子Ⅴ第１０外显子（包含５０６位密码子）的２２０ｂｐ片段，再用限制性内切酶ＭｎｌⅠ消化检测其基因型。共检测了４６例静脉血栓和下肢动脉血栓，５８例心、脑梗塞，７４例冠心病及４０名正常人的ＡＰＣＲ及其基因型。结果表明血栓性疾病患者与正常人的ＡＰＣＲ无明显差异，亦没有发现与ＡＰＣＲ相关的基因型，提示ＡＰＣＲ很可能不是中国人血栓性疾病常见相关病因     

紫外线照射清除聚合酶链反应的污染

紫外线照射清除聚合酶链反应的污染王卓智王琰李振甫董志伟聚合酶链反应（ＰＣＲ）用于临床检测肿瘤、病毒、支原体、衣原体和细菌，具有极高的灵敏度，但ＰＣＲ扩增体系又很容易被污染，产生假阳性。利用紫外线照射可以清除ＰＣＲ污染，其原理是紫外线能诱导ＤＮＡ上相邻...     

细菌DNA的聚合酶链反应扩增及反相杂交初步分型

目的探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）加反相杂交技术在细菌ＤＮＡ检测中的应用。方法以１６ＳｒＲＮＡ基因为靶序列，设计引物及寡核苷酸探针，采用ＰＣＲ法加反相杂交检测标准菌株及临床标本的细菌ＤＮＡ。结果对２４株不同标准菌株进行ＰＣＲ扩增，均出现３７１ｂｐ长度的ＤＮＡ片段，敏感性试验可检测出１０－１２ｇ的细菌ＤＮＡ，与人类基因组ＤＮＡ、真菌及病毒无交叉反应；２２例血培养阳性标本及４例脑脊液培养阳性标本均扩增出３７１ｂｐ长度ＤＮＡ条带，反相杂交法区分革兰阳性／阴性细菌与培养结果相符。结论１６ＳｒＲＮＡ基因ＰＣＲ加反相杂交技术检测细菌ＤＮＡ，具有特异、敏感、快速、准确的特点，为细菌感染的临床诊断提供了科学的依据     

人乳头瘤病毒PCR产物酶标-微孔板杂交分型

目的建立聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物直接酶标记微孔板反向分子杂交法用于人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）型别鉴定。方法利用ＨＰＶ通用引物介导ＰＣＲ（ＧＰＰＣＲ）扩增靶ＤＮＡ，然后对产物直接标记辣根过氧化物酶复合物（ＨＲＰＰＥＩＱＩ），与预先包被在微孔板上的ＨＰＶ寡核苷酸探针杂交后酶显色法检测。结果ＨＰＶ各型之间无交叉杂交；杂交灵敏度可达１３～７６个病毒ＤＮＡ拷贝，比ＰＣＲ琼脂糖凝胶电泳检测高１０倍；该法重复性好，阳性孔批内ＣＶ为６．３４％，批间ＣＶ为１０．５３％，阴性孔批内ＣＶ为１％，批间ＣＶ为５．７９％；而且杂交影响因素较少。结论该法特异性强、灵敏度高、操作简便，无放射性和ＥＢ染料污染，杂交时间短、仪器读取结果，便于大量常规临床样本定性或定量检测。