脂质体介导ANG反义核酸对 A549 细胞作用的研究

目的：研究脂质体介导ANG反义核酸转染A549细胞后，对其中ANG蛋白表达的影响。探讨其作为抗血管生成与抗肿瘤药物的可行性。方法：用人工合成的人ANG反义寡聚核苷酸，以脂质体为载体转染人肺癌A549细胞，研究A549细胞在基因转染后，其ANG蛋白表达的变化。结果：脂质体转染程序优化后，得到最佳转染效率，免疫组化显示细胞内ANG蛋白表达明显减少，培养基ELISA检测显示每细胞分泌的ANG蛋白量与对照组相比有显著差异。结论：ANG反义寡聚核苷酸抑制A549细胞中ANG的表达，为体内研究提供了基础。     

RNAi沉默肺癌细胞中VEGF的表达治疗肺癌机制的初步研究

目的：探讨RNAi干涉沉默肺癌细胞中VEGF的表达治疗肺癌机制.方法：将pSilencerTM-3.1-VEGF分别稳定转染入人肺癌细胞株A549,建立稳转细胞系.通过RT-PCR检测Bcl-2和Bax的mRNA的水平.免疫印迹方法检测稳转的人肺癌细胞株A549中P53,Bcl-2和Bax的表达.流式细胞仪检测稳转的人肺癌细胞株A549细胞系的凋亡.结果：稳定转染pSilencerTM-3.1-VEGF的人肺癌细胞株A549细胞系中VEGF的表达明显下调.稳转的人肺癌细胞株A549细胞系中P53,Bcl-2和Bax的表达无明显变化,未观察到明显的细胞凋亡现象.与对照组比较,在人HUVEC细胞系的作用下,稳定转染的人A549细胞虽Bax的表达未发生变化,但P53表达明显增高,Bcl-2表达下调,并且呈现细胞凋亡现象.外源性VEGF能够增加Bcl-2的表达,并导致P53表达下调.结论：RNAi沉默肺癌细胞中VEGF的表达未影响肺癌细胞自身的变化,其对肺癌发展的抑制可能是通过抑制了血管内皮细胞上的VEGF/VEGFR通路,从而引起了肺癌细胞的凋亡.     

信号肽重组HBD2在人肺癌细胞中表达的初步研究

目的构建高表达人源化β-防御素2(HBD2)表达体系.方法构建人pLNCX2-CEA信号肽-HBD2(成熟肽)逆转录表达载体,DOTAP转染逆转录包装细胞,获得含融合基因的侵袭性逆转录病毒,再转染人肺癌A549细胞,用免疫印迹法鉴定转化细胞中HBD2蛋白的表达.结果成功构建了表达HBD2成熟肽的重组信号肽HBD2的人肺癌表达体系,经Western Blot检测,证实有目的基因表达.结论构建的人肺癌表达体系具有高表达HBD2的功能.     

反义端粒酶RNA对肺癌细胞A549抑制作用研究

目的 探讨反义人端粒酶RNA(human telomeric,RNA,hTR)对肺癌细胞A549端粒酶活性和细胞增殖的抑制作用，研究以端粒酶为靶的肺癌基因治疗的可能性。方法 将端粒酶hTR的cDNA反向插入到逆转录病毒载体pLXRN中，转染包装细胞PT67后获得反义hTR重组病毒，感染肺癌细胞A549。处理前后采用TRAP法检测端粒酶活性，光镜观察细胞形态，DNA电泳观察凋亡情况。结果 作用后端粒酶活性和细胞增殖受到明显抑制，并出现明显的细胞凋亡。结论 反义hTR 对肺癌细胞A549端粒酶活性具有明显的抑制作用，使肺癌细胞A549生长抑制，促进细胞凋亡。     

hnRNPB_1基因的RNA干扰抑制肺癌细胞A549增殖研究

目的 探讨特异性小分子干扰(small interference,siRNA)抑制肺癌A549细胞核内不均一核糖蛋白B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNPB1)基因的表达后,对A549细胞增殖的影响. 方法构建hnRNPB1特异性的siRNA真核细胞表达载体并转染人肺癌细胞株A549,观察重组载体分别在第1、4及6周对A549细胞hnRNPB1基因的干扰效果以及对肺癌细胞周期及凋亡的影响.结果 特异性siRNA真核表达可显著抑制肺癌细胞hnRNPB1基因的表达,使hnRNPB1 mRNA的表达减少46%～73%,蛋白表达减少77.69%～83.04%,作用时间至少可维持克隆形成后4周,同时,hnRNPB1基因表达下调抑制了A549细胞在体外的增殖,促进了肺癌细胞的凋亡.结论 特异性siRNA能特异、高效地抑制肺癌细胞株A549细胞hnRNPB1基因的表达,RNAi可能为肺癌的基因治疗提供新策略.     

