活性纳米羟基磷灰石复合胶原/聚乳酸材料修复颅骨极限缺损的实验研究

目的检测重组人骨形成蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein2,rhBMP-2)与纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nano-hydroxyapatite/collagen/polylactic acid,nHAC/PLA)复合后形成的活性nHAC/PLA(active nHAC/PLA,AnHAC/PLA)修复颅骨极限缺损的效果。方法新西兰大白兔48只,体重2.0～2.5kg。制备直径为15mm的颅骨全层缺损模型,随机分成4组,每组12只。阳性对照组:缺损区植入自体髂骨;空白对照组:缺损区不植入任何材料;阴性对照组:缺损区植入nHAC/PLA;实验组:缺损区植入AnHAC/PLA,每块AnHAC/PLA上平均吸附rhBMP-21.431mg。术后8、16周通过比较颅骨缺损区X线阻射面积占总缺损面积百分比、HE染色和Masson's三色法染色观察颅骨极限缺损的修复情况。结果术后8、16周,各组颅骨缺损区X线阻射程度,阳性对照组分别为67.21%±2.06%、86.48%±1.73%,空白对照组分别为5.84%±1.92%、9.48%±2.72%,阴性对照组分别为19.13%±2.51%、35.67%±3.28%,实验组分别为58.84%±2.55%、85.61%±3.36%。其中除16周实验组与阳性对照组以及空白对照组8、16周比较差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各组各时间点比较差异均有统计学意义(P<0.05)。组织学观察显示,阳性对照组骨缺损区16周骨小梁较8周增宽,被大量骨组织充填;空白对照组8、16周骨缺损区均被纤维组织充填,无新骨生成;阴性对照16周骨缺损区为剩余材料与纤维组织充填,周边新骨较8周形成增多;实验组8周材料植入区为新生骨替代,16周新生骨呈板层状,缺损区材料残留较少,且周围可见较多成骨细胞。结论nHAC/PLA是rhBMP-2的良好载体,两者复合后制备的AnHAC/PLA具有良好骨形成能力,有望应用于临床上修复较大型骨缺损。     

局部植入辛伐他汀诱导自体骨髓间充质干细胞归巢修复大鼠颅骨缺损

目的探讨局部植入辛伐他汀修复大鼠颅骨极限骨缺损的机制,即诱导自体骨髓间充质干细胞（BMSC）归巢。方法辛伐他汀5mg加聚乳酸20mg或单纯聚乳酸20mg分别溶解于200μl丙酮,制备辛伐他汀聚乳酸复合材料或单纯聚乳酸材料。16只SD大鼠尾静脉注射绿色荧光蛋白（GFP）标记的BMSC（GFP-BMSC）作为示踪细胞,48h后制作大鼠颅骨极限缺损模型,并植入辛伐他汀-聚乳酸复合材料（n=8）和单纯聚乳酸材料（n=8）进行修复。2周后经小动物活体荧光成像系统检测缺损处绿色荧光信号,冰冻切片荧光显微镜下观察辛伐他汀组（n=4）和对照组（n=4）缺损处GFP-BMSC归巢。颅骨脱钙后经免疫组化染色检测辛伐他汀组（n=4）和对照组（n=4）缺损处骨形态发生蛋白-2（BMP-2）表达。结果小动物活体荧光成像系统检测显示,辛伐他汀组缺损处有较强的绿色荧光信号,对照组缺损处绿色荧光信号较弱;冰冻切片荧光显微镜下观察发现,辛伐他汀组缺损处较对照组缺损处GFP阳性细胞数量明显增加;免疫组化检测发现,辛伐他汀组BMP-2表达增加。结论局部植入辛伐他汀可诱导自体BMSC归巢至缺损部位并参与修复,其诱导归巢过程可能与BMP-2表达上调有关。     

纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合支架修复兔股骨髁临界性骨缺损的实验研究

目的 探讨纳米羟基磷灰石(nHA)/壳聚糖(CS)复合支架修复兔股骨髁临界性骨缺损的能力. 方法 取44只健康成年新两兰大白兔,于兔左侧股骨外侧髁建立临界性骨缺损(直径为6mm、深为10 mm)模型,随机分为3组:实验组(n=20):骨缺损处植入nHA/CS复合材料;对照组(n＝20):骨缺损处植入单纯CS;空白组(n=4):骨缺损处旷置,不植入任何材料.术后8、12周取材行大体观察、X线摄片、显微CT扫描及组织学观察,比较各组骨缺损的修复能力. 结果 术后12周X线片显示实验组骨缺损修复良好,骨皮质连续;对照组缺损区明显缩小,两断端不连接;空白组缺损区无明显骨痂生成.实验组和对照组Lane-Sandhu X射线评分平均分别为(10.18±0.98)、(8.90±0.99)分,两组比较差异有统计学意义(t=6.858,P=0.000).显微CT扫描显示:实验组骨缺损基本完全修复,股骨髁外形恢复正常;对照组骨缺损空腔大部分为新生骨组织填充,缺损区仍留有缺损;空白组骨缺损基本无修复.实验组和对照组CT值平均分别为(256.1±26.8)、(169.2±25.4)Hu,两组比较差异有统计学意义(t=4.711,P=0.003).术后12周组织学观察显示:实验组可见大量新生骨小梁,新生骨质与周围骨床之间无明显分界线;对照组可见骨缺损为剩余材料与纤维组织充填;空白组骨缺损区均被少量纤维组织充填. 结论 nHA/CS复合材料较单纯CS能更好地促进兔股骨髁临界性骨缺损的修复,是一种很有应用前景的组织工程修复材料.     

自体骨髓基质干细胞组织工程骨修复颅骨缺损的临床研究

目的探讨人骨髓基质干细胞(hBMSCs)作为种子细胞的组织工程骨修复外伤后颅骨缺损的可行性。方法自2006年6月至2007年2月,共4例外伤后颅骨缺损患者,抽取患者骨髓,分离得到hBMSCs,体外扩增和成骨诱导后,将hBMSCs与部分脱钙骨复合,体外共培养1周后,手术植入颅骨缺损区。分别于术后1周和3个月、6个月进行临床和三维CT检查随访。结果术后1周,三维CT均显示骨缺损区被所植入的组织工程骨充填;术后3～6个月,CT显示组织工程骨形成并修复骨缺损,新生骨与骨缺损断端融合。高龄患者及骨缺损面积过大患者,组织工程骨体内成活率较差。结论通过选择适宜的病例,以自体hBMSCs作为种子细胞,运用组织工程技术可以在人体内形成稳定的组织工程骨并可用于修复颅骨缺损。     

自体脂肪干细胞复合珊瑚修复犬颅骨标准缺损的初步研究

目的 应用自体脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)复合珊瑚构建组织工程化骨,修复犬颅骨标准缺损.方法 体外扩增培养、成骨诱导Beagle犬ADSCs,将第2代细胞接种在珊瑚支架上共同培养.制造实验犬双侧颅骨全层标准缺损(20 mm×20 mm),一侧以细胞材料复合物修复作为实验组(n=7),另一侧以单纯珊瑚材料修复作为对照组(n=7).术后24周分别通过影像学、大体形态观察、生物力学检测、组织学方法检测颅骨缺损的修复效果.结果 成骨诱导的犬ADSCs体外呈现成骨特性,在珊瑚支架上生长良好.3D-CT重建显示术后12周实验组有新生骨痂形成,对照组材料大部分降解;24周时实验组为骨性愈合,对照组为骨不连.24周时实验组缺损修复百分比为(84.19±6.45)%,显著高于对照组的(25.04 ±18.82)%(P<0.01).大体观察见实验组由新生骨痂修复缺损,对照组缺损边缘可见少量骨痂形成,主要为软组织充填;24周生物力学检测修复组织能耐受的最大压力载荷,实验组为(73.45±17.26)N,为犬顶骨最大压力负荷(104.27±22.71)N的70%,两者比较差异有统计学意义(P<0.01),对照组为软组织无法完成上述检测.HE染色见实验组有较多成熟骨呈骨性愈合,对照组为纤维性愈合.结论 自体成骨诱导的ADSCs复合珊瑚形成的组织工程化骨可修复犬颅骨标准缺损.     