HSV1—TK逆转录病毒载体构建及表达

目的 构建含TK基因逆转录病毒载体并检测其在转染细胞中的表达，为肺癌基因治疗积累实验资料。方法 从PHSV106质粒中切下约2．4kbTK基因片段，插入逆转录病毒载体PLXSN多克隆位点，酶切筛选正、反向连接质粒。正向连接子电穿孔法转化肺癌细胞A549，用PCR、细胞原位杂交法分别检测TK基因整合和表达。结果 经酶切鉴定得到正向连接子、电穿孔法转导A549细胞，经G418筛选出了转基因细胞，TK基因已整合在转染细胞中并阳性表达。结论 成功构建了TK基因逆转录病毒载体，转导该载体的肺癌细胞可表达TK基因。     

反义核酸抑制RON基因表达对A549的体外作用

目的探讨针对人RON基因跨膜区段(RONm)反义核酸对肺癌细胞系A549活性和细胞增殖的抑制作用,研究以RONm为靶的肺癌基因治疗的可能性?方法将人RONm cDNA反向插入到真核表达载体pcDNA3.1中,转染肺癌细胞A549,利用ELISA检测细胞模型RON基因表达水平,同时利用MTT和细胞计数方法监测细胞生物学活性的变化.结果转染后的肺癌细胞RON基因表达量和细胞活性明显降低,并出现明显的细胞凋亡?结论RONm反义核酸明显抑制RON基因的表达,同时对肺癌细胞的生长有抑制作用,促进细胞凋亡?     

核苷酸切除修复基因XPD反义RNA表达载体的构建及功能研究

目的 构建核苷酸切除修复基因XPD反义RNA表达载体，初步探讨其对肺癌细胞DNA损伤修复能力及药物敏感性的影响。方法 通过RT-PCR技术获取XPD cDNA(2-667bp)片段并反向插入真核7表达载体反义载体pcDNA3．1，采用脂质体法将构建的载体质粒转染肺癌细胞株A549，经G418筛选，采用抗肿瘤药物阿霉素、顺铂对细胞进行染毒干预，干预结果采用SCGE和MTT综合判定。结果 转染细胞XPD mRNA表达受到抑制。单细胞凝胶电泳显示转染细胞DNA损伤修复能力降低。MTT法显示转染细胞药物敏感性增高。结论 XPD反义RNA能降低肺癌细胞DNA损伤修复能力，其为核苷酸切除修复功能的研究提供了一个新的方式。     

抑癌基因ING2真核表达质粒的建立及其对肺癌细胞生长的影响

目的 构建抑癌基因生长抑制因子2(ING2)真核表达载体,研究p33ING2对人肺腺癌细胞A549及人小细胞肺癌细胞NCI-H446体外生长的影响.方法 构建ING2基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-ING2,采用脂质体法分别转染A549和NCI-H446细胞,以未转染组和转染pcDNA3.1(+)空质粒组作为对照,应用RT-PCR、细胞免疫组化和Western blot法分析目的基因及其蛋白表达,CCK8试剂盒分析其对细胞生长的影响,Annexin V-FITC和PI双染流式细胞术观察细胞凋亡的情况.结果 成功构建了重组真核表达载体pcDNA3.1(+)- ING2,转染后细胞株高水平表达ING2 mRNA及p33ING2蛋白.CCK8法检测结果显示:转染pcDNA3.1(+)-ING2的A549细胞和NCI-H446细胞增殖受到抑制,抑制率与pcDNA3.1(+)空质粒转染组比较,差异有统计学意义(P<0.01).流式细胞术凋亡检测结果显示:转染pcDNA3.1(+)-ING2的A549细胞和NCI-H446细胞组凋亡率均高于未转染组和pcDNA3.1(+)空质粒转染组,差异均有统计学意义(P<0.01).结论 ING2蛋白表达能抑制人肺腺癌细胞A549和人小细胞肺癌细胞NCI-H446增殖及增加细胞凋亡率.     