利用可生物降解共聚膜引导骨再生

目的　采用生物降解可吸收材料聚己内酯（ Ｐ Ｃ Ｌ）和聚乳酸（ Ｐ Ｌ Ａ）共聚膜修复长骨节段性骨缺损,探讨其引导性骨再生的效果及机制。方法　采用兔桡骨中段１２ ｃｍ 节段性骨缺损（保留骨膜）动物模型２４ 只,平均分成两组,实验组用膜包绕骨缺损区,对照组缺损区不处置,分别于术后３、６ 及１２ 周处死动物,进行 Ｘ 线片、大体及组织学观察。结果　实验组缺损区骨生长明显优于对照组,术后 ３ 周实验组可见明显的骨痂沿膜外生长;术后 ６ 周以桥接的外骨痂形成骨性连接;术后１２ 周膜内外均形成骨性连接,对照组从术后６ 周开始表现为骨不连。结论　利用可生物降解的膜性材料可引导骨组织再生,通过膜外骨痂以及形成相对迟缓的膜内骨痂共同完成骨缺损的修复;膜性材料通过屏障作用一方面有效地阻挡纤维组织长入缺损区,防止骨不连形成,另一方面在局部形成营养物质浓聚,并通过表面的微孔为骨细胞生长充当支架,促进骨缺损愈合。     

一种新型注射型骨修复材料对犬桡骨骨缺损修复的实验研究

目的 探讨以纤维蛋白胶(fibrin sealant,FS)为载体复合牛骨形态发生蛋白(bBMP)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的注射型骨修复材料修复犬桡骨节段性缺损的效果. 方法 12只家犬随机分为实验组和对照组,每组6只.12只成年健康家犬右侧桡骨中上段造成2.0 cm缺损,制成犬桡骨2.0 cm骨缺损实验模型,然后严密缝合皮下组织及皮肤.对照组和实验组分别经切口周围正常皮肤注射FS和FS bFGF bBMP到骨缺损处,术后4、8、16、24周进行放射学检查,术后24周取标本进行组织学和骨密度检查,研究其成骨效应. 结果 ①影像学:实验组术后4周缺损区有密度较低的骨痂形成;术后24周,皮质完全连接,髓腔再通.对照组术后24周内缺损区均无骨痂生长,骨缺损未得到修复.②骨密度测定:术后24周时实验组的骨密度(456.33±13.74)mg/cm2显著高于健侧(433.33±6.77)mg/cm2(t=2.57,P=0.00)及对照组(0mg/cm2)的骨密度.③组织形态学:术后24周实验组新生皮质骨十分致密,骨皮质连接完整,髓腔完全再通;对照组无新生骨形成,缺损处完全为结缔组织修复. 结论 以FS为载体复合bBMP和bFGF的注射型骨修复材料具有高效的骨修复能力,对家犬的骨缺损有良好的修复效果.     

富血小板血浆复合骨髓基质细胞修复兔颅骨缺损的实验研究

目的 研究利用富血小板血浆(PRP)复合骨髓基质细胞(BMSCs)修复兔颅骨缺损,评价其作为骨组织工程支架的可行性.方法 经穿刺抽吸兔骨髓,培养BMSCs,离心制备PRP.利用10只新西兰大白兔制作直径5mm、每只兔4个全层颅骨缺损.收集原代培养的BMSCs接种于PRP或全血中.用小牛凝血酶激活接种后的复合物及PRP,而后分别植入颅骨缺损区,余下的骨缺损区作为空白对照.术后8周检查缺损区骨修复并利用X线分析成骨情况.结果 在PRP/BMSCs材料植入8周后,缺损区有大量的新骨生成,而以PRP 修复的缺损区有较少的新骨形成.与此相反,在空白对照组及blood/BMSCs植入的缺损区未见新骨形成.结论 PRP/BMSCs复合物可成功修复兔颅骨缺损,表明PRP 能够作为骨组织工程的支架.     

以异种脱蛋白型松质骨为支架构建组织工程骨修复骨缺损实验研究

目的:探讨以异种脱蛋白型松质骨为支架接种成骨细胞悬液构建的组织工程骨对骨缺损修复的能力。方法:以28天胎兔颅骨为骨源,用酶消化法分离成骨细胞,在体外培养、增殖后,取第三代成骨细胞制成细胞悬液,以5 × 106mL-1浓度接种于异种脱蛋白型松质骨中,体外培养一周,然后用此复合物修复兔颅骨缺损1,5cm × 1.5cm,本组作为实验组(共10只)。对照组I(共10只),仅用异种脱蛋白型松质骨修复兔颅骨缺损。对照组Ⅱ(共10只),缺损区注射相同浓度的成骨细胞悬液。对照组Ⅲ(共10只)为空白对照。术后4、8周从X片上观察对X-Ray阻射情况。8周取材,进行大体标本、扫描电镜及组织学评价。结果:实验组:4、8周X摄片均显示骨缺损周围有骨小梁通过,支架上有钙化阴影并随时间延长密度增高。术后8周,大体标本观察:缺损周围与正常骨组织之间无分界线,植入物硬度接近于正常骨组织,扫描电镜观察:支架上有胶原纤维及成骨细胞附着,组织学分析:支架上有大量新骨形成,支架有部分被降解吸收,四环素荧光标记证实在支架上有新生骨。所有对照组均无新生骨,仅见缺损区有纤维样组织覆盖。结论:以异种脱蛋白型松质骨为支架构建的组织工程骨可以用来修复骨缺损。     

组织工程方法修复羊腭裂骨缺损的实验研究

目的 观察应用自体骨髓基质干细胞(BMSCs)复合珊瑚修复山羊全长腭裂骨缺损的效果.方法 体外成骨诱导山羊BMSCs复合珊瑚修复山羊全长腭裂骨缺损,以单纯珊瑚植入缺损作为对照组.于术后2、12、24、32周行头颅CT扫描并三维重建,术后24、32周行大体取材、苦味酸-品红染色和Micro-CT骨密度分析.结果 成骨诱导BMSCs在珊瑚支架生长良好.三维CT显示早期实验组骨痂较多,对照组可见珊瑚明显降解,术后24、32周腭裂骨缺损被修复,修复比例分别达(88.52±10.95)％、(90.52 ±8.12)％,组织学显示实验组有大量成熟骨,骨基质和胶原形成良好,对照组缺损不能愈合(P＜0.05),Micro-CT显示新生骨密度(759.48± 96.45 )mg HA/cm3、( 823.93±112.07) mg HA/cm3,接近正常骨(P＞0.05).结论 山羊BMSCs成骨诱导后与珊瑚复合能修复完全性腭裂骨缺损,组织工程技术可用于修复腭裂骨缺损.     

辛伐他汀对骨髓源性内皮祖细胞动员及迁移的影响

目的研究辛伐他汀对兔内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）迁移、动员的影响。方法将2只兔从髂骨抽取骨髓,采用贴壁法,在条件培养基M199中培养EPCs,并用免疫荧光法鉴定CD34、CD133、VEGFR-2。经鉴定的EPCs,在不同浓度辛伐他汀（分别为0.01,0.1,1.0μmol/L）作用下,Transwell实验观察辛伐他汀对EPCs迁移的影响。6只兔随机分为实验组和对照组,每组3只。6只兔颅骨造极限骨缺损模型,实验组和对照组在颅骨缺损处分别植入辛伐他汀复合聚乳酸薄饼或聚乳酸薄饼,术后10天,取外周血,流式细胞仪检测CD34/CD133双阳性细胞表达率,观察辛伐他汀对EPCs动员的效果。结果Transwell实验,辛伐他汀作用于EPCs16小时,0.1μmol/L和1.0μmol/L辛伐他汀组细胞迁移数量OD值（0.097±0.011,0.099±0.019）较0.01μmol/L辛伐他汀组（0.075±0.013）与对照组（0.077±0.014）多,差异有显著性（P〈0.05）。造模术后10天,辛伐他汀组3只兔外周血中CD34^＋/CD133^＋细胞表达率为0.28%,0.84%,0.28%,对照组为0.26%,0.11%,0.09%。结论辛伐他汀可动员EPCs到外周血,可提高骨髓源性EPCs的迁移能力。     