BTG2基因重组慢病毒载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达与功能

目的 构建重组慢病毒载体pCDH-BTG2,并检测其转染肺癌A549细胞后的表达与功能. 方法 通过PCR技术以含B细胞转位基因(BTG2)的cDNA克隆质粒(HsCD00330081)为模板获得BTG2基因片段,将此片段克隆至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro,形成pCDH-BTG2,转染PC3细胞检测BTG2的表达;将重组慢病毒载体质粒pCDH-BTG2包装成重组慢病毒颗粒,感染肺癌A549细胞后,通过蛋白免疫印迹法检测BTG2的表达,细胞计数法检测BTG2对A549细胞生长的影响. 结果 pCDH-BTG2重组质粒构建成功,转染PC3细胞后可检测BTG2蛋白的表达,pCDH-BTG2包装成慢病毒感染A549细胞后,显著抑制A549细胞的生长. 结论 成功构建了重组慢病毒载体pCDH-BTG2,并发现BTG2抑制A549细胞的生长,为研究BTG2的功能奠定了基础,同时为肺癌的药物研究提供了靶点.     

表达反义N-myc逆转录病毒载体对神经生长因子诱导神经母细胞瘤细胞分化的影响

目的研究反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染后人神经母细胞瘤细胞在神经生长因子处理后的诱导分化情况,探讨Ｎ－ｍｙｃ在神经生长因子诱导分化中的意义。方法用基因重组技术构建表达反义Ｎ－ｍｙｃ的逆转录病毒载体。用ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍＲｅａｇｅｎｔ等多种基因转染方法,转染已经基因转染恢复了神经生长因子受体表达的人神经母细胞瘤系,建成表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系。用神经生长因子处理转化细胞系,观察ＮＧＦ是否能诱导分化。同时用ＴＵＮＥＬ原位凋亡检测技术及超微结构技术研究表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系凋亡的情况。结果表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系经单链ＲＮＡ探针杂交,证实其Ｎ－ｍｙｃ的表达明显降低。用神经生长因子处理这些转化细胞系,细胞出现明显的形态学分化。ＴＵＮＥＬ技术及超微结构研究表明,经反义Ｎ－ｍｙｃ转染的细胞系细胞凋亡增多。结论反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染能有效抑制Ｎ－ｍｙｃ的表达,进而促进神经生长因子诱导人神经母细胞瘤细胞的分化。反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染能使神经母细胞瘤细胞凋亡增多。     

表达反义N—myc逆转录病毒载体对神经生长因子诱导神经母？…

目的 研究反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染后人神经母细胞瘤细胞在神经生长因子处理后的诱导分化情况,探讨Ｎ－ｍｙｃ在神经生长因子诱导分化中的意义。方法 用基因重组技术构建表达反义Ｎ－ｍｙｃ的逆转录病毒载体。用Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ Ｒｅａｇｅｎｔ等多种基因转染方法,转染已经基因转染恢复了神经生长因子受体表达的人神经母细胞瘤系,建成表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系。用神经生长因子处理转化细胞系,观察ＮＧＦ是否能诱     

Influence of recombinant retroviral vector expressing antisense TGFα on malignant phenotype of human pancreatic carcinoma cell line

ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｅｘｐｒｅｓｉｎｇａｎｔｉｓｅｎｓｅＴＧＦαｏｎｍａｌｉｇｎａｎｔｐｈｅｎｏｔｙｐｅｏｆｈｕｍａｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｉｎｅＸｕＹａ许雅，ＬｉｕＴｏ...     

Influence of recombinant retroviral vector expressing antisense TGF alpha on malignant phenotype of human pancreatic carcinoma cell line.

OBJECTIVE To observe the effects of antisense TGF alpha on the growth of human pancreatic carcinoma cell line cells.

METHODS A recombinant retroviral vector expressing antisense TGF alpha was constructed, and transfected the ecotropic packaging cell line psi-2 with lipofectin. After the amphotropic packaging cell line PA317 was transfected with the virus supernatant of psi-2, the replication-defective, amphotropic retroviral supernatant was used to infect human pancreatic carcinoma cell line PC-7. Following puromycin selection, puromycin-resistant colonies were pooled and expanded to a cell line PC-7/AS-TGF alpha.