骨髓基质成骨细胞-松质骨基质复合人工骨修复颅骨缺损的实验研究

目的 观察松质骨基质－骨髓基质成骨细胞复合工人骨在骨缺损区的成骨作用，探索该组织工程化人工骨修复颅骨缺损的可行性。方法 成年新西兰兔骨髓细胞体外培养、诱导后，接种于藻酸盐－松质骨基质中，形成松质骨基质－藻酸盐－骨髓基质成骨细胞复合人工骨，修复自体颅骨缺损。分别植入松质骨基质和骨髓基质成骨细胞作为对照。植入4周和8周后行X线摄片和组织学检查，观察骨形成情况。结果 复合人工成骨量优于单纯植入松质骨基持或骨髓基质成骨细胞组，并明显优于空白对照。结论 松质骨基质－骨髓基质成骨细胞复合人工骨髓修复颅骨缺损效果良好，可以作为临床大型骨缺损修复的途径之一。     

hVEGF基因修饰的组织工程化复合物修复牙周组织缺损的实验研究

目的探讨hVEGF165基因修饰的BMSCs在SD大鼠急性牙周缺损模型中对牙周组织再生的作用。方法人工构建SD大鼠急性牙周缺损模型。设以下6组(36只SD大鼠,n=6):空白对照(A组);单纯e-PTFE膜(B组);BME+e-PTFE膜(C组);BMSCs+BME+e-PTFE膜(D组);空转BMSCs+BME+e-PTFE膜(E组);hVEGF165基因修饰的BMSCs+BME+e-PTFE膜(F组)。分别将转染hVEGF165基因的BMSCs与未转染的BMSCs接种于胶原膜BME-10X后,按各分组植入人工牙周缺损内,并以空白胶原膜和空载体为对照。4周后取材作病理切片,HE染色观察牙周组织再生情况,测量新生牙槽骨面积、新生牙骨质面积以及新生牙周膜宽度,结果进行统计学分析。结果各组均可见不同程度的牙周组织再生,A组、B组和C组三组新生牙槽骨面积(NB)、新生牙骨质面积(NC)和新生牙周膜宽度(NP)均无明显差别(P>0.05);与A组相比,D组、E组、F组的NB、NC均有显著增加(P<0.05);与E组相比,转染有hVEGF165基因组(F组)的NB、NC和NP均有显著增加(P<0.05)。结论 hVEGF165基因转染BMSCs与胶原膜复合物可促进大鼠牙周组织再生。     

新型骨组织工程β-TCP／CPPF／PLLA支架复合BMSCs修复节段性骨缺损的影像学研究

目的：将自体骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）接种到β-TCP／CPPF／PLLA支架上,进行体外复合培养,构建组织工程人工骨,植入兔桡骨大段骨缺损模型中,评估BMSCs／β-TCP／CPPF／PLLA复合体促进成骨的作用。方法：用新西兰大白兔40只,随机分为BMSCs／β-TCP／CPPF,PLL复合物组（A组）、β-TCP／CPPF／PLLA支架组（B组）、空白对照组（C组）共三组,建立兔桡骨双侧大段骨缺损模型,相应植入自体细胞材料复合物和单纯支架材料,空白对照组不作任何处理。术后4、8、12、16周处死动物,摄X线片观察骨缺损修复情况。结果：X线检查结果：A组术后2周可见缺损处有散在的、少量的模糊状骨痂生成,术后4周可见明显的骨生成影像,成云雾状,均匀分布在骨缺损区,术后8周整个缺损区均可见到骨痂生成,成骨现象较4周更加明显,部分髓腔已通,术后12～16周,缺损区已完全为新生的骨组织充填,骨髓腔已完全再通,修复区比正常的桡骨较细。B组、C组术后2～16周,虽有不同程度的成骨现象,但没有完全修复骨缺损区,B组较C组修复明显。X线评分结果：A组在各时期均明显高于B组,差异具有显著性（P〈0．01）。结论：自体BMSCs与β-TCP／CPPF／PLLA复合物移植能修复大节段的骨干缺损。     