RESULTS The retroviral integration in the genomes of psi-2, PA317 and transformant PC-7 cells was confirmed by Southern blot hybridization. Northern blot hybridization showed a down regulation of endogenous TGF alpha in PC-7/AS-TGF alpha cell line. The high levels of growth inhibition and reduction of 3H-TdR incorporation in PC-7/AS-TGF alpha were evident. Also, the soft agar colony-formation and tumorigenicity in nude mice were significantly suppressed by antisense TGF alpha.

CONCLUSIONS The antisense TGF alpha expressing vector can block the target gene expression, suppress the cell growth and partially reverse the malignant phenotype of pancreatic carcinoma cells.

     

反义基因转移表达及抗乙型肝炎病毒的作用

目的观察重组逆转录病毒载体－包装细胞系统介导反义基因转移表达和抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用。方法将ＨＢＶａｙｗ１４０２－２９０６片段和２８３９－１９８６片段反向插入重组逆转录病毒载体质粒，分别转染ＰＡ３１７包装细胞，分别感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞和２．２．１５细胞。结果转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。ＨＢＶ反义基因重组逆转录病毒感染２．２．１５细胞后第３天，表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）表达量减少，感染后第５天，ＨＢＶ抗原表达抑制率达高峰。ｐｒｅＳ／Ｓ片段反义基因转移后，ＨＢｓＡｇ表达抑制率为７１％，ＨＢｅＡｇ抑制率为２３％；ｐｒｅＣ／Ｃ片段反义基因转移后，ＨＢ－ｓＡｇ表达抑制率为２３％，ＨＢｅＡｇ抑制率为５９％。结论逆转录病毒载体－包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞内转移和表达，并对ＨＢＶ复制和表达均有抑制作用。     

抑制人喉癌细胞生长的p53基因反转录病毒重组体的构建

野生型ｐ５３基因在细胞增殖与分化的调控过程中起着重要作用。已有研究表明，人喉癌中存在ｐ５３基因的结构异常或表达异常。本实验根据这一特点，设计出能整合在人喉癌细胞染色体上并适宜表达的野生型ｐ５３基因反转录病毒重组体Ｐｃ５３Ｎ２Ａ。通过体外实验证明，这一重组体能够以基因替代的方式，恢复ｐ５３基因的功能，抑制人喉癌细胞的生长。     

雄激素受体反义RNA对前列腺癌细胞雄激素受体表达的抑制作用研究

目的 观测雄激素受体（AR）反义RNA逆转录病毒表达载体在前列腺癌细胞中的表达及其对AR表达的影响。方法 将AR反义RNA逆转录病毒表达载体导入前列腺癌细胞株LNCaP，PCR检测AR目的片段在重组LNCaP细胞基因组中的存在，RT－PCR检测AR反义RNA表达和AR mRNA水平，Western blot检测AR蛋白表达水平。结果 PCR在LNCaP^as-AR基因组DNA中扩增出了AR目的片段，表明AR目的片段整合到了细胞基因组。RT－PCR证实LNCaP^as-AR有AR反义RNA表达，且其AR mRNA水平较LNCaP和空载体转染的LNCaP^Neo显著下调（P＜0.05)，Western blot证实LNCaP^as-AR细胞AR蛋白含量显著下降（P＜0.05)。结论 AR反义RNA可抑制前列腺癌细胞AR表达。     

双靶区反义RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的 探讨表达乙型肝炎病毒（HBV）双靶区反义RNA的逆转录病毒载体对HBV复制和表达的影响。方法 用分子克隆法构建表达HBVX、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒,转染PA317细胞,用NIH3T3细胞扩增法检测假病毒颗粒滴度,以假病毒颗粒感染2.2.15细胞,用酶标法检测其上清HBsAg和HBeAg,并以荧光聚合酶链反应定量方法检测2.2.15细胞内DNA和RNA含量。结果 HBVX、P双靶区反义RNA抗HBV的作用较单靶区反义RNA更明显,且对HBVS、C、P三个开放读码区的DNA和RNA抑制作用大,正义RNA无明显抑制作用。结论 细胞内表达HBV反义RNA具有明显抗HBV复制和表达的作用。双靶区反义RNA作用更明显。