兔骨髓间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石/左旋聚乳酸修复兔软骨缺损的实验研究

目的评价兔骨髓间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石/左旋聚乳酸(Nano-HA/PLLA)修复兔膝关节全层软骨缺损的效果。方法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs),取第3代将其与Nano-HA/PLLA在体外构建组织工程软骨(tissue engineering cartilage,TEC)。将18只新西兰大白兔股骨内髁关节面造一直径4.5 mm、深度5 mm的软骨缺损模型,随机分成3组,即实验组、支架组和空白对照组,每组6只,分别予复合细胞的Nano-HA/PLLA、Nano-HA/PLLA及空白填充。术后12、24周取材行大体标本、组织学、免疫组织化学观察及Wakitani组织学评分。结果实验组显示缺损有骨软骨组织形成,软骨下骨基本达到生理整合,组织学及免疫组化显示有大量细胞外基质形成;支架组及对照组显示出有限的再生重建。以上三组12周Wakitani组织学评分分别为5.5±1.401,9.3±1.304和10.2±1.052,24周时为2.2±0.837,7.4±1.144和8.2±1.225,两个时间点实验组均优于支架组及空白组,差异有统计学意义(P<0.05);且实验组24周时优于12周(P<0.05)。结论复合骨髓间充质干细胞的多孔Nano-HA/PLLA能提高成年兔膝关节承重部的骨软骨缺损的修复。     

脱蛋白骨复合牛骨形态发生蛋白（BMP）对前交叉韧带重建术后骨隧道扩大的影响

目的探讨兔异体脱蛋白松质骨（deproteined bone,DPB）复合骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）对前交叉韧带重建术后骨隧道扩大的影响。方法取96只成年新西兰大白兔用自体半腱肌腱进行膝关节前交叉韧带重建,共分4组,DPB＋BMP组在股骨隧道内植入DPB-BMP复合体,DPB组和BMP组分别在股骨隧道内植入DPB、BMP,空白对照组的股骨隧道内不植入任何材料。于术后4、8、12、16周时分别处死各组中的6只动物,切取标本,测量股骨隧道的宽度,计算隧道扩大率。结果术后4周时,DPB＋BMP组、DPB组、BMP组及空白对照组的骨隧道扩大率分别为（23.52±0.43）%、（34.83±0.52）%、（51.57±0.76）%、（56.90±0.81）%,术后8周为（22.21±0.34）%、（35.35±0.46）%、（60.97±0.63）%、（67.18±0.70）%,术后12周为（21.94±0.37）%、（33.01±0.41）%、（50.56±0.54）%、（54.61±0.55）%,术后16周为（20.96±0.35）%、（32.11±0.50）%、（49.29±0.66）%、（53.31±0.59）%,各时点骨隧道扩大率DPB＋BMP组〈DPB组〈BMP组〈空白对照组，差异均有显著性（P〈0．05）。结论脱蛋白骨复合BMP能减轻前交叉韧带重建术后的骨隧道扩大程度。     

硫酸钙骨水泥修复骨质疏松大鼠骨缺损的研究

目的观察硫酸钙骨水泥对骨质疏松大鼠干骺端骨缺损修复的影响。方法使用卵巢切除大鼠股骨干骺端骨缺损模型,一侧填充硫酸钙骨水泥,对侧空白对照。在0、1、3、6和9周时,分别处死8只大鼠进行组织学及组织形态学分析。两组间数据采用配对t检验比较。结果骨组织形态学计量数据表明,3、6、9周时,实验组骨缺损中的新骨形成数据,包括类骨质表面、骨缺损中新骨体积均明显多于对照组。6、9周时,实验组骨矿化沉积率显著高于对照组。硫酸钙骨水泥在9周时完全被吸收,新骨随之逐渐长入,对照组中骨缺损部位被大量纤维组织占据。结论实验结果表明硫酸钙骨水泥具有促进新骨生成的作用,能有效修复骨质疏松状态下的骨缺损